Klinische

Klin. Wschr. 56, 52t-524 (1978)

W°ch nhrif t © Springer-Verlag I978

Erfahrungen mit einem Enzymimmunoassay zum Nachweis von Hepatitis B Antigen bei Blutspendern S. Seidl, J. Kfihner, L. Trautmann und K. Pade DRK-BlutspendedienstHessen, Frankfurt/Main

Experiences with an Enzyme-Immunoassay for Hepatitis B Antigen Detection in Blood Donors Summary. In a comparative study 12,080 sera from unpaid donors were tested simultaneously for Hepatitis B Antigen (HBsAg) by enzyme-immunoassay (EIA) and radioimmunoassay (RIA). A relatively high number of sera reacted positive in the EIA-screening test but were negative after repeated investigation. This percentage could be markedly reduced when using an automated washing apparatus. After neutralization 0.31 per cent were considered as true positive in EIA and RIA, thus demonstrating that no differences did exist as far as sensitivity is concerned. The EIA needs more incubation time than the RIA, however, the EIA has the advantage of using enzyme-labelled antibodies instead of radio-iodinated reagents. The results are read immediately and no sophisticated equipment is required. The EIA is easy to handle, two technicians can perform 1000 tests per day. Key words: Hepatitis B Antigen - Enzyme-Immunoassay - Radioimmunoassay - Blood Donors. Zusammenfassung. In einer Vergleichsuntersuchung wurden die Seren yon 12080 unbezahlten Blutspendern mit dem Enzym-Immunoassay (EIA) und dem Radioimmunoassay (RIA) auf HBs-Antigen untersucht. Im EIA-Screeningtest wurde ein relativ hoher Prozentsatz nicht reproduzierbarer positiver Reaktionen festgestellt, der im wesentlichen durch ungenfigendes Waschen bedingt ist. Wurde der EIA mit einer automatischen Waschapparatur durchgeffihrt, so konnte dieser Prozentsatz deutlich gesenkt werden. Nach Neutralisation wurden 0,31% positive Proben im EIA und im RIA festgestellt. Daraus kann geschlossen werden, dab praktisch keine Unterschiede in der Empfindlichkeit zwischen diesen beiden Tests Sonderdruckanfragenan: Prof. Dr. S. Seidl (Adresse s. nach Lit.)

bestehen. Der EIA ben6tigt eine I/ingere Inkubationszeit als der RIA. Der EIA hat jedoch den Vorteil, dab er nicht mit radioaktiven Substanzen arbeitet, keine kostspielige Ausrfistung erfordert und dal3 die Resultate sofort ablesbar sind. Der EIA ist ohne Schwierigkeiten durchzuffihren, zwei med.-techn. Assistentinnen k6nnen etwa 1000 Seren pro Tag untersuchen.

Sehliisselw6rter: Hepatitis BsAntigen - Enzym-Immunoassay - Radioimmunoassay - Blutspender.

Der Nachweis yon HBsAg in Blutspenderseren erfolgte in den vergangenen Jahren mit verschiedenen Methoden. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Empfindlichkeit werden sie - nach einem der Computersprache entlehnten Ausdruck - in Tests der 'l. Generation' (Agargeldiffusion), der '2. Generation' (KBR, ~berwanderungselektrophorese) und in Tests der '3. Generation' unterteilt. Zu den letzteren geh6ren die passive Haemagglutination und der Radioimmunoassay. Diese empfindlichen Methoden sollen nach einer Empfehlung der Deutschen Gesellschaft ftir Bluttransfusion und Immunh/imatologie (1975) nur noch zur HB~Ag-Bestimmung bei Blutspendern angewendet werden. Die passive Hfimagglutination ist einfach und ohne gr613eren apparativen Aufwand in jedcm Laboratorium durchzuffihren, der Radioimmunoassay erfordert dagegen eine kostspielige Ausrfistung und setzt die Genehmigung ffir den Umgang mit radioaktiven Substanzen voraus. Im Vergleich zur passiven H/imagglutination werden mit dem Radioimmunoassay (RIA) jedoch mehr HB~Ag-positive Blutspender erfaI3t [3], so dab der RIA zur Zeit als das empfindlichste Nachweisverfahren angesehen werden kann. Neuerdings steht als weiteres Testsystem ein Enzym-Immuno-Assay (EIA) zur Verf/igung, der aufgrund der bisher vorliegenden Ergebnisse eine

