Exp. Anim. 41(3), 357-362,

Evaluation

of Enzyme-linked

Immunosorbent

for Serodiagnosis of Bordetella Infection in Guinea Katsumi

MIKAZUKI,

Tsutomu HIRASAWA, Hiroko NENUI, and Keiko

Aburahi

Laboratories,

Shionogi

1405 Gotanda,

Koha-cho,

(Received

4 February

Assay

bronchiseptica Pigs

Yoko SAKAI, TAKAHASHI

Pharmaceutical

Koha-gun,

1992

Co.,

Shiga

1992/Accepted

Sayoko

OHHARA,

Ltd.,

520-34, Japan

24 March

1992)

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for serodiagnosis of Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica) infection in guinea pigs was evaluated. An isolate of B. bronchiseptica from lung lesion of a guinea pig was used as antigen after ultrasonication. In the experimental infection, specific pathogen-free guinea pigs inoculated with the bacterium intranasally were examined every 5 or 10 days. The organism was recovered from all animals between 5 and 30 days post-inoculation (p. i.). Only one animal was sero-positive by agglutination test 30and 50 days p. i. ; whereas, by ELISA, one animal was positive 5 days p. i., and all the animals showed strong reaction 20 to 50 (end of experiment) days p. i. Field samples obtained from 1983 to 1989 were tested by ELISA. The results corresponded to those of macroscopic observations and bacterial isolation. The ELISA proved to be useful method for detection of B. bronchiseptica infection in guinea pigs. KEY WORDS : Bordetella bronchiseptica, ELISA, guinea pig, serodiagnosis

モ ル モ ッ ト に お け るBordetollabronchiseptica感

染 の

血 清 診 断 法 と し て のEnzyme-1inked immunosorbentassayの 三 日月 勝 見 ・平 沢

勉 ・境

評価 陽 子 ・大 原 眞 代 子 ・

根 縫 弘 子 ・高 橋 恵 子 塩 野 義 製 薬 株 式 会 社 油 日 ラボ ラ ト リーズ

Bordetella は ラ ッ ト,モ

cbronchiseptica (B. ル モ ッ ト,ウ

bronchiseptica)

サ ギ,イ

ヌ等 の 実験 動物 や ブ

で 飼 育 さ れ て い た マ ウ ス,ラ

ッ ト お よ びSPFコ

ロニ

ー 由 来 の モ ル モ ッ トで は 陰 性 と い う 結 果 が 得 ら れ て い

タ 等 の 家 畜 か ら 広 く分 離 さ れ て い る 。 本 菌 に 特 に 感 受 性

る 。 さ ら に,モ

の 高 い 動 物 は モ ル モ ッ ト と ブ タ で あ り,モ

病 変 の 出 現 とが 一 致 す る こ と も 明 ら か に し て い る(未

気 管 支 肺 炎 の,ブ

ル モ ッ トで は

タで は 伝染 性 萎縮 性 鼻 炎 の 病原 と して

重 要 で あ る[2-7,10,12,14]。 の 実 験 用 動 物 に お け るB.

著 者 らは これ まで に 種 々 bronchiseptica感

し,動

物 業 者 か ら 導 入 さ れ た モ ル モ ッ ト,ウ

コ,サ

ル 類 で は 菌 分 離 陽 性 例 が 多 く,バ

発 表)。

血 清 診 断 に は 凝 集 反 応、 法[4,7,9,12]を

い る が,本

法 は 感 度,所

染 を検 査

が 指 摘 さ れ,こ

サ ギ,ネ

immunosorbent

リア シ ステ ム内

ル モ ッ トに お い て は 本 菌 分 離 状 況 と 肺

い る[1,8,11,13]。

用 い て

用 時間 の点 で 問題 のあ る こ と

れ に 代 わ る 方 法 と し てEnzyme-linked assay

(ELISA)の

そ こ で,今

導 入 が 検 討 され て

回 著 者 ら は モ ル モ ッ トの

三 日月勝 見 ・平沢

358

Table

Fig.1.

B. bronchiseptica感

1. Preparation

Diagnosis

染 に お け るELISAに

勉 ・境

陽子

of ELISA

of B. bronchiseptica

他 antigen

infection

よ る抗 体 検

査 法 の確 立 を試 み た。

材料お よび方法 1.ELISA用

抗原 の作 製法:某 動 物 繁 殖 業 者 由来の 肺

病変 を 有す るモル モ ッ トよ り分離 したB.

bronchiseptica

ボル デ テ ラ感 染 のELISA

Fig.2.

