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Experimentelle Untersuchungen zur photodynamischen Therapie von malignen Tumoren der Mundhöhle, des Larynx und Pharynx mit dem Photosensibilisator Methylenblau* D. Kleemann

HPD lagert sich selektiv in den meisten Tu-

Zusammenfassung Durch Sensibilisierung mit Methylenblau

und anschliefende Bestrahiung mit rotem Laserlicht können Plattenepithelkarzinome des oberen Aero-Digestivtraktes in vitro zerstört werden. Die alleinige Sensibilisierung oder Bestrahiung erbringt keine gleichartigen Ergebnisse. Es werden Moglichkeiten und Bedingungen diskutiert, dieses Verfahren zu einer selektiven photodynamischen Therapiemethode weiterzuentwickeln. Experimental Investigations of Photodynamic Treatment of Malignant Tumors of Oral Cavity, Pharynx, and Larynx with Photosensitizer Methylene Blue

Squamous-cell carcinomas of the upper aerodigestive tract can be destroyed in vitro through photosensitization with Methylene blue and subsquent radiation with red laser light. It is impossible to obtain the same results with sensitization or light radiation alone. The paper discusses the conditions under which this procedure might develop into a truly selective photodynamic therapy method.

morgeweben an, in geringen Konzentrationen allerdings auch in den oberen Hautschichten und führt so zu einer Lichtsensibilisierung des Patienten, der sich für 3—6 Wochen nach der HPD-lnjektion vor Lichtstrahlung schützen muI. Em weiterer Nachteil des HPD ist sein relativ geringes Absorptionsvermogen im roten Spektralbereich. Die für die

PDT verwendete Lichtwellenlange sollte moglichst im ,,optischen Fenster" von biologischen Geweben liegen, also im Bereich hoher Lichttransmission, die im roten Bereich

und nahen Infrarot am grö&en ist. Natürlich sollte auch dcr verwendere Lichtsensibilisator in diesem Bereich em grofes Absorptionsvermogen besitzen. So sucht man trotz der nachgewiesenen klinischen Wirksamkeit des HPD weltweit nach Alternativen, d. h. nach Sensibilisatoren, die möglichst folgende Eigenschaften aufweisen: — —

— — —

selektive Anlagerung an Tumorgewebe,

Fãhigkeit zur Zellzersrorung bei Kombination mit Licht-

strahlung, groe Lichtabsorption im roten und infraroten Bereich, keine oder geringe Toxizität für den Organismus, schneller Abbau durch den Organismus.

Em klassischer Farbstoff mit starker Lickabsorption im roten Bereich ist das Methylenblau (Abb. 1). Seine Zytotoxizität in Verbindung mit Licht wurde schon

1966 durch Berg und Jungstand (1) nach intratumoraler Einleitung

______ _____-

Verglichen mit anderen Fachgebieten liegen in der HNO-Heilkuride noch relativ wenig Erfahrungen mit der Methode der Photodynamischen Therapie (PDT) maligner Tumoren vor (4, 13, 15, 16).

Der bisher meist verwendete Lichtsensibilisator ist em Hamatoporphyrinderivat (HPD). Mit diesem wurde der Grundstein für eine selektive photodynamische Tumortherapie gelegt (11), welche verschiedene Gruppen bereits zur klinischen Anwendung hrachten (3, 8). HPD kam auch bei bisherigen experimentellen und klinisch-expe-

rimentellen Untersuchungen an HNO-Tumoren vorzugsdie erfolgweise zur Anwendung. Hayata (7) berichtet reiche Behandlung von Frühstadien von Larynxkarzinomen mit diesem Sensibilisator. Laryngo-Rhino-Otol. 69 (1990) 437—439