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s. Seidl et al. : Enzym-Immuno-Assay

d e m R I A v e r g l e i c h b a r e E m p f i n d l i c h k e i t h a t [7], a b e r keine r a d i o a k t i v e n R e a g e n z i e n ben6tigt. D i e s e n Test h a b e n wir d e s h a l b als S c r e e n i n g - M e t h o d e im Vergleich z u m R I A ffir den N a c h w e i s y o n H B s A g im S e r u m v o n B l u t s p e n d e r n h e r a n g e z o g e n . Z u r Feststellung der Spezifitfit u n d E m p f i n d l i c h k e i t w u r d e n auBerdem einige zus~itzliche U n t e r s u c h u n g e n durchgeffihrt, fiber die n a c h s t e h e n d b e r i c h t e t wird.

Material und Methoden Radioimmunoassay Die Untersuchungen erfolgten in einem Zweistufentest ('sandwich'Technik) nnter Verwendung yon Anti-HB~-beladenen Kugeln mit einer Inknbationszeit yon 2 bzw. 1 h bei +45°C (Ausria II®).

Enzym-Immuno-Assay Testprinzip: Der Test wird in der 'sandwich'-Technik durchgeftihrt. Verwendet wurden Microtiterplatten (Microelisa~-Platten), die mit Anti-HB~ beschichtet sin& Enthfilt die zu untersuchende Probe HB~Ag, so erfotgt eine Bindung. An die zweite Bindungsstelle des HB~Ag wird dann ein mit Meerrettichperoxydase markierter Antik6rper angelagert. Meerrettichperoxydase reagiert mit dem spMer zugeffigten Substrat (Ureaperoxid, o-Phenylendiamin) und als Folge dieser enzymatischen Reaktion tritt eine gelb-orange Farbe auf. Technische Durchftihrung: Das Testsystem 2 besteht aus Microelisa-Platten und mehreren Reagenzien. In die bereits mit AntiHB~-beschichteten Platten wird in jede Vertiefung 0,1 ml Serum oder Plasma eingebracht. Danach werden die Platten mit Parafilm abgedeckt, 2 h bei +37°C (oder 16 h bei Raumtemperatur) inkubiert und anschliet3end dreimal sorgf/iltig mit der mitgelieferten und nach Vorschrift verdfinnten Waschflfissigkeit ausgewaschen. Nach Zugabe des mit Meerrettichperoxydase-markierten Antik6rpers erneute Inkubation ffir 2 h bei + 37° C. In der Zwischenzeit wird die Substratl6sung zubereitet: Eine Tablette o-Phenylendiarain (OPD) wird in 15 ml destilliertem Wasser aufgel6st und zu dieser L6sung 0,4 ml Peroxidstamml6sung gegeben. Nach Beendigung der zweiten Inkubation wird viermal gewaschen, in jede Vertiefung der Platte 0,1 ml dieser Substratl6sung zugesetzt und f/Jr 50rain bei Raumtemperatur (im Dunklen) inknbiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe yon 0,05 ml 4N H2SO, gestoppt. Das Ergebnis kann mit blol3em Auge abgelesen werden. Da OPD lichtempfindlich ist, mfissen die entsprechenden Reaktionsschritte bei reduziertem Licht durchgeffihrt werden. Die Beurteitung der Testergebnisse war nach kurzer Einarbeitung ohne gr613ereSchwierigkeiten m6glich. Eine positive Reaktion wird an einer mehr oder weniger intensiven gelborangen Farbe erkannt. Zur Erkennung der bei schwach positiven Reaktionen auftretenden geringen Farbver~inderungen wurden die Platten grundsgtzlich fiber einer Lichtbox abgelesen und aul3erdem ein Vergleich mit den mitgelieferten stark positiven und schwach positiyen Kontrotlseren durchgeffihrt. Neutralisationstest: Um unspezifisch positive Reaktionen auszuschliel3en, wurde mit Proben, die auch in der Wiederholungsuntersuchung (s. Tabelle) positiv reagiert hatten, ein Neutralisationstest durchgeffihrt. Das zu priifende Serum wurde mit Anti-HBs (vom Mensch) 1 h vorinkubiert. Bei Vorliegen yon HBsAg erfotgte eine Neutralisation mit Anti-HB,, d.h. der Test wurde negativ, Microelisa: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay Hepanostika ®, Organon Teknika, Mtinchen