K810413株

のI相 菌 を用 い,Table

ELISA

value of SPF

1に 示 した 手 順 に よ

り作 製 した。 2.ELISA用

抗 原 固 相 化 プ レー トの作 製:色

素 結合

359

guinea

infusion

broth

pigs

(Difco)37℃,48時

間 培 養 液(2×108

/ml)5滴

を ハ ー トレー系SPFモ

ル モ ッ ト〓 ・体 重250

∼300g(日

本 チ ャ ール ス ・ リバ ー)に エ ーテル麻 酔 下 で

法 で あ る プ ロテ ィ ンア ッセ イ キ ッ ト(Bio-Rad社)に

経 鼻接 種 した 。 動物 は ビ ニ ー ル ア イ ソ レ ー タ ー 内(温

よ り抗 原液 の タ ンパ ク濃 度 を測 定 した。 抗 原 プ レー トは

度23∼24℃,湿

Sakurai

GC-4(オ

et al.の 方法[11]に

準 じて作 製 し,ア ル ミ箔

に 包 み デ シケ ータ ー 中 で2∼4℃ 3.ELISAの

の条 件 下 に 保 存 した 。

反 応 条件 に 関す る検 討:至 適 濃 度 決 定

度55±10%)で

は10日 間 隔 で 剖 検 し,所

見 を 記 録 す る と と もにFig.1

ら0.02μg

た 。 凝 集 反 応 はOgata

/mlま

エ ルず つ 分

リン不 活 化 抗 原 を 用 い た 。

注 し,抗 原 プ レ ー トを作 製 した。 陽 性 モ ル モ ッ ト血 清 は

また

に 示 した 手 順 に 従 って 菌 の分 離 同定,血 清 反 応 を実 施 し

の た め 抗 原液 の タ ンパ ク濃 度 を160μg/mlか で2倍 階 段 希 釈 した ものを200μl/ウ

飼 育 し,γ 線 滅 菌 飼 料

リエ ン タル酵 母)を 与 えた 。接 種 後5日

6.自

et al.の 方 法[9]に

準 じホ ル マ

然 感 染 モル モ ッ トに 関 す る検 査:1983∼1989年

3,200倍 に 希 釈 して 用 い た 。 二 次 抗 体 はhorseradish

にか け て 得 られ た 検 体 に つ い て 剖検 所 見 を記 録 す る と と

peroxidase標 識 抗 モ ル モ ッ トIgG(生 化 学 工 業)を, 「陽 性 血 清 の 吸 光 度 」/「 陰 性血 清 の 吸光 度 」 の値 が 最 大

肺 か らの 菌 分 離 も試 み た 。 検査 対 象 とな った モ ル モ ッ ト

と な る希 釈 倍 数 で使 用 した。 呈 色 用基 質 はo-フ

は採 材 時 す べ て コン ベ ン シ ョナ ル な環 境 下 で 飼育 され て

ェニレ

もにELISAを

実 施 した 。 一 部 に つ い て は鼻 腔,気 管,

ソ ジ ア ミンを 用 い,溶 解 液 に つ い て は クエ ソ酸 緩衝 液 と

い たが,1984年10月

リン酸 緩 衝液 を 比較 し,前 者 に 関 して は最 適pHを

由来 の も の で あ った 。

した 。 吸 光 度 測 定(波 長492nm)に トフ ォ トメ ー タ ーEAR-340AT(ラ

検討

以 降 の 個 体 は す べ てSPFコ

ロ ニー

はマイ クロプレー ボサ イエ ソス社)を

成

績

使 用 した 。 4.ELISAの

再 現 性:抗 原 の ロ ッ ト差,吸

光度のプ

レー トの ウエ ル間 お よび 日間 変 動 に つ い て 調 べ た。 5.実 験感 染:B.

bronchiseptica

K810413株 のHeart

ELISAの

条 件 設 定:抗 原 液 の タン パ ク濃 度 は10μg/

ml,二 次 抗 体 は16,000倍 希 釈,基

質 溶 解 液 はpH4.8に

調 整 した クエ ン酸 緩 衝 液 とい う条 件 でFig.1に

示 した

360

三 日月 勝 見 ・平 沢

Fig.3.

