Arch. Microbiol. 106, 267-269 (1975) - 9 by Springer-Verlag 1975

Fermentativer Abbau von 2-14C-Mannose durch Leuconostoc mesenteroides ERNST ZIEGLER und JOHANNA DAHMEN Institut fiir Physikalische Biologie der Rheinisch-WestFfilischen Technischen Hochschule, Aachen Eingegangen am 18. August 1975 Fermentative Degradation of 2-14C-Mannose with Leuconostoc mesenteroides Abstract. Mannose-2-14C has been fermented by Leuconostoc mesenteroides. C Q , ethanol and o-lactic acid were formed in a molar ratio of 1 : 1 : 1. A small amount of acetic acid was found as by-product. It could easily be isolated from the main products of the fermentation and it did not disturb further degradation procedures. The methyl-C-atom of ethanol, which was derived from C-2 of the mannose, had nearly the same specific radioactivity as mannose-2-14C. All other C-atoms of the degradation products were only very slightly labeled. Their content of radioactivity was in any case lower than 3 ~ of the specific radioactivity of the degraded mannose. This procedure is applicable for the degradation of 14C-labeled mannose.

Zusammenfassung. Mannose-2-~4C wurde mit Leuconostoc mesenteroides fermentativ gespalten. CO2, ~.thanol und D-Milchsfiure wurden im molaren Verhfiltnis 1 : 1 : 1 gebildet. Als Nebenprodukt fanden wir eine geringe Menge Essigs/iure. Diese konnte von den Hauptprodukten der Fermentation leicht abgetrennt werden und st6rte daher deren weitere Degradation nicht. Das Methyl-C-Atom des Athanols, das vom C-2 der Mannose stammt, hatte nahezu die gleiche spezifische Radioaktivit~it wie die Mannose. Alle fibrigen C-Atome der Abbauprodukte waren nur sehr schwach markiert. Ihr Radioaktivit/itsgehalt lag in jedem Fall unterhalb 3 ~ der spezifischen Radioaktivit/it der eingesetzten Mannose. Dieses Verfahren eignet sich daher zur spezifischen Degradation 14C-markierter Mannose.

Key words: Fermentative degradation - Mannose-2-~4C - Leuconostoc mesenteroides.

Die Degradation von Hexosen nach rein chemischen Verfahren (Simon u. Steffens, 1962; Jones u. Stoodley, 1963; Heath u. Roseman, 1963) erfordert relativ viel Arbeitsaufwand und Geschick in pr/iparativ chemischen Arbeiten. Dies vor allem dann, wenn der Radioaktivit/itsgehalt aller C-Atome einzeln und direkt bestimmt werden soll. Letzteres ist fiberhaupt nur b e i wenigen dieser Methoden m6glich, h/iufig m u g man Differenzbestimmungen zu Hilfe nehmen. Es ist auch nicht in allen F/illen sicher, ob die meist an Glucose erprobten Methoden auch beim A b b a u von Mannose zum gleichen Erfolg ffihren. Wir haben daher fiberprfift, ob das elegante und einfache Verfahren der Fermentation von Glucose durch Leuconostoc mesenteroides (De Moss et al., 1951 ; Gunsalus u. Gibbs, 1952; Bernstein et al., 1955), das sich z.B. auch zum A b b a u von Galaktose eignet (Schambye et al., 1957; Gibbs et al., 1963), zur Degradation von Mannose verwendet werden kann.

Material und Methoden

D-Mannose-2-14C (spez. Akt.: 1,81 mCi/mMol) von NENChemicals GmbH, Dreieichenhain, wurde mit inaktiver D-Mannose (Merck, Darmstadt) verdfinnt. Pro Abbau wurden