w/ihrend bei einer unspezifisch positiven Reaktion erneut eine gelborange Verf~rbung auftrat. Untersuchungsmaterial: Die Empfindlichkeit des EIA wurde an 163 RIA-positiven Blutproben fiberprtiff. Es handelte sich dabei um HB~Ag positive Seren, die wir in den letzten Jahren bei unseren Blutspendern gefunden hatten (Instituts-Panel). Die Seren waren zum Teil mehrere Jahre bei - 2 0 ° C eingefroren und gelagert worden. Im Screeningtest wurden insgesamt 12080 Seren yon unbezahlten Blutspendern sowohl mit dem RIA als auch mit dem EIA untersucht. Die Untersuchung dieser Proben erfolgte im allgemeinen 24-48 h (seltener 72 h) nach der Blutentnahme. Es handelte sich dabei um zwei Kollektive: a) Bei 7080 Seren wurde der EIA unter Verwendung eines manuell zu bedienenden 'Washer/Aspirators' durchgef/ihrt. b) 5000 Seren wurden parallel mit einer automatisch arbeitenden Waschapparatur und dem 'Washer/Aspirator' untersucht. Diese Untersuchungsreihe war notwendig geworden, da sich wfihrend der Untersuchung des ersten Kollektives herausgestellt hatte, dab der Prozentsatz falsch positiver Reaktionen im wesentlichen durch den Waschvorgang beeinflul3t wird.

Ergebnisse D i e U n t e r s u c h u n g y o n 163 im R I A p o s i t i v reagierend e r Seren ergab, d a g alle Seren a u c h im E I A positiv waren. In allen F N l e n w u r d e n eindeutige R e s u l t a t e festgestellt, o b w o h l die Seren z u m Teil m e h r e r e J a h r e gelagert w o r d e n w a r e n u n d einige Seren infolge hfiufigen Einfrierens u n d A u f t a u e n s b a k t e r i e l l k o n t a m i niert waren. In d e r T a b e l l e 1 sind die Ergebnisse d e r Screeningu n t e r s u c h u n g zusammengefal3t. Bis a u f zwei A u s n a h m e n w u r d e n m i t b e i d e n M e t h o d e n die gleichen Seren als w i r k l i c h positiv e r k a n n t . Ein S e r u m reagierte nur im E I A positiv u n d ein a n d e r e s S e r u m w a r n u r im R I A als positiv e r k a n n t w o r d e n . I n b e i d e n Ffillen h a n d e l t e es sich u m schwach positive Befunde, d.h. im E I A w u r d e n u r eine mfil3ige Verf/irbung festgestellt, w/ihrend die n u r im R I A n a c h w e i s b a r e P r o b e 70 I m p / m i n fiber den G r e n z w e r t aufwies. Bei b e i d e n Seren k o n n t e d a s E r g e b n i s im N e u t r a l i s a t i o n s t e s t gesichert werden. I n einer P a r a l l e l u n t e r s u c h u n g y o n 5000 Seren w u r d e die B r a u c h b a r k e i t einer a u t o m a t i s c h arbeitenden W a s c h a p p a r a t u r fiberprtift. D i e d a m i t erzielten E r g e b n i s s e sind in d e r T a b e l l e 1 g e s o n d e r t aufgeffihrt. Sie zeigen, da~3 der P r o z e n t s a t z unspezifisch positiver R e a k t i o n e n i m Screeningtest deutlich gesenkt w e r d e n k o n n t e (von 1,71% a u f 0,94%). Aul3erdem w u r d e die ffir d a s W a s c h e n e r f o r d e r l i c h e Zeit erheblich verkfirzt, d.h. d e r W a s c h v o r g a n g (4 x W a s c h e n ) ftir eine Platte (100 Tests) b e n 6 t i g t e n u r n o c h ca. 4 min. In der T a b e l l e sind die positiven R e a k t i o n e n get r e n n t aufgeffihrt, d.h. positive R e a k t i o n e n im Screen i n g t e s t (1. U n t e r s u c h u n g der B l u t p r o b e ) bzw. n a c h der W i e d e r h o l u n g (2. U n t e r s u c h u n g der B l u t p r o b e ) sowie die wirklich p o s i t i v e n R e a k t i o n e n n a c h D u r c h ffihrung des N e u t r a l i s a t i o n s t e s t s . W i e d a r a u s h e r v o r -