ELISA

Table

value

of the guinea

2. Results

of experimental

*:Crj:Hartley ***:≧0

手 順 に よ りELISAを

pigs

guinea

.5 of

OD492

実施 した場 合,バ

pig (serum

experimentally

陽子

他

inoculated

with

infection of B. bronchiseptica

, SPF dilution

ッ クグ ラ ウ ン ド

が 最 も低 く,陽 性血 清 群 と陰 性 血 清 群 の 吸 光 度(OD) の 比 が 最 大 とな った。ELISAの

勉 ・境

再 現 性 に 関 しては プ レ

**:No. at

1:160)

positive/No. was

OD0.29が

considered

B. bronchiseptica

in guinea

pigs*

examined positive

最 大 値 で あ った 。

感 染 実 験:ELISAに

よ る検 査 結 果 をFig.3に

た 。 感 染 前 の血 清 では40倍 希 釈 でOD0.5を

示 し

越 え る もの

ー トの ウエ ル 間 の 比較 に お い て軽 度 の いわ ゆ る エ ッ ジ効

が2例 み られ た 。OD値

果 が 認 め られ た もの の,日 間変 動,抗 原 の ロ ッ ト差 は共

し,20日 以 降50日 後 の 実 験終 了 時 まで全 例 高 い 値 を 呈 し

に 実 用 上 問 題 は な か った 。

た 。ELISAに

次 に,B.

bronchisepticaフ

リー で あ る こ と が 確 認

は感 染 後15日

目に 急 激 に 上 昇

お い て160倍 希釈 でOD0.5以

した 場 合 の 成 績 をTable

上 を 陽性 と

2に ま とめ た 。 実 験 期 間 を 通 じ

され て い る コ ロ ニ ーか ら得 られ た モ ル モ ッ ト血 清22例 に

菌 は 鼻 腔 お よび 気 管 か ら高 率 に 回 収 さ れ,肺

つ い て 試 験 した(Fig.2)。OD0

収 は 剖 検 所 見 の 推移 に ほ ぼ 対 応 し て い た 。 凝 集 反 応 で

希 釈 で6例,80倍

.5以 上 の もの は40倍

希 釈 で3例 認 め られ,160倍

希釈 では

か らの 回

は 感 染 後30日 お よび50日 各1例 陽 性 で抗 体価 も低 か った

ボル デ テ ラ感 染 のELISA

Fig.4.

Examination *:≧0 .5 of OD492 **:No . positive/No.

(1:5)の

に 対 し,ELISAで

of

B.

bronchiseptica

(serum

dilution

は5日 後 に1例 陽 性 とな

果 をFig.4に

に か け て の検 体 は コ ン

ベ ン シ ョナル な環 境 下 で飼 育 され て い た モ ル モ ッ トで あ り,94/108例(87%)がELISAで

陽 性,さ

肺 病 変,菌 分離 も陽 性 で あ っ た。1984年10月 月 に か け て の検 体 は すべ てSPFコ

1:160)

in was

guinea

pigs

considered

positive.

今 回,ELISAの

判 定基 準 は160倍 希 釈 でOD0.5以

を 呈 した もの を 陽 性 と した 。 そ れ は,1.陰

自然 感 染 モ ル モ ッ トに 関 す る検 査:結 ∼1984年9月

infection at

examined

り,15日 以降 全 例 陽 性 で 推移 した。

示 した 。1983年1月

361

い ての 試 験 で,40倍

希 釈 で は 明 らか に非 特 異 的 と考 え ら

れ る発 色 が み られ,80倍

希 釈 で もOD値

大 き い(0.11∼0.60)こ

と(Fig.2)。2.160倍

ら に一 部 は

は,陰 性 血 清 の 場 合OD値

∼1989年12

し感 染 実 験 で は 接 種5日 後 以 降OD0.5以

ロ ニー 由来 の モ ル モ

れ た こ と(Fig.3)。3.こ

の ば ら つ きが 希釈で

は最 大0.29で あ り,こ れ に 対 上 の例 が み ら

の基 準 で は感 染 後15日

ッ トで あ り,材 料 採 取 時 コ ンベ ンシ ョナ ル な環 境 下 で 飼

降 全 例 陽 性 とな り,こ れ まで の報 告[1,8,11]と

育 され て い た 。菌 分 離

そ れ 以 上 の 感 度 で あ る,等 の理 由 に よ る。

も,ELISAで

肺 病 変 は と も に陰 性 で あ っ て

は10/170例(5.9%)が

だ し,OD2.0を

越 え た のは1例

陽 性 で あ った 。 た

考

のみ で あ った 。

察

へ の応 用 は,す ト[11]で

bronchiseptica感

自然 感 染 モル モ ッ トに お け る検 査 で は,検 体 の 由来 に コン ベ ン シ ョ ナ

ル な 動物(1983年1月

は抗 体 陽 性 例 の

大 部 分 がOD2.0以

でに イ ヌ[1],ブ

染 に対 す る抗 体 検 査 タ[8 ,13],モ

ルモッ

検 討 され,本 法 は 感 度 と迅 速 性 の 二 点 で 従 来

目以

同等 か

よ り異 な る結 果 が 得 られ た(Fig.4)。 ∼1984年9月)で

上 の 高 い値 を呈 し,一 部 は 肺 病 変,

菌 分離 も陽 性 で あ った。 一方,1984年10月 ELISAのB.

