Planta (Berl.) 111,129--136 (1973) 9 by Springer-Verlag 1973
Endogen und exogen ausgelSste Anderung des Isoenzymspektrums der NAD-spezifischen Glutamatdehydrogenase im Sprol~ von Pisum sativum T. H a r t m a n n Pha,rmakognostisches Institut der Universit/~t, NuBallee 6 D-5300 Bonn, Bundesrepublik Deutschland Eingegangen am 8. Januar/26. Januar 1973 E n d o g e n o u s l y a n d E x o g e n o u s l y Caused A l t e r a t i o n of t h e I s o e n z y m e P a t t e r n of 5~AD-specific G l u t a m i e D e h y d r o g e n a s e in Shoots of Pisum sativum
Summary. The isoenzymes of NAD-specific glutamic dehydrogenase (GDH) of Pisum sativum, separated by polyaclTlamide gel electrophoresis, constitute two patterns, each of which covers seven individual isoenzymes. One pattern (GDH-I) is found in the cotyledons and young shoots. The second one (GDH-II) occurs together with at least some GDH-I isoenzymes in pea roots. In the shoots of older pea plants GDH-II isoenzymes become visible in addition to the GDtt-I pattern. Section of the cotyledons (but not of the roots) of young pea seedlings causes the formation of the complete GDH-II isoenzyme pattern in the shoots within a few hours. I t has been verified that the cotyledons specifically suppress the formation of the GDH-II pattern in the young shoot. In older plants which no longer depend on the cotyledons this effect is maintained somewhat less obviously by the root system. In experiments with isolated shoot segments or shoot tips it has been shown that NH + reinforces the formation of the GDH-II whereas glucose shows the opposite effect. The formation of the GDH-II isoenzymes in the presence of NH + is accompanied by an increase of the specific activity of GDH. Simultaneously the ratio of aminating activity (anabolic reaction) to deaminating activity (catabolic reaction) changes in favor of the anabolic reaction. The results support the supposition that the GDH-I and GDtt-II isoenzyme patterns correspond to different molecular forms of one enzyme, the GDH-II representing a form with predominantly anabolic function and the GDH-I a form which has merely metabolic or catabolic function. I n einer v o r a u s g e g a n g e n e n Mitteflung zeigten ~ r , d a $ die m u l t i p l e n F o r m e n d e r NAD-spezffisehen G l u t a m a t d e h y d r o g e n a s e ( G D H ) bei Medicago sativa stabile a n d streng organspezifische I s o e n z y m s p e k t r e n bflden ( I I a r t m a n n et al., 1973). A u s einer kfirzlich y o n P a h l i c h (1972) 9*
130
T. Hartmann:
publizierten Arbeit ist zu entnehmen, dab ~hnliche GDH-Isoenzymspektren auch in P i s u m sativum vorzuliegen seheinen. Pahlich berichtet weRerhin fiber eine dureh S02-Begasung induzierte ~nderung des Isoenzymspektrums in Erbsensprossen. Dieser im Zusammenhang mit unserer Vorstellung, dab die organspezifischen Isoenzymspektren funktionell verschiedene Formen der NAD-spezifisehen GDH darstellen, sehr interessante Befund, veranlaBte uns, die Isoenzymspektren der GDH aus P i s u m genauer zu untersuehen.
Methoden Die Anzucht der Erbsenkeimlinge (Pisum sativum ,,Reisererbsen") erfolgte in feuchtem Sand. Zur Extraktion des Pflanzenmaterials und gelelektrophoretischen Auftrennung der GDH-Isoenzyme s. Hartmann et al. (1973). Als Ausgangsmaterial ifir quantitative GDH-Bestimmungen dienten frisch bereitete Acetonpulver. 200 mg Acetonpulver wurden mit 5 ml Tris-HC1 (0,1 M; pH 7,8) extrahiert nnd im Viscing-Dialyseschlauch 16 Std gegen H20 dialysiert. Die spektralphotometrische Bestimmung der GDH-AktivitEt wurde unter Beriicksichtigung folgender ~a~derungen nach Hartmann et al. (1973) durchgeifihrt: der pH-Wert im MeBansatz fiir die reduktive Aminierung betrug 7,8. Der MeBansatz fiir die oxydative Desaminierung wurde mit 0,2 ml L-Glutamat (0,7 M) gestartet, Hydrokulturen wurden in ttoagland-LSsung angesetzt, die als N-Quelle wahlweise/qO~ (0,015 M), NH~ (0,005 M) oder 0,1% Caseinhydrolysat (HYCASE-SF, Serva) enthielt. Alle Kulturen wuchsen im 10:14 Std Licht-Dunkelwechsel bei 24--27~ in sterilisierter N~hrlSsung. Die Iq~hrlSsung mit HYCASE-SF wurde 2mal tEglich gewechselt. Alle Infiltrationsversuche mit isolierten SproBsegmenten erfolgten in 0,02 M Phosphatpuffer pH 6,0 bei Raumtemperatur.