Gcorg Thieme Verlag Stuttgart New York

Applikation in Tiertumoren nachgewiesen. Kdnig und Mitarb. (9) wiesen den zytoroxischen Effekt des Methylenblau nach Aktivierung durch Krypton-Laser-Strahlung am soliden Ehrlichkarzinom nach. Fowler und Devonshire (5) fanden bei verschiedenen Phenothiazinfarbstoffen (u. a. Methylenblau) die Bildung von Singulett-Sauerstoff nach Belichtung. Fukuki und Mirarb. (6) beschrieben nach baker Instillation von Methylenblau in die menschliche Harnblase cine Anfãrbung von Tumorgewebe, während sich die normale Blasenschleimhaut nicht färbte. Gegenwärtig laufen Unrersuchungen zur Anwendung des Methylenblau durch lokale Applikation beim Harnblasenkarzinom und Bestrahlung mit einem Farbstofflaser (11). Ziel der eigenen Arbeit war es, die Wirkung des Farbstoffes Methylenblau als Lichtsensibilisator hei Be-

strahiung mit rotem Laserlicht auf Zelisuspensionen von Herrn Doz. Dr. H. Köster (Sektion Physik der Wilhclm-Pieck-Universität Rostock) und Herrn Dr. K. König (Sektion Physik der FricdrichSchillcr-Univcrsität Jena) wird für die konstruktivc Beratung und Untcrstützung bezhglich physikalisch-technischer Bedingungen gedankt.

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Hals-Nasen-Ohren-Klinik (Direktor: MR Prof. Dr. sc. med. H.-J. Scholtz) des Bereiches Medizin der Wilhelm-Pieck-Universität Rosrock

D. Kleemann

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Es wurde Tumormaterial von 12 Plattenepithelkarzinomen des oberen Aero-Digestivtraktes (4 Larynxkarzinome, 6 Pharynxkarzinome, 2 Mundhöhlenkarzinome) verwendet, welches nach der Entnahme maximal 3 Monate bei — 170CC lagerte. Die daraus hergesteliten Zellsuspensionen wurden in RPMI 1640 Medium (Staatliches Institut für Immunpräparate und Nãhrmedien Berlin) mit 5 % Serumanteil und 50 ug/ml Gentamycin (Pharmachim Bulgaria) bei 37CC und Begasung mit 7,5 % CO2 ahgedunkelt insgesamt 5 Tage kurzzeitkultiviert. Es erfolgte eine Portionierung von je 0,5 ml je Probe in Reagenzglãsern. Während jeder Versuchsreihe fanden folgende Behandlungen der Suspensionen statt:

3

2

•1

— —

Kontrollsuspension ohne Behandlung, alleinige Laserbestrahlung,

und Laserbestrahlung, A nm4 — Sensibilisierung — alleinige Sensihilisierung. Abb. 1 Lichtabsorptionsspektrum des Farbstoffes Methylenblau (nach Konig und Mitarbeiter)

V

—Temperaturmellschleife

Die entsprechenden Proben wurden durch emstündige Inkubation mit 2 bzw. 20 ug/mI Methylenblau (FERAX Lahorat GmbH Berlin-West) sensibilisiert. Nach dem Auswaschen des Farbstoffes dutch zweimaliges Zentrifugieren (1000 U/mm., 10 Minuten) erfolgte die Zellzahlung zur Ermittlung des Ausgangswertes vitaler Zellen in den Proben, von avitalen dutch Trypanblaufarbung differenziert, mit Hilfe einer Thoma-Kammer (Fein Optik Bad Blankenburg). Die Ausgangswerte lagen zwischen 2 x lO5und 6 x 10 vitalen Zellen pro ml Suspension. Weitere Zählungen fanden 24, 48 und

72 Stunden nach der Laserbehandlung statt, wobei das Verhalten der unbehandelten Proben zur Korrektur der Werte einflo1.

_PbenkUvette

Zur Laserbehandlung wurden die Proben in GlasKleinkuvetten (1 cm) umpipettiert. Für die Behandlung standen em Helium-Neon-Laser und em Krypton-Laser (heide VEB Carl ZeissJena) zur VerfOgung. Vorn Krypton-Laser wurde die Linie 676 nm vetwendet. Die Ausgangsleistungen lagen bei 40 mW für den HeliumNeon-Laser und 70 mW für die verwendete Linie des Krypton-Lasers. Während Bestrahlungszeiten von 360—720 Sekunden betrugen die auf die Proben applizierten Energiedichten zwischen 12 und 24