上

性血 清 を用

以降 のSPF

コ ロ ニ ー由 来 の動 物 は,一 部 の例 では 詳 細 な経 歴 が 不 明 な もの の,採 材時 コ ンベ ンシ ョナ ル な環 境 下 で飼 育 され て い た。 た だ し,調 べ た限 り全 例 外 観 上 健 康 であ り,肺

の凝 集 反 応 に ま さ る こ とが 報 告 さ れ て い る 。 さ ら に,

病変,菌 分 離 共 に陰 性 で あ った こ とか ら,大 部 分 は 微 生

Sakurai

物 学 的 に 良 く コン トロー ル され た環 境 下 に あ っ た もの

et al[11]は

使 用 抗 原 と して は 超 音 波 処 理 菌

体 が 感 度,特 異 性 に す ぐれ 実 用 的 で あ る と述 べ て い る。

と考 え られ た。 こ うした 動 物 で もELISAで

そ こで,著 者 らは 今 回 実 験 動 物 の 微 生 物 モ ニ タ リソ グへ

(5.9%)が

ELISAを

例 のみ で,他 は0.5∼1.5の 間 で あ った 。Nakagawa

け るB.

導 入 す るた め の 一 環 と して,モ ル モ ッ トに お bronchiseptica感

を 加 えた 。

染 の血 清 診 断 に つ い て検 討

al.[7]は

陽 性 で あ った が,OD2.0以

は10/170例

上 を 呈 したの は1 et

肉眼 病 変,菌 分 離 と も陰 性 の モル モ ッ トで 凝

集 抗 体 陽 性 の場 合 が あ り,し か も これ らが 高 い抗 体価 を

三 日月 勝 見 ・平 沢

362

呈 す る のは 稀 で あ る と報 告 して い るが,今 回 の結 果 は こ

勉 ・境

著 者 ら の検 討 では,こ れ まで の と ころELISAの

るB.

bronchiseptica感

堀 江 喜 一 ・藤 崎 優 次 郎 ・入 沢 純 開 ・岡 崎 正 太 郎 ・亀 井 利 男 ・薄葉 勲(1960).最 近 私 共 の経 験 した 実 験 小 動 物 の1,2の 疾 病 に つ い て そ の1モ ル モ ッ トの肺 に お け る気 管 支 敗 血 症 菌 に つ い て.実 験 動物,9,35-40.

[4]

Kang, B. K., Koshimizu, K., and Ogata, M. (1970). Studies on the etiology of infectious atrophic rhinitis of swine. D . Agglutination test on Bordetela

再現

染 の血 清 診 断 法 と し て 従 来 の

凝 集 反 応、 に代 わ り得 る もの と考 え られ た 。 た だ し,使 用 抗 原 が 超 音 波 処 理 菌 体 の遠 心 上 清 で あ り精 製 され た もの で な い た め,他 の細 菌 に対 す る抗 体 との 交 差 反応 が 完 全

[5]

に は否 定 で き な い。 従 って,そ の特 異 性 に関 して は 今 後 な お検 討 の 余地 が あ る と思 われ る。 [6] 要

約

モ ルモ ッ トに お け るBordetella bronchiseptica)感

bronchiseptica (B.

染 の血 清 診 断 法 と して のEnzyme-

linked immunosorbent

assay

(ELISA)を

[7]

導 入す る

こ とに つ い て 検 討 を 加 え た 。抗 原 と して モ ル モ ッ ト肺 炎 由来B.

bronchiseptica

I相 菌 の培 養 菌 体 を 超 音 波 処

理 後 遠 心 した 上 清 を 用 い た 。 感染 実験 に はSPFモ

[8]

ルモ

ッ トを 使 用 し,同 菌 液 を 経 鼻接 種後 経 時 的 に 剖検 し菌 分 離 を 行 な うと と もに,血 清 を 採 取 し て凝 集 反 応 お よ び ELISAを

実 施 した 。 菌 は 感 染 後5∼30日

に か け て全 例

った の に対 し,ELISAで

Ogata, M., Kodama, Y., and Koshimizu,K. (1973) Studeis on the etiology of infectious atrophic rhinitis of swine. N. Agglutination test with formolized antigen for Bordetella bronchiseptica infection in pigs. JAn. J Vet. Sci., 35, 149-155.