Ergebnisse In Abb. 1 sind die GDH-Isoenzymspektren yon Samen, Cotyledonen Sprossen und Wurzeln junger und ~lterer P i s u m sativum-Pflanzen wiedergegeben. J~hnlieh wie bei Medicago sativa kann man die GDHIsoenzyme aus P i s u m zwei Grundspektren zuordnen, die wir analog als GDH-I (Isoenzyme al bis a7) und GDH-II (Isoenzyme b l bis bT) bezeichnen wollen (Hartmann et al., 1973). Bei P i s u m setzen sich beide Spektren aus je 7 Isoenzymen zusammen. Die Intensit~t der nach Substratf~rbung naehweisbaren Formazanbanden nimmt in der Regel bei beiden Spektren graduell in anodiseher (GDH-I) bzw. kathodiseher Riehtung (GDtLII) ab, so dab die auf gleicher HShe liegenden, vermutlich identischen Isoenzyme al und bt am farbintensivsten erseheinen. Nicht berficksiehtigt ist in Abb. 1, dal3 sieh die 7 GDIt-I-Isoenzyme unter optimalen Elektrophoresebedingungen noehmals in zwei dicht beieinanderliegende Banden auftrennen lassen.
Isoenzymspektrum der NAD-spezifischen Glutamatdehydrogenase Cotyled,
SproB
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Wurze[ i
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Abb. 1. Isoenzymspektren der NAD-spezifischen GDH nach PolyacrylamidGelelektrophorese in jungen und Elteren Cotyledonen, Sprossen und Wurzeln yon Pisum 8ativum. Isoenzymeal bis a7 = GDH-I, Isoenzymebl bis b7 ~ GDtt-II
Wie bei Medicago enthalten Pisum-Samen und -Cotyledonen nur die GDH-I-Isoenzyme. In den Wurzeln junger Pisum-Pflanzen sincl anders als bei Medicago neben den GDH-II-Isoenzymen s/~mtliche GDH-I-Isoenzyme nachweisbar. M]t zunehmendem Alter nimmt jedoch die Intensitar der GDH-I-Isoenzyme merklich ab. Der Hauptun~erschied zur Luzerne liegt im Isoenzymspektrum des Sprosses, das sich bei jungen Erbsenpflanzen nicht yore Samenspektrum unterscheidet. Die GDH-IIIsoenzyme tauchen bier erst 1 4 - 2 0 Tage nach der Aussaat auf und bleiben auch im weiteren Verlau~ der Entwicklung vergleichsweise schwach. Anders als bei Medicago sativa sind die Wurzel- und SproBIsoenzymspektren bei Pisum also nieht yon Beginn an konstant, sondern Kndern sieh im Verlaufe der Entwicklung. Uns interessierte vor allem die •rage nach den mSglichen endogenen Faktoren, die ffir diese J~nderung verantwortlich sind. Das ~Erscheinen der GDH-II-Isoenzyme im iflteren ErbsensproB legt eine Beziehung zum Wechsel yon der N-heterotrophen zur N-autotrophen Phase der Keimlingsentwiek]ung nahe. Wir prfiften deshalb, ob sich das Isoenzymspektrum im Erbsenspro$ Kndert, wenn man junge Keimlinge durch Sektion der Cotyledonen yon ihrer natfirlichen Iq-Quelle abschneidet and gleichzeitig auf exogene N-Versorgung umstellt. Das Ergebnis eines en~prechenden Versnchs ist in Abb. 2 wiedergegeben. Bei Keimlingen, die 2 Tage ohne Cotyledonen in Flfissigkeitskultur auf N-freiem Medium oder in Gegenwart verschiedener N- Quellen gehalten wurden, lassen sich im Spro$ ohne Ausnahme s~mtliche GDH-II-Isoenzyme naehweisen. Die entsprechenden Kontrollpflanzen mit Cotyledonen enthalten unveri~nder~ nur das GDH-I-Isoenzym-
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T. Hartmann:
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Abb. 2. Anderung des GDH-Isoenzymspektrumsim SproB yon Pisum sativum nach Cotyledonensektion. 6 Tage alte Keimlinge wurden mit Cotyledonen (~-) und ohne Cotyledonen(--) 48 Std (A) bzw. 8 Tage (B) in ttydrokultur auf den angegebenenN-Quellen gehalten und dann zum Isoenzymnachweisaufgearbeitet