Abb.2 Schematischer Versuchsaufbau

J/cm2, wobei die von der Probe absorbierte Energiedichte mit 6 J/cm2 konstant gehalten wurden. Für die Berechnung war der Lichtverlust, das Streulicht z. B. aufgrund der geringen Dichte der Suspensionen, vernachlãssigt worden. Mit Hilfe eines Thermoelementes fand die Registrarur der Probentemperatur vor und nach der Laserbestrahlung statt. (Ahb. 2)

Ergebnisse

Alle 12 untersuchten Tumoren konnten durch Sensibilisierung mit Methylenblau und ansch1iefen-

jns,b,hve,t

Abb. 3 Effekte an unterschiedlich behandelten Tumorzellsuspensionen-Zhlung vitaler Zellen im 72-Stunden-Zeitraum nach der Behandlung

der Bestrahiung mit rotem Laserlicht beeinflugt werden (Abb. 3). In den ersten 24 Stunden nach der Laserbehandlung war der entscheidende Rückgang der Zahi lebender Zellen, bei einer Standardabweichung unter 10 %, zu verzeichnen. Danach fand sich zum Teil wieder eine Erhöhung der Zelizahien.

Durch die Behandlung der Proben mit Laserlicht ohne vorherige Lichtsensibilisierung kam es zur deutlichen Vermehrung der Zelizahi in der Kurzzeitkultur. Plattenepithelkarzinomen des oberen Aero-Digestivtraktes zu prufen. Dies soil em experimenteller Ansatz für die spatere lokale Anwendung von Methylenblau als Lichtsensib ihsator bei den oberfldchlich gelegenen Schleimhauttumoren unseres Fachgebietes sein. Mit der lokalen Applikation würden Probleme der systemischen Toxizitdt sowie der Ausscheidung des Sensibilisators aus dem Organismus entfal-

len.

Bei insgesamt 7 Tumorproben, die mit 2 bzw. 20 ug/mI Methylenblau eine Stunde inkubiert, aber ohne Laserbehandlung lichtgeschützt weiterkultiviert wurden, fand sich im Verlauf von 72 Stunden nach der Behandlung em Anstieg der Zellzahien. Selbst bei Dauerinkubation mit 20 ug/mi Methylenblau 72 Stunden gab es bei keiner Probe em Absinken der Zahi lebender Zellen Unter 50 % des Ausgangswertes.

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Material und Methode

s (lx moH x cm-1) x

In den unbehandelten Kontroliproben blieben die Zelizahien 72 Stunden verhãltnismafig konstant. Diskussion

Die Ergebnisse der Untersuchung zeigen die Möglichkeit der Zerstörung von Plattenepithelkarzinomzellen des oberen Aero-Digestivtraktes durch die photodynamische Behandlung mit Methylenblau und rotem Laserlicht, wobei die alleinige Sensibilisierung oder alleinige Laserbehandlung im Bereich der angegebenen Dosierungen keinen derartigen Effekt hervorrufen.

Individuelle Unterschiede in der Ansprechbarkeit der Tumoren auf die Behandlung sowie em moglicherweise differentes Verhalten von Tumoren unterschiedlichen histologischen Typs deuteten sich in den eigenen Untersuchungen an, müssen aber an einer gröeren ZahI von Proben nachgewiesen werden.