[10]

尾 形 学 ・輿 水 馨 ・康 炳 奎 ・跡 部 ヒサ エ ・山 本 孝 史 ・木 野 津 南 夫 ・池 田讃 哉(1970).豚 の伝染性萎 縮 性

認 め られ た の み で あ

は感 染 後5日

よ り特 異 的 反 応

が認 め られ,20日 か ら50日 後 の実 験 終 了時 まで 全 例 高 い

鼻 炎 の病 原 学 的 研 究.I.鼻 日獣 志,32,185-199.

吸光 度 を示 した。1983年 か ら1989年 に か け て 得 られ た 検 体 に つ い て調 べ た とこ ろ,ELISAで

の 成績 は剖 検 所見

お よび菌 分 離 結 果 の推 移 と一 致 してお り,ELISAはB. bronchiseptica感

染 の血 清診 断 法 と して有 用 と考 え ら

れた。 最後 に,ELISAの 手技 について ご指導いただ きました(財) 実験動 物中央研究所,鍵 山直子,高 倉 彰 両先 生 に深謝 致 し ます。

[1]

[2]

文 献 Dees, C., Fountain, M. W., Panangala, V. S., Swango, L. J., and Schultz, R. D. (1982). An ELISA test to detect antibody to Bordetella bronchiseptica- Vet ImrrLin Irnmunopathot, 3, 539-545. Duncan, J. R., Ross, R. F., Switzer, W. P., and Ramsey, F. K. (1966). Pathology of experimental Bordetetta bronchiseptica infection in swine : Atrophic rhinitis. Am. J. Vet. Res., 27, 457-466.

brobchiseptica infection. Jpn. J Vet. Sci, 32, 295306. Koshimizu, K., Kodama, Y., Ogata, M., Sanbyakuda, S., Otake, Y., and Mimura, T. (1973). Studies on the etiology of infectious atrophic rhinitis of swine. V . Experimental Borde to lla bronchiseptica infection in conventional piglets. Jprt. J Vet. Sci, 35, 223-229. Koshimizu, K., Kodama, Y., Ogata, M., Kino, T., Sanbyakuda, S., and Mimura, T. (1973). Studies on the etiology of infectious atrophic rhinitis of swine. N . Effect of vaccination against nasal establishment of Bordetella bronchiseptica. Jpn. J. Vet. Sci, 35, 411-418. Nakagawa, M., Muto, T., Nakano, T., Yoda, H., Ando, K., Isobe, Y., and Imaizumi, K. (1969). Some observations on diagnosis of Borde to lla bronchisept ica infection in guinea pigs. Exp. Anim.,18, 105-116. Novotny, P., Kobisch, M., Cownley, K., Chubb, P. A., and Montaraz, J. A. (1985). Evaluation of Bordetella bronchiseptica vaccines in specificpathogen-free piglets with bacterial cell surface antigens in enzyme-linked immunosorbent assay. Infect. Immun, 50, 190-198.

[9]

か ら回 収 され た。 凝 集 反 応 では 感 染後30日 お よび50日 に 低 い抗 体 価 を有 す る ものが 各1例

他

[3]

れ に 対 応 す る もの と考 え られ た 。

性 につ い ては 特 に 問 題 は な く,本 法 は モル モ ッ トに お け

陽子

腔 内 細 菌 叢 と疾 病 の 関 係

[11] Sakurai, Y., Suzuki, H., Kobayashi, N, Terada, E., Takakura, A., and Kagiyama, N. (1990). Determination of an antigen suitable for enzyme-linked immunosorbent assay of antibody to Bordetella bronchiseptica in guinea pigs. Exp Anim., 39, 549555.

[12] Shimizu, T., Nakagawa, M., Shibata, S., and Suzuki, K. (1971). Atrophic rhinitis produced by intranasal inoculation of Bordetella bronchiseptica in hysterectomy produced colostrum-deprived pigs. Cor nell Vet., 61, 696-705. [13]

Venier, L., Rothschild, M. F., and Warner, C M. (1984). Measurement of serum antibody in swine vaccinated with Bordetella bronchiseptica: Comparison of agglutination and enzyme-linked immunosorbent assay methods. Am. J. Vet. Res., 45, 26342636.

[14]

依 田 八 治 ・中山 一栄 ・遊 佐 智 栄 ・佐 藤 重 男 ・福 田 三 五 郎 ・松 本 幸蔵 ・中川 雅 郎(1976).各 種 動物 の気 管支 敗 血 症 菌 検 索 成績.実 験 動 物,25,7-11.