spektrum. Li~ngere Versuchsdauer ffihrt zu einer weiteren Veri~nderung der Isoenzymspektren, dabei tritt vor allem der unterschiedliche EinfluB der exogenen N-Quellen deutlich in Erscheinung. Nach 8 Tagen weisen ,,Ammoniumpflanzen" unabh~ngig davon, ob die Cotyledonen entfernt wurden oder an der Pflanze verblieben, nahezu reine GDH-ILIsoenzymspektren auf. In Gegenwart aller anderen N-Quellen oder bei N-~reier Kultur sind die GDH-II-Isoenzyme unverRndert nur in Pflanzen ohne Cotyledonen nachzuweisen. Bei den auf Caseinhydrolysat gehaltenen Pflanzen ist das nach 2 Tagen deutlich nachweisbare GDH-II-Isoenzymspektrum weitgehend wieder riickgebildet, wiihrend die GDH-I-Isoenzyme gut erhalten sind. Bei einer kritischen Bewertung dieser Befunde mul~ allerdings beriicksichtigt werden, dab die Cotyledonensektion, wie zu erwarten, bei allen Pflanzen zu einer merklichen Wachstumshemmung ffihrt und vor allem Ammoniumstickstoff bei 1Rngerer Kulturdauer ( ~ 5--10 Tage) toxische Nebeneffekte zeigt. Die Auswirkung der Cotyledonensektion auf das GDH-Isoenzymspektrum der Wurzel ist weir weniger signiHl~ant und betrifft ausschlie]~lich die GDH-I-Isoenzyme. Diese Effekte sollen hier unberficksichtigt bleiben. Die vorliegenden Ergebnisse machen deutlich, dab die Bildung der GDIt-II-Isoenzyme im jungen Erbsenspro~ durch die Cotyledonen unterdrfickt wird. Dieser ,,Cotyledoneneffekt" ist in der jungen Pflanze spezifisch. Entfernt man an Stelle der Cobyledonen die Wurzel, so Rndert sich das Isoenzymspektrum nicht. In isolier~en Sprol3sl)itzen 7 Tage alter Keimpflanzen ist das komplette GDtt-II-Isoenzymspektrum
Isoenzymspektrum der lqAD-spezifischen GlutamaMehydrogenase
133
bereits nach 6 Std nachzuweisen. Mit zunehmendem Alter der Pflanzen dauert der Vorgang liinger. Nach dem natfirlichen Absterben der Cotyledonen sind die GDH-II-Isoenzyme im SproBspektrum - - wie bereits erw/ihn~ (Abb. 1) - - auch ohne experimentellen Eingriff schwach, aber deutlich nachzuweisen. Zu diesem Zeitpunkt ffihr~ anders als bei der jungen Pflanze, die Sektion des Wurzelsystems zu einer verstark~en Bildung tier GDH-II-Isoenzyme. Der ,,Cotyledoneneffekt" geht also, wenn auch abgeschw/~cht in der/ilteren, roll N-autotrophen Pflanze auf die Wurzel fiber. In Infiltrar mit isolierten Sprol]spitzen untersuchten den Einflu6 verschiedener Substanzen auf die Bfldung der G D t L I I Isoenzyme. Aminos/~uren und Aminos~urengemische haben keinen oder einen schwach hemmenden (z. B. L-Aspartat und L-Leucin) EinfluB auf die GDH-II-Bildung. Ni~rat verh/tlt sich indifferent, w/ihrend 57H~Ionen als einzige der fiberpriiften Substanzen die Bildung der GDH-IIIsoenzyme begfinstigen. In Gegenwart yon 10-a bis 10-2 M NH~ ist in 7 Tage alten Erbsensprossen das GDH-II-Isoenzymspektrum bereits nach 4 Std naehzuweisen. Besonders deutlieh ist die NH~-Aktivierung bei etwas/~lteren Pflanzen, mit bereits abgeschw/ich~em ,,Cotyledoneneffekt", nachzuweisen. Die einzige Substanz mi~ der sich die GDH-IIBildung wirkungsvoll unterdrficken 1/~l]t, ist fiberraschenderweise Glucose. In Gegenwart yon 5 % Glucose ist das GDH-II-Isoenzymsloektrum auch in jungen SproBspitzen nach einer Inkubationsdauer yon 24 Std nut in Spuren nachzuweisen. Die durch Cotyledonensektion ausgel6ste und NI-I~ verst/~rkte Bfldung der GDH-II-Isoenzyme wird dutch Licht nicht beeinfluBt. Sis ist in Dunkelkeimlingen ebenso deutlich nachweisbar, wie bei Lichtpflanzen. Pisum-Cotyledonen/~ndern ihr GDIt-Isoenzymspektrum auch bei mehrt/~giger Infiltration mi~ 57It~ nicht. Sie enthalten bis zu ihrem natfirlichen Absterben ausschlieBlich die GDH-I-Isoenzyme. Tabelle 1. Quantitative _~mderung der GDH-Aktivit~t im isolierten Erbsenspro] nach Infiltration mi~ l~H+-Puffer. Inkubation 24 Std in 0,02 M Phosphatpuffer pH 6,0-~ 5 • 10-a M (NH4)~SO~. Spez. Akt.: A E~0/min und mg Protein l~aterial
Red. Aminierung spez. Akt.