zwischen 0,3 und 0,7 mMol dieser verdfinnten Mannose-2-14C (spez. Akt. : 0 , 5 - 8 pCi/mMol)eingesetzt. Leuconostoc mesenteroides, Stamm-Nr. SMG 284 (Sammlung ffir Mikroorganismen, G6ttingen), wurde wie folgt an Mannose adaptiert: Trockenkeime wurden auf je 30 ml Anzuchtmedium nach De Man et al. (1960) (Simon u. Floss, 1967), das 1 ~ Glucose enthielt, so lange bei 30~ vorkultiviert, his sie innerhalb 12 Std gut anwuchsen (Gasentwicklung bei Schfitteln). Dann wurde die Glucose im Medium durch Mannose ersetzt und die Bakterien in einer Reihe weiterer Vorkulturen auf Mannosemedium zu raschem Anwuchs herangezogen. Mit einer Mannosevorkultur (30 ml) wurde eine Mannosehauptkultur (500 ml) angeimpft und nach 12-16 Std zur Fermentation verwendet. Einmal an Mannose adaptierte L. mesenteroides lassen sich auf dem gleichen Mannosemedium, dem 1,5 ~ Agar zugesetzt werden, in Schr~igagarr6hrchen in Dauerkultur nehmen (4~C, alle 2 Monate fiberimpfen). Die Fermentation der Mannose und der weitere Abbau der Fermentationsprodukte wurde im Prinzip durchgeffihrt wie bei Gibbs et al. (1963) beschrieben. In folgenden Punkten verfuhren wir abweichend: a) Das CO2 aus C-1 der Mannose wurde w/ihrend der Fermentation mit CO2-freiem Stickstoff in ein Absorptionsgerbil3fiberffihrt, das 8 ml CO2-freie 0,5n NaOH enthielt, und aus dieser L6sung mit BaC12 als BaCO3 geffillt. b) Vor der Oxidation des )kthanols (aus C-2 und C-3 der Mannose) zu Essigs~ure wurde dessen spezifische Radioaktivitfit bestimmt. Die quantitative Athanolbestimmung erfolgte dabei nach Bernt u. Gutmann (1970). Die Essigsfiure wurde nach Phares (1951) degradiert.

268

Arch. Microbiol., Vol. 106, No. 3 (1975)

Tabelle 1. Ausbeuten und spezifische Radioaktivitfit der Degradationsprodukte aus Mannose-2-14C. Durchschnittswerte (n = 3) Produkt

Entspr. C-Atom der Mannose

Ausbeute mMol/100 mMol Mannose

Spez. Radioaktivitfit dpm/lxMol

~o der spez. Radioaktivitfit der Mannose-2-1*C

Mannose-2-14C

C-t-C-6

100

17600

100

CO2

C-1

Athanol CH3

80-93

12

C-2 }

I HOCH2 Milchsgure H O - C = O

C-4

I HO-C-H L

C-5

H3C

C-6

EssigsfiureHo_c=oCH31

16891 76-83

C-3

78-87

}

0,07

5-15

9 c) Neben CQ, Athanol und Milchs~iure entsteht beim Abbau von Mannose auch wenig Essigsfiure. Diese wurde zusammen mit der Milchs~iure aus dem Destillationsr/ickstand der Fermentationsl6sung mit Ather extrahiert. Durch Wasserdampfdestillation des Atherextraktes wurde sie schlieBlich vonder Milchs/iure getrennt. d) Bet der Fermentation entsteht ausschliel31ichD-Lactat. Dieses wurde mit D-Lactatdehydrogenase (Boehringer, Mannhelm) nach Gawehn u. Bergmeyer (1970) bestimmt. Die Milchsfiure wurde nach Aronoff (1956) mit Kaliumdichromat zu CO2 und Essigs/iure oxidiert.

Radioaktivitdtsmessung. Die RadioaktivitS.t aller Proben wurde mit einem Scintillationszfihler, Modell 2025, der Fa. Packard Instrument Comp., Downers Grove, Ill., U.S.A., gemessen. Verwendete Cocktails: ,,Instagel", gekauft yon Packard Instrument Comp., oder eine L6sung yon 5 g 2,5Diphenyloxazol (PPO) in t 1 Dioxan.