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S. Seidl et al. : E n z y m - I m m u n o - A s s a y Tabelle 1. Die U n t e r s u c h u n g von Blutspenderseren a u f HB~Ag mit dem EIA und R I A pos. Reaktionen im Screeningtest

EIA

RIA

pos. Reaktionen nach Wiederhotung

pos. Reaktionen nach Neutralisation (wirklich positiv)

automat. Waschen n = 5000

47

0,94%

17

0,34%

14 a

0,28%

manuelles Waschen n = 12080

206

1,71%

43

0,35%

38

0,31%

73

0,60%

38

0,31%

38 b

0,31%

n=12080

a 1 Serum, das auch in der Wiederholung positiv reagiert hatte, konnte nicht im Neutralisationstest untersucht werden, da nicht genfigend Serum m e h r zur Verffigung stand b Der Neutralisationstest wurde nur mit einzelnen Seren durchgeffihrt (s. Text)

geht, war die Mehrzahl der im Screeningtest positiv reagierenden Proben bei der Wiederholungsuntersuchung negativ (2. Spalte der Tabelle), so dab sich der Prozentsatz auf 0,31% im RIA und auf 0,35% bzw. 0,34% im EIA erniedrigte. Nur mit diesen auch in der Wiederholungsuntersuchung positiven Seren wurde der Neutralisationstest durchgeffihrt, und zwar beim EIA regelm/il3ig, beim RIA nur mit einzelnen Seren. Der Grund fiir dieses unterschiedliche Vorgehen ist in der Tatsache zu sehen, dab sich der RIA durch eine geringe St6ranf~lligkeit auszeichnet. So haben wir bei einer frfiheren fJberprfifung yon 200 RIA-positiven Seren im Neutralisationstest in keinem Fall eine unspezifisch positive Reaktion feststellen k6nnen. Wie aus der Tabelle 1 entnommen werden kann, sind es auch im EIA nur wenige Seren, die in der Wiederholung positiv reagiert hatten, deren Spezifit/it im Neutralisationstest aber nicht best~itigt werden konnte. Die letzte Spalte der Tabelle zeigt den Prozentsatz wirklich positiver Reaktionen. Mit beiden Methoden wurden dieselben Ergebnisse erzielt (0,31%), sieht man davon ab, dab ein Serum, das im EIA auch bei der Wiederholungsuntersuchung positiv reagiert hatte, im Neutralisationstest nicht tiberpriift werden konnte, weil daftir kein Material mehr zur Verftigung stand.

Diskussion

Von der Mehrzahl der Blutspendedienste in der Bundesrepublik Deutschland wird heute der Radioimmunoassay zum HBsAg-Nachweis im Spenderserum durchgeffihrt. Dieser Test ist gut standardisiert und lfil3t sich unter Verwendung kfiuflicher Testpackungen ohne Schwierigkeiten durchftihren. Die Auswertung erfolgt in einem Gammacounter, das Ergebnis wird bei den meisten der heute verwendeten Apparaturen

automatisch ausgedruckt. Zwei eingearbeitete med.technische Assistentinnen bzw. Laborantinnen k6nhen tS.glich etwa 1000 Blutproben untersuchen. Die Verwendung von radioaktivem Material ist jedoch an eine Umgangsgenehmigung gebunden, auBerdem mfissen die in der Strahlenschutzverordnung festgelegten Auflagen erffillt werden. Neben baulichen Vorschriften stellt besonders die Lagerung bzw. Beseitigung des radioaktiv kontaminierten Materials die Blutspendedienste vor nicht geringe Probteme. Es hat deshalb nicht an Versuchen gefehlt, andere Tests ffir Screening-Untersuchungen bei Blutspendern einzusetzen. Die verschiedenen Methoden der passiven Hfimagglutination waren ein Weg in diese Richtung, allerdings hat sich gezeigt, dab damit weniger HBsAg positive Spender erfaBt werden [3]. Der kiirzlich von einer holl/indischen Arbeitsgruppe entwickelte EIA [4-6] scheint aufgrund der bisher vorliegenden Untersuchungen in seiner Empfindlichkeit dem RIA gleichzukommen [1,2,7]. Die von uns ermittelten Prozentsfitze positiver Reaktionen betrugen in beiden Methoden 0,31%. Bis auf zwei Ausnahmen wurden mit beiden Nachweismethoden dieselben Seren erfaBt. Daraus kann geschlossen werden, dal3 wesentliche Unterschiede in der Empfindlichkeit zwischen diesen beiden Tests nicht bestehen. Ein Serum reagierte nur im EIA positiv, ein anderes Serum nur im RIA. In beiden F/illen handelte es sich um schwach positive Reaktionen. M6gticherweise beruht diese unterschiedliche Erfassung auf Unterschieden in der Nachweisbarkeit einzelner Subtypen [1,