SproBspitze (7d) A: Inkub. NtI+ 1,860 K: Kontrolle 0,368
Quotient A/K
5,1
Oxyd. Desuminierung Verh~ltnis: red. spez. Quotient Aminierung Akt. A/K oxyd. Desaminierung
0,218 0,086
2,5
8,5:1 4,3 : 1
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T. Har~mann:
Die qualitative ~nderung des GDH-Isoenzymspektrums im isolierten Erbsensprol~ ist auch in quantitativer ttinsicht bemerkenswert. Inkubiert man die Sprol~spitzen 7 Tage alter Pflanzen 24 Std in l~Itt~-Puffer, so erhSht sich die spezifische Aktivit~t der GDH im Vergleich zur Kontrolle merklich (Tabelle 1). Gleichzeitig sind erhebliche ~nderungen in der Enzymkinetik festzustellen. Besonders auff~llig ist unter konstanten Me~bedingungen die Verschiebung des Reaktionsverh~ltnisses der reversiblen Reaktionen zugunsten der reduktiven Aminierung yon ~-Ketoglutarat (Tabelle 1). Eine ~hnliche Verschiebung des Reaktionsverh~ltnisses beobachtete auch Pahlich (1972) nach Begasung yon Erbsensprossen mit S02. Diskussion Die in verschiedenen Organen yon Pisum sativum nachweisbaren Isoenzyme der NAD-spezifischen GDIt lassen sich wie bei Medicago 8ativa (Hartmann et al., 1973) zwei Grundspektren zuordnen, die wir als GDtI-I und GDH-II bezeichnen. In beiden Pflanzen ist die GDH-II immer im Wurzelsystem zu linden und fehlt in den Speichercotyledonen. Bereits bei den Untersuchungen an Medicago ~u~erten wir aufgrund der organspezifischen Verteilung beider Isoenzymspektren die Vermutung, da~ die GDtI-I und GDtI-II flmktionell verschiedene Formen der NAD-spezifischen GDH repr~sentieren. Wir postulierten, dal~ die GDII-I in funktioneller I-Iinsicht als normale ,,metabolische" oder ,,katabolische" Form der GDH anzusehen ist, w~hrend die GDH.II als ,,anabolische" Form bevorzugt an der Ammoniumassimilation beteiligt ist. Ws die organspezifischen GDIt-Isoenzymspektren bei Medlcago sativa stabil sind und sich weder im Verlaufe der Entwicklung noch bei Kultur auf versehiedenen N- Quellen ~ndern, zeigen die vorliegenden Ergebnisse ffir Pisum sagvum ein v611ig anderes Bild. Gerade der Befund, dab der junge Pisum-Sprol3 im Gegensatz zu Medicago ausschlieBlich das GDH-I-Isoenzymspektrum enth~lt und sich bier die Bildung der GDtI-II-Isoenzyme experimentell ausl6sen l~l~t, stfitzt unsere Arbeitshypothese. Solange der Pisum-SproB durch die Speichercotyledonen mit organischen N-Reserven versorgt wird, ist nur die ,,metabolische" GDH-I nachzuweisen. Die Bildung der ,,anabolischen" GDIt-II wird unter dem spezifischen Einflu~ der Cotyledonen unterdrfickt. In der ~lteren, N-autotrophen Pflanze fibernimmt die Wurzel die Rolle als primgrer N-Lie~erant. Zu diesem Zeitpunkt (etwa 14--20 Tage nach der Keimung) erscheinen im Spro~ erstmals schwach GDtt-II-Isoenzyme neben der GDH-I. Die bei der jungen Pflanze ausschlieSlich yon den Cotyledonen ausgehende Hemmwirkung auf die Bfldung der GDH-II, l ~ t sich nun, wenn auch abgeschw~cht und nicht vollst~ndig, ffir die Wurzel nachweisen.
Isoenzymspektrumder ~qAD-spezifischenGlutamatdehydrogenase
135
Wenn wir die GDH-II als ,,anabolische" Form der GDH ansehen, w/irde dieses Verhalten bedeuten, dab die Nitratreduktion und damit gekoppelt die Ammoniumasslmilation bei Pisum bevorzugt in der Wurzel erfolgt, eine Vorstellung, die nicht ganz in das Bfld zu passen scheint, dag bei den meisten hSheren Pflanzen der Sprog bevorzugter Ort der N-Assimilation sei (vgl. Beevers und Hageman, 1969). Aus den Untersuchungen von Wallace und Pate (1965, 1967) sowie Oghoghorie und Pate (1972) wissen wit jedoch, dag gerade Pisum Nitrat-N bevorzugt in der Wurzel reduziert und assimiliert. Einen verst/~rkten Nitrattransport in den Sprol~ und dort ablaufende Reduktion und Assimilation linden die Autoren erst bei relativ hohem Nitratangebot im N/ihrsubstrat. Dieser Befund steht in Einklang mit eigenen (unver6ffentlichten) Ergebnissen, die zeigen, dab die Intensit/~t des GDtI-II-Isoenzymspektrums im/Llteren Pisum.SproB mit steigender Nitratkonzentration im N/~hrmedium zunimmt. Die Bfldung des GDH-II-Isoenzymspektrums wird in vitro, z.B. in isolierten S10roBsloitzen dutch NH~-Ionen stimuliert und dureh Glucose wirkungsvoll unterdriickt. W/~hrend man in der Stimulierung dureh NIt +, die sich ja auch im in vivo-Versuch (s. Abb. 2) nachweisen 1/~$t, einen spezifisehen Effekt vermuten daft, l~gt sieh die Hemmwirkung durch Glucose nur sehwer deuten. Eine Klgrung des Effekts bleibt weiteren Versuchen vorbehalten. In diesem Zusammenhang sei auch die yon Pahlieh (1972) und Pablieh et al. (1972) naeh SO2-Begasung beobachtete 24ndertmg des GDH-Isoenzymsloektrums im Pisum-Sprog noehmals erw/~hnt. Aufgrund der vorliegenden Befunde ist es h6ehst unwahrscheinlieh, dag es sich bei diesem Effekt um eine sloezifische Wirkung des SOs handelt, wie sie yon den genannten Autoren diskutiert wird. Bei der beschriebenen Anderung der GDH-Isoenzymspektren stellt sieh die Frage nach dem Mechanismus, der dieser ~mderung zugrunde liegt. Aus den Untersuchungen von Pahlieh (1972) wissen wit, dal3 s/~mtliche GDH-Isoenzyme aus Pisum I-Iomopolymere mit identisehen Molekulargewiehten (Mol.-Gew. 208000) darstellen. Bei Medicago sativa kamen wir zu dem gleiehen Ergebnis (Hartmann et al., 1973). Pahlich nimmt an, dag es sich bei den individuellen Isoenzymen um Konformer eines Proteins handelt. Die GDH-I- und GDH-II-Isoenzymspektren bestehen aus je 7 Isoenzymen. Diese Zahl ist 101ausibel, wenn man davon ausgeht, dag je zwei untersehiedliehe oder verschieden modifizierte Untereinheiten zu einem Hexamer assozfieren. In weiteren Versuehen wird die Natur der Isoenzyme genau zu analysieren sein. Often ist im Augenbliek aueh noch die Frage, ob die Anderung des GDH-Isoenzymspektrums im Sprog allein auf Modifikation (oder Aktivierung) des im @rob vorhandenen Enzymmaterials zur/iekzuffihren ist,