Ergebnisse Die durchschnittlichen Mel3daten mehrerer Degradationen sind in Tabelle 1 zusammengefaBt. Neben CO2, )kthanol und Milchsgure, den typischen Produkten der Glucosefermentation (De Moss et al., 1951), entsteht bet der Fermentation von Mannose durch L. mesenteroides auch Essigs~iure. Diese kann aus dem Atherextrakt der Fermentationsl6sung leicht dutch Wasserdampfdestillation entfernt und damit yon )~thanol und yon der Milchs/iure getrennt werden. Sie st6rt daher den weiteren Abbau der prim~iren Fermentationsprodukte nicht. Die Essigsgure haben wit mit Arsentrioxid als Kakodyloxid qualitativ nachgewiesen und quantitativ titrimetrisch bestimmt. Pro 100 mMol umgesetzter Mannose fanden wit maximal 15 mMol Essigsfiure. Andere Nebenprodukte, wie z.B. Mannit, das beim Umsatz yon Fructose mit L. mesenteroides in grol3er

96

510

2,9

88

0,5

79

0,45

18

0,1

5984

34

Menge anf~illt (Gibbs et al., 1963), wurden nicht gebildet. Der Nachweis erfolgte papierchromatographisch auf Whatman Nr. 1-Papier. Als Laufmittel diente )kthylacetat-Pyridin-Wasser 8 : 2: 1 (Hough u. Jones, 1962). Die Hauptprodukte CO2, Athanol und Lactat werden in dem molaren VerhNtnis 1:1 : 1 gebildet, in Ausbeuten yon durchschnittlich fiber 80 ~ der eingesetzten Mannose. 96 ~ der spezifischen Radioaktivitfit der Mannose2-14C finden wir im C-Atom 2 des Athanols wieder, das. aus dem C-2 der Mannose stammt. Die fibrigen Abbauprodukte enthalten nur sehr wenig Radioaktivit~it. Von ihnen ist das Produkt aus dem C-3 der Mannose mit 2,9 ~o der Mannoseaktivit~it am stgrksten markiert. Auffallend ist die im Vergleich zum Nthanol viel niedrigere spezifische Aktivit/it der bei der Fermentation entstandenen Essigs~iure. Diese kann also nicht ausschlieBlich aus den C-Atomen 2 und 3 der Mannose stammen, wie dies beim Abbau der Fructose durch L. mesenteroides offenbar der Fall ist (Busse et al., 1961).

Diskussion Die Verschmierung der Radioaktivit~it yon C-2 der Mannose auf die anderen C-Atome bleibt - unserer Auffassung nach - unterhalb einer tolerierbaren Grenze. Jedenfalls ist sie viel geringer als die Radioaktivitfitsverschmierung, die beim Abbau positionsmarkierter Fructose mit Leueonostoc mesenteroides (Busse et al., 1961) gefunden wurde. Hier war beim A b b a u yon Fructose-2-14C nicht weniger als 17,3 der eingesetzten Radioaktivit/it im Produkt aus dem C-5 der Fructose enthalten. Eine/ihnlich starke Verschiebung der Radioaktivitfit yon C-2 nach C-5 tritt

E. Ziegler und J. Dahmen: Abbau von 2-~4C-Mannose bei der Mannosefermentation nicht auf. Das BaCO 3 aus C-5 der Mannose enthielt nur 0,45 ~ der spez. Radioaktivitfit des C-2. Dies sowie die Tatsache, dab kein Mannit im Fermentationsmedium gefunden wurde, spricht daftir, dab bei der Fermentation von Mannose durch L. mesenteroides, die an diesen Zucker adaptiert wurden, die Reduktion des Zuckers zu Mannit und dessen Reoxidation, die zu einer symmetrischen Verteilung der RadioaktMt/it im Molektil ffihrt, quantitativ nicht yon Bedeutung ist. Busse et al. (1961) machen diese Vorgfinge ftir die hohe symmetrische Verteilungsrate der Aktivitfit beim Fructoseabbau verantwortlich. D a mit Ausnahme von C-3, das ca. 3 ~ der Aktivitilt aus C-2 enthielt, die Verschmierung der Radioaktivitfit v o m C-2 der Mannose-2-14C auf die iibrigen C-Atome des Molektils k a u m starker war als beim A b b a u von Glucose-2-14C und Galaktose-2-14C (Gibbs et al., 1963), meinen wir, dab sich die Fermentation mit Leuconostoc rnesenteroides-Zellen auch ffir die Degradation von Mannose eigne t. Literatur