71. Von praktischer Bedeutung ist der Prozentsatz unspezifisch positiver, d.h. nicht reproduzierbarer Reaktionen. Es handelte sich dabei um Proben, die im Screeningtest positiv reagierten, bei der Wiederholung aber negativ waren. Solche unspezifisch positiven Reaktionen sind sowohl im EIA als auch im RIA

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in der fiberwiegenden Mehrzahl der Ffille durch ungenfigendes Waschen bedingt. Dies zeigte sich besonders deutlich, wenn der EIA mit einer manuetl zu bedienenden Waschapparatur durchgef~hrt wurde. Dagegen konnte eine Beziehung zwischen der Anzahl der unspezifischen positiven Proben und dem Alter der untersuchten Probe nicht gefunden werden. Der EIA ist gut standardisiert, erfordert allerdings einen gr613eren Zeitaufwand. Dies hat in der Blutbankpraxis keine allzugrol3e Bedeutung, da die Mehrzahl der Btutkonserven fr/ihestens 24 h nach der Entnahme freigegeben wird. Fiir eine Schnelluntersuchung auf HB~Ag, die beispielsweise notwendig ist, wenn Thrombozyten-Konserven oder Frischblut abgegeben wird, sind beide Methoden ohnehin nicht geeignet. Gegeniiber dem RIA hat der EIA den Vorteil, dab die Ergebnisse sofort abgelesen werden k6nnen. Nachteilig ist, dal3 subjektive Fehler, insbesondere bei der Feststellung schwach positiver Reaktionen, auftreten k6nnen. Solche Fehler kommen mit zu zunehmender Erfahrung zwar seltener vor, ganz ausgeschaltet werden k6nnen sie aber nur durch eine photometrische Ablesung. Eine solche Ablesung hat den zusfitzlichen Vorteil, dab damit die Empfindlichkeit des EIA gesteigert werden kann [7]. In der praktischen Durchftihrung konnte zwischen dem EIA und dem RIA kein wesentlicher Unterschied festgestellt werden. Zwei eingearbeitete med.-techn. Assistentinnen

S. Seidl et al. : Enzym-Immuno-Assay

bzw. Laboranten k6nnen t/iglich etwa 1000 Blutproben im EIA untersuchen. Literatur 1. Gerlich, W., Stamm, B. : Vergleich eines Enzymimmuntests mit einem Microtiter-Festphasenradioimmuntest zum Nachweis yon HBsAg. Arztl.. Labor (i. Druck) 2. Kacaki, J., Wotters, G., Kuijpers, Stulemeyer, S. : Results of the mutticentre clinical trim of the solid-phase enzyme immunoassay for hepatitis B surface antigen. Vox Sang. (i. Druck) 3. Seidl, S., Ziegler, G.B, : Detection of hepatitis B antigen in blood donors by radioimmunoassay and three reverse passive haemagglutination techniques. Vox Sang. 31, 81 (1976) 4. van Weemen, B.K., Schuurs, A.H.W.M.: Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Letters 15, 232 (1971) 5. van Weemen, B.K., Schuurs, A.H.W.M.: Immunoassay using hapten-enzyme conjugates. FEBS Letters 24 (1972) 6. van Weemen, B.K., Schuurs, A.H.W.M., Oostermeijer, M.W., Raymakers, H.H.T. : Immunoassay using antibody-enzyme conjugates. FEBS Letters 43, 215 (1974) 7. Wolters, G., Kuijpers, L., Kacaki, J. Schuurs, A.: Solidphase enzyme-immunoassay for detection of hepatitis B surface antigen. J. clin. Path. 29, 873 (1976) Eingegangen am 2. Februar 1977 Angenommen am 1. Juli 1977 Prof. Dr. S. Seidl DRK-Blutspendedienst Hessen Sandhofstrage 1 D-6000 Frankfurt a.M. 73 Bundesrepublik Deutschland

[Experiences with an enzyme-immunoassay for hepatitis B antigen detection in blood donors (author's transl)].

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