136 T.Hartmann: Isoenzymspektrum derNAD-spezifisehen Glutamatdehydrogenase oder ob eine E n z y m n e u s y n t h e s e beteiligt ist. Die Frage ist vor allem deshalb schwer zu beantworten, well die qualitative Xnderung im Isoe n z y m s p e k t r u m nich$ allein zu einer merkHchen E r h 6 h u n g der in vitro meBbaren GDH-Aktivit/~t ffihrt, sondern gleichzeitig die kinetischen Eigenschaften der G D H modifizier$ werden. Untersuchungen zur K1/s rung dieser )'rage sind im Gange. Frau E. GieBler-Andersen danke ich ffir sorgf~ltige teehnische Assistenz. Literatur Beevers, L., Hageman, R. H. : Nitrate reduction in higher plants. Ann. t~ev. Plant Physiol. 20, 495--522 (1969). Hartmann, T., Nagel, IV[., Ilert, H.-I.: Organspezifische multiple Formen der Glutamatdehydrogenase in Medicaffo sativa. Planta (Berl.) 111, 119--128 (1973). Oghoghorie, C. G. 0., Pate, J. S. : Exploration of the nitrogen transport system of a nodulated legume using 15N. Planta (Berl.) 104, 35--49 (1972). Pahlich, E.: Sind die multiplen Formen der Glutamatdehydrogenase aus Erbsenkeimlingen Conformer ? Planta (Berl.) 104, 78--88 (1972). Pahlich, E., J~ger, H.'-J., Steubing, L.: Beeinflussung der Aktivit~ten yon Glutamatdehydrogenase und Glutaminsynthetase ans Erbsenkeimlingen dutch SO2. Angew. Bot. 46, 183--197 (1972). Wallace, W., Pate, J. S. : 1Nitrate reductase in the field pea (Pisum arvense L.). Ann. Botany 29, 655--671 (1965). Wallace, W., Pate, J. S.: Nitrate assimilation in higher plants with special reference to the eocklebur (Xanthium pennsysvanicum Wallr.). Ann. Botany 31, 213--228 (1967).
Endogen und exogen ausgelSste Anderung des Isoenzymspektrums der NAD-spezifischen Glutamatdehydrogenase im Sprol~ von Pisum sativum T. H a r t m a n n Pha,rmakognostisches Institut der Universit/~t, NuBallee 6 D-5300 Bonn, Bundesrepublik Deutschland Eingegangen am 8. Januar/26. Januar 1973 E n d o g e n o u s l y a n d E x o g e n o u s l y Caused A l t e r a t i o n of t h e I s o e n z y m e P a t t e r n of 5~AD-specific G l u t a m i e D e h y d r o g e n a s e in Shoots of Pisum sativum
Summary. The isoenzymes of NAD-specific glutamic dehydrogenase (GDH) of Pisum sativum, separated by polyaclTlamide gel electrophoresis, constitute two patterns, each of which covers seven individual isoenzymes. One pattern (GDH-I) is found in the cotyledons and young shoots. The second one (GDH-II) occurs together with at least some GDH-I isoenzymes in pea roots. In the shoots of older pea plants GDH-II isoenzymes become visible in addition to the GDtt-I pattern. Section of the cotyledons (but not of the roots) of young pea seedlings causes the formation of the complete GDH-II isoenzyme pattern in the shoots within a few hours. I t has been verified that the cotyledons specifically suppress the formation of the GDH-II pattern in the young shoot. In older plants which no longer depend on the cotyledons this effect is maintained somewhat less obviously by the root system. In experiments with isolated shoot segments or shoot tips it has been shown that NH + reinforces the formation of the GDH-II whereas glucose shows the opposite effect. The formation of the GDH-II isoenzymes in the presence of NH + is accompanied by an increase of the specific activity of GDH. Simultaneously the ratio of aminating activity (anabolic reaction) to deaminating activity (catabolic reaction) changes in favor of the anabolic reaction. The results support the supposition that the GDH-I and GDtt-II isoenzyme patterns correspond to different molecular forms of one enzyme, the GDH-II representing a form with predominantly anabolic function and the GDH-I a form which has merely metabolic or catabolic function. I n einer v o r a u s g e g a n g e n e n Mitteflung zeigten ~ r , d a $ die m u l t i p l e n F o r m e n d e r NAD-spezffisehen G l u t a m a t d e h y d r o g e n a s e ( G D H ) bei Medicago sativa stabile a n d streng organspezifische I s o e n z y m s p e k t r e n bflden ( I I a r t m a n n et al., 1973). A u s einer kfirzlich y o n P a h l i c h (1972) 9*
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T. Hartmann:
publizierten Arbeit ist zu entnehmen, dab ~hnliche GDH-Isoenzymspektren auch in P i s u m sativum vorzuliegen seheinen. Pahlich berichtet weRerhin fiber eine dureh S02-Begasung induzierte ~nderung des Isoenzymspektrums in Erbsensprossen. Dieser im Zusammenhang mit unserer Vorstellung, dab die organspezifischen Isoenzymspektren funktionell verschiedene Formen der NAD-spezifisehen GDH darstellen, sehr interessante Befund, veranlaBte uns, die Isoenzymspektren der GDH aus P i s u m genauer zu untersuehen.