Aronoff, S. : Techniques of radiobiochemistry, p. 141. Ames: Iowa State College Press 1956 Bernstein, I. A., Lentz, K., Malm, M., Schambye, P., Wood, H.G.: Degradation of glucose-~4C with Leuconostoc mesenteroides. Alternate pathways and tracer patterns. J. biol. Chem. 215, 137-152 (1955) Bernt, E., Gutmann, J. : Athanol; Bestimmung mit AlkoholDehydrogenase und NAD. In: Methoden der enzymatischen Analyse, H. U. Bergmeyer, Hrsg., S. 1457-1460. Weinheim: Verlag Chemie 1970 Busse, M., Kindel, P. K., Gibbs, M. : The heterolactic fermentation. III. Position of ~4C in the products of fructose dissimilation by Leuconostoc mesenteroides. J. biol. Chem. 236, 2850-2853 (1961)

269 De Man, J. C., Rogosa, M., Sharpe, M. E. : A medium for the cultivation of Lactobacilli. J. appl. Bact. 23, 130-135 (1960) De Moss, R.D., Bard,R.C., Gunsalus, I.C. : The mechanism of the heterolactic fermentation: A new route of ethanol formation. J. Bact. 62, 499-511 (195J) Gawehn, K., Bergmeyer, H. U. : D-(--)-Lactat. In: Methoden der enzymatischen Analyse, H. U. Bergmeyer, Hrsg., S. 1450-1453. Weinheim: Verlag Chemie 1970 Gibbs, M., Kindel, P. K., Busse, M. : Determination of isotopic carbon distribution in hexoses. In: Methods in carbohydrate chemistry, Vol. II, R.L. Whistler, M.L. Wolfrom, eds., pp. 496- 509. New York-London: Academic Press 1963 Gunsalus, I. C., Gibbs, M. : The heterolactic fermentation. IL Position of 14C in the products of glucose dissimilation by Leuconostoc mesenteroides. J. biol. Chem. 194, 871 -875 (1952) Heath, E. C., Roseman, S. : Determination of isotopic carbon distribution in aldoses. In: Methods in carbohydrate chemistry, Vol. II, R. L. Whistler, M. L. Wolfrom, eds., pp. 494-496. New York-London: Academic Press 1963 Hough, L., Jones, J. K. N. : Chromatography on paper. In: Methods in carbohydrate chemistry, Vol. I, R. L. Whistler, M. L. Wolfrom, eds., pp. 21-31. New York-London: Academic Press 1963 Jones, J. K. N., Stoodley, R. J.: Determination of isotopic carbon distribution in aldoses. In: Methods in carbohydrate chemistry, Vol. II, R. L. Whistler, M. L. Wolfrom, eds., pp. 489-493. New York-London: Academic Press 1963 Phares, E. F. : Degradation of labeled propionic and acetic acids. Arch. Biochem. Biophys. 33, 173-178 (1951) Schambye, P., Wood, H. G., Kleiber, M. : The distribution of C 14 in lactose of milk after intravenous injection of C 14 compounds. J. biol. Chem. 226, !011-102] (1957) Simon, H., Floss, H. G. : Anwendung von Isotopen in der Organischen Chemie und Biochemie, Bd. I, S. 83-88. Berlin-Heidelberg-New York:Springer 1967 Simon, H., Steffens, J. : Abbauverfahren zur Ermittlung der 14C-Verteilung in Pentosen und Hexosen. Chem. Ber. 95, 358- 370 (1962)

Dr. Ernst Ziegler Institut fiir Physikalische Biologie der Rheinisch-Westt'~ilischen Techr~ischen Hochschule, TH-Verfiigungszentrum D-5t00 Aachen, Bundesreptlblik Deutschland