Ganz sicher hàngt der Effekt der photodynamischen Behandlung von der verwendeten Lichtwellenlange sowie der Licht- und Sensibilisatordosierung ab. Dies

muf durch Untersuchungen an permanenten, kionierten Zellinien besser belegt werden. Dabei scheint die Tatsache eine Rolle zu spielen, da{ Methylenblau in wdssriger Lösung als konzentrationsabhdngiges Monomer-Dirner-Gemisch vorliegt (Uberwiegen der Dimere in höher konzentrierten Lösungen), wobei das Bandenmaximum der Monomere bei 667 nm und das der Dimere bei 612 nm liegen soil (10). Mit der Verwendung der 676 nrn-Linie des Krypton-Laser liegt man dem Bandenmaxirnum der Monornere sehr nahe. Weiterhin nähert man sich der oberen Grenze der Lichtabsorption des Methylenblau. Die Eindringtiefe in biologische Gewebe ist für Licht dieser Wellenlange gröfer als für die Strahiung des Helium-Neon-Laser. Letzteres nähert sich dem Bandenmaximum der Methylenblau-Dirnere.

Es zeigte sich, da die entscheidenden Vorgänge des induzierten Photooxidationsprozesses in den ersten 24 Stunden nach der Laserbehandlung ablaufen. Der danach gefundene Ruckgang der Zahi vitaler Tumorzellen war unerheblich bzw. es kam sogar zur Zellvermehrurig. Der in Abbildung 3 dargestellte Kurvenverlauf entspricht sicher nicht der realen Wachstumsfunktion der Zeilkulturen, sondern zeigt die Tendenz. Ansonsten hdtten wesentlich hdufiger Messungen durchgefuhrt werden rnüssen, womit bei der praktizierten Methode die iiTuferen Bedingungen starker beeinfluft worden wären. AuEerdem ist durch die Verwendung von Primärkulturen 12 verschiedener Tumoren die individuelle Wachstumsdynamik bei der Ergebnisbetrachtung zu berucksichtigen. Die Standardabweichung lag nur bei den 24-Stunden-Werten nach photodynamischer Behandlung unter 10 %, ansonsten zum Teil urn em Vielfaches höher.

regung durch Laserlicht ist nicht neu. Er wurde durch andere Autoren sowohl an Normalgeweben als auch an Tumorzellen nachgewiesen (2, 14). Dies zeigt, wie wichtig die ausreichende Sensibilisierung der Tumorzelleri ist, da ansonsten das Gegenteil des beabsichtigten Effekts der photodynamischen Behandlung erreicht wird. Absch1ie1end kann festgestellt werden, daf nach den ersten eigenen Erfahrungen die photodynamische Behandlung von Plattenepithelkarzinomen des oberen Aero-Digestivtrakts mit Hilfe des Farbstoffes Methylenblau und rotem Laserlicht mdglich ist. Durch weitere Untersuchungen müssen die notwendigen Bedingungen präzisiert und die Praktikabilität gepruft werden.

Literatur 1

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len aus dem Kopf-Hals-Bercich. Laryng. Rhinol. Orol. 67 (1988) 16

Bei den vorliegenden Untersuchungen spielen Temperaturveranderungen wohi keine Rolle. Dies wurde durch Messungen vor und nach der Laserbestrahiung gesichert (Temperaturdifferenz kleiner 1C). In den bestrahiten, aber nicht sensibilisierten Proben fand sich em Ansteigen der Zelizahi, wobei die stärkere Zunahme bei den mit der 676 nm-Linie des Kryptonlaser behandelten Zellen zu verzeichnen war. Der Effekt der Zellproliferation nach An-

Berg, H., W. Jungstand: Photodynamische Wirkung auf das solide

532—538 Wustrow, T. P. U., A. Schramm, D. Jochani, F. Unsold: Laserlichtverursachte Zytotoxitãt kultivierter Plattenepirhelkarzinomzellen aus

dem Kopf-Hals-Bereich nach Photosensibilisierung. Laryng. Rhinol. Otol. 68 (1989) 44—50

Dr.med. D. Kleemann HNO-Klinik des Bereiches Medizin der Universität Rostock Doberaner Str. 137—139 Rostock 2500

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Experimentelle lintersuchungen

[Experimental studies for photodynamic therapy of malignant tumors of the mouth cavity, larynx and pharynx with the photosensitizer methylene blue].

Squamous-cell carcinomas of the upper aerodigestive tract can be destroyed in vitro through photosensitization with Methylene blue and subsequent radi...
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