Methoden Die Anzucht der Erbsenkeimlinge (Pisum sativum ,,Reisererbsen") erfolgte in feuchtem Sand. Zur Extraktion des Pflanzenmaterials und gelelektrophoretischen Auftrennung der GDH-Isoenzyme s. Hartmann et al. (1973). Als Ausgangsmaterial ifir quantitative GDH-Bestimmungen dienten frisch bereitete Acetonpulver. 200 mg Acetonpulver wurden mit 5 ml Tris-HC1 (0,1 M; pH 7,8) extrahiert nnd im Viscing-Dialyseschlauch 16 Std gegen H20 dialysiert. Die spektralphotometrische Bestimmung der GDH-AktivitEt wurde unter Beriicksichtigung folgender ~a~derungen nach Hartmann et al. (1973) durchgeifihrt: der pH-Wert im MeBansatz fiir die reduktive Aminierung betrug 7,8. Der MeBansatz fiir die oxydative Desaminierung wurde mit 0,2 ml L-Glutamat (0,7 M) gestartet, Hydrokulturen wurden in ttoagland-LSsung angesetzt, die als N-Quelle wahlweise/qO~ (0,015 M), NH~ (0,005 M) oder 0,1% Caseinhydrolysat (HYCASE-SF, Serva) enthielt. Alle Kulturen wuchsen im 10:14 Std Licht-Dunkelwechsel bei 24--27~ in sterilisierter N~hrlSsung. Die Iq~hrlSsung mit HYCASE-SF wurde 2mal tEglich gewechselt. Alle Infiltrationsversuche mit isolierten SproBsegmenten erfolgten in 0,02 M Phosphatpuffer pH 6,0 bei Raumtemperatur.
Ergebnisse In Abb. 1 sind die GDH-Isoenzymspektren yon Samen, Cotyledonen Sprossen und Wurzeln junger und ~lterer P i s u m sativum-Pflanzen wiedergegeben. J~hnlieh wie bei Medicago sativa kann man die GDHIsoenzyme aus P i s u m zwei Grundspektren zuordnen, die wir analog als GDH-I (Isoenzyme al bis a7) und GDH-II (Isoenzyme b l bis bT) bezeichnen wollen (Hartmann et al., 1973). Bei P i s u m setzen sich beide Spektren aus je 7 Isoenzymen zusammen. Die Intensit~t der nach Substratf~rbung naehweisbaren Formazanbanden nimmt in der Regel bei beiden Spektren graduell in anodiseher (GDH-I) bzw. kathodiseher Riehtung (GDtLII) ab, so dab die auf gleicher HShe liegenden, vermutlich identischen Isoenzyme al und bt am farbintensivsten erseheinen. Nicht berficksiehtigt ist in Abb. 1, dal3 sieh die 7 GDIt-I-Isoenzyme unter optimalen Elektrophoresebedingungen noehmals in zwei dicht beieinanderliegende Banden auftrennen lassen.
Isoenzymspektrum der NAD-spezifischen Glutamatdehydrogenase Cotyled,
SproB
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Abb. 1. Isoenzymspektren der NAD-spezifischen GDH nach PolyacrylamidGelelektrophorese in jungen und Elteren Cotyledonen, Sprossen und Wurzeln yon Pisum 8ativum. Isoenzymeal bis a7 = GDH-I, Isoenzymebl bis b7 ~ GDtt-II
Wie bei Medicago enthalten Pisum-Samen und -Cotyledonen nur die GDH-I-Isoenzyme. In den Wurzeln junger Pisum-Pflanzen sincl anders als bei Medicago neben den GDH-II-Isoenzymen s/~mtliche GDH-I-Isoenzyme nachweisbar. M]t zunehmendem Alter nimmt jedoch die Intensitar der GDH-I-Isoenzyme merklich ab. Der Hauptun~erschied zur Luzerne liegt im Isoenzymspektrum des Sprosses, das sich bei jungen Erbsenpflanzen nicht yore Samenspektrum unterscheidet. Die GDH-IIIsoenzyme tauchen bier erst 1 4 - 2 0 Tage nach der Aussaat auf und bleiben auch im weiteren Verlau~ der Entwicklung vergleichsweise schwach. Anders als bei Medicago sativa sind die Wurzel- und SproBIsoenzymspektren bei Pisum also nieht yon Beginn an konstant, sondern Kndern sieh im Verlaufe der Entwicklung. Uns interessierte vor allem die •rage nach den mSglichen endogenen Faktoren, die ffir diese J~nderung verantwortlich sind. Das ~Erscheinen der GDH-II-Isoenzyme im iflteren ErbsensproB legt eine Beziehung zum Wechsel yon der N-heterotrophen zur N-autotrophen Phase der Keimlingsentwiek]ung nahe. Wir prfiften deshalb, ob sich das Isoenzymspektrum im Erbsenspro$ Kndert, wenn man junge Keimlinge durch Sektion der Cotyledonen yon ihrer natfirlichen Iq-Quelle abschneidet and gleichzeitig auf exogene N-Versorgung umstellt. Das Ergebnis eines en~prechenden Versnchs ist in Abb. 2 wiedergegeben. Bei Keimlingen, die 2 Tage ohne Cotyledonen in Flfissigkeitskultur auf N-freiem Medium oder in Gegenwart verschiedener N- Quellen gehalten wurden, lassen sich im Spro$ ohne Ausnahme s~mtliche GDH-II-Isoenzyme naehweisen. Die entsprechenden Kontrollpflanzen mit Cotyledonen enthalten unveri~nder~ nur das GDH-I-Isoenzym-
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Abb. 2. Anderung des GDH-Isoenzymspektrumsim SproB yon Pisum sativum nach Cotyledonensektion. 6 Tage alte Keimlinge wurden mit Cotyledonen (~-) und ohne Cotyledonen(--) 48 Std (A) bzw. 8 Tage (B) in ttydrokultur auf den angegebenenN-Quellen gehalten und dann zum Isoenzymnachweisaufgearbeitet
spektrum. Li~ngere Versuchsdauer ffihrt zu einer weiteren Veri~nderung der Isoenzymspektren, dabei tritt vor allem der unterschiedliche EinfluB der exogenen N-Quellen deutlich in Erscheinung. Nach 8 Tagen weisen ,,Ammoniumpflanzen" unabh~ngig davon, ob die Cotyledonen entfernt wurden oder an der Pflanze verblieben, nahezu reine GDH-ILIsoenzymspektren auf. In Gegenwart aller anderen N-Quellen oder bei N-~reier Kultur sind die GDH-II-Isoenzyme unverRndert nur in Pflanzen ohne Cotyledonen nachzuweisen. Bei den auf Caseinhydrolysat gehaltenen Pflanzen ist das nach 2 Tagen deutlich nachweisbare GDH-II-Isoenzymspektrum weitgehend wieder riickgebildet, wiihrend die GDH-I-Isoenzyme gut erhalten sind. Bei einer kritischen Bewertung dieser Befunde mul~ allerdings beriicksichtigt werden, dab die Cotyledonensektion, wie zu erwarten, bei allen Pflanzen zu einer merklichen Wachstumshemmung ffihrt und vor allem Ammoniumstickstoff bei 1Rngerer Kulturdauer ( ~ 5--10 Tage) toxische Nebeneffekte zeigt. Die Auswirkung der Cotyledonensektion auf das GDH-Isoenzymspektrum der Wurzel ist weir weniger signiHl~ant und betrifft ausschlie]~lich die GDH-I-Isoenzyme. Diese Effekte sollen hier unberficksichtigt bleiben. Die vorliegenden Ergebnisse machen deutlich, dab die Bildung der GDIt-II-Isoenzyme im jungen Erbsenspro~ durch die Cotyledonen unterdrfickt wird. Dieser ,,Cotyledoneneffekt" ist in der jungen Pflanze spezifisch. Entfernt man an Stelle der Cobyledonen die Wurzel, so Rndert sich das Isoenzymspektrum nicht. In isolier~en Sprol3sl)itzen 7 Tage alter Keimpflanzen ist das komplette GDtt-II-Isoenzymspektrum
Isoenzymspektrum der lqAD-spezifischen GlutamaMehydrogenase
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bereits nach 6 Std nachzuweisen. Mit zunehmendem Alter der Pflanzen dauert der Vorgang liinger. Nach dem natfirlichen Absterben der Cotyledonen sind die GDH-II-Isoenzyme im SproBspektrum - - wie bereits erw/ihn~ (Abb. 1) - - auch ohne experimentellen Eingriff schwach, aber deutlich nachzuweisen. Zu diesem Zeitpunkt ffihr~ anders als bei der jungen Pflanze, die Sektion des Wurzelsystems zu einer verstark~en Bildung tier GDH-II-Isoenzyme. Der ,,Cotyledoneneffekt" geht also, wenn auch abgeschw/~cht in der/ilteren, roll N-autotrophen Pflanze auf die Wurzel fiber. In Infiltrar mit isolierten Sprol]spitzen untersuchten den Einflu6 verschiedener Substanzen auf die Bfldung der G D t L I I Isoenzyme. Aminos/~uren und Aminos~urengemische haben keinen oder einen schwach hemmenden (z. B. L-Aspartat und L-Leucin) EinfluB auf die GDH-II-Bildung. Ni~rat verh/tlt sich indifferent, w/ihrend 57H~Ionen als einzige der fiberpriiften Substanzen die Bildung der GDH-IIIsoenzyme begfinstigen. In Gegenwart yon 10-a bis 10-2 M NH~ ist in 7 Tage alten Erbsensprossen das GDH-II-Isoenzymspektrum bereits nach 4 Std naehzuweisen. Besonders deutlieh ist die NH~-Aktivierung bei etwas/~lteren Pflanzen, mit bereits abgeschw/ich~em ,,Cotyledoneneffekt", nachzuweisen. Die einzige Substanz mi~ der sich die GDH-IIBildung wirkungsvoll unterdrficken 1/~l]t, ist fiberraschenderweise Glucose. In Gegenwart yon 5 % Glucose ist das GDH-II-Isoenzymsloektrum auch in jungen SproBspitzen nach einer Inkubationsdauer yon 24 Std nut in Spuren nachzuweisen. Die durch Cotyledonensektion ausgel6ste und NI-I~ verst/~rkte Bfldung der GDH-II-Isoenzyme wird dutch Licht nicht beeinfluBt. Sis ist in Dunkelkeimlingen ebenso deutlich nachweisbar, wie bei Lichtpflanzen. Pisum-Cotyledonen/~ndern ihr GDIt-Isoenzymspektrum auch bei mehrt/~giger Infiltration mi~ 57It~ nicht. Sie enthalten bis zu ihrem natfirlichen Absterben ausschlieBlich die GDH-I-Isoenzyme. Tabelle 1. Quantitative _~mderung der GDH-Aktivit~t im isolierten Erbsenspro] nach Infiltration mi~ l~H+-Puffer. Inkubation 24 Std in 0,02 M Phosphatpuffer pH 6,0-~ 5 • 10-a M (NH4)~SO~. Spez. Akt.: A E~0/min und mg Protein l~aterial
Red. Aminierung spez. Akt.
SproBspitze (7d) A: Inkub. NtI+ 1,860 K: Kontrolle 0,368
Quotient A/K
5,1
Oxyd. Desuminierung Verh~ltnis: red. spez. Quotient Aminierung Akt. A/K oxyd. Desaminierung
0,218 0,086
2,5
8,5:1 4,3 : 1
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T. Har~mann:
Die qualitative ~nderung des GDH-Isoenzymspektrums im isolierten Erbsensprol~ ist auch in quantitativer ttinsicht bemerkenswert. Inkubiert man die Sprol~spitzen 7 Tage alter Pflanzen 24 Std in l~Itt~-Puffer, so erhSht sich die spezifische Aktivit~t der GDH im Vergleich zur Kontrolle merklich (Tabelle 1). Gleichzeitig sind erhebliche ~nderungen in der Enzymkinetik festzustellen. Besonders auff~llig ist unter konstanten Me~bedingungen die Verschiebung des Reaktionsverh~ltnisses der reversiblen Reaktionen zugunsten der reduktiven Aminierung yon ~-Ketoglutarat (Tabelle 1). Eine ~hnliche Verschiebung des Reaktionsverh~ltnisses beobachtete auch Pahlich (1972) nach Begasung yon Erbsensprossen mit S02. Diskussion Die in verschiedenen Organen yon Pisum sativum nachweisbaren Isoenzyme der NAD-spezifischen GDIt lassen sich wie bei Medicago 8ativa (Hartmann et al., 1973) zwei Grundspektren zuordnen, die wir als GDtI-I und GDH-II bezeichnen. In beiden Pflanzen ist die GDH-II immer im Wurzelsystem zu linden und fehlt in den Speichercotyledonen. Bereits bei den Untersuchungen an Medicago ~u~erten wir aufgrund der organspezifischen Verteilung beider Isoenzymspektren die Vermutung, da~ die GDtI-I und GDtI-II flmktionell verschiedene Formen der NAD-spezifischen GDH repr~sentieren. Wir postulierten, dal~ die GDII-I in funktioneller I-Iinsicht als normale ,,metabolische" oder ,,katabolische" Form der GDH anzusehen ist, w~hrend die GDH.II als ,,anabolische" Form bevorzugt an der Ammoniumassimilation beteiligt ist. Ws die organspezifischen GDIt-Isoenzymspektren bei Medlcago sativa stabil sind und sich weder im Verlaufe der Entwicklung noch bei Kultur auf versehiedenen N- Quellen ~ndern, zeigen die vorliegenden Ergebnisse ffir Pisum sagvum ein v611ig anderes Bild. Gerade der Befund, dab der junge Pisum-Sprol3 im Gegensatz zu Medicago ausschlieBlich das GDH-I-Isoenzymspektrum enth~lt und sich bier die Bildung der GDtI-II-Isoenzyme experimentell ausl6sen l~l~t, stfitzt unsere Arbeitshypothese. Solange der Pisum-SproB durch die Speichercotyledonen mit organischen N-Reserven versorgt wird, ist nur die ,,metabolische" GDH-I nachzuweisen. Die Bildung der ,,anabolischen" GDIt-II wird unter dem spezifischen Einflu~ der Cotyledonen unterdrfickt. In der ~lteren, N-autotrophen Pflanze fibernimmt die Wurzel die Rolle als primgrer N-Lie~erant. Zu diesem Zeitpunkt (etwa 14--20 Tage nach der Keimung) erscheinen im Spro~ erstmals schwach GDtt-II-Isoenzyme neben der GDH-I. Die bei der jungen Pflanze ausschlieSlich yon den Cotyledonen ausgehende Hemmwirkung auf die Bfldung der GDH-II, l ~ t sich nun, wenn auch abgeschw~cht und nicht vollst~ndig, ffir die Wurzel nachweisen.
Isoenzymspektrumder ~qAD-spezifischenGlutamatdehydrogenase
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Wenn wir die GDH-II als ,,anabolische" Form der GDH ansehen, w/irde dieses Verhalten bedeuten, dab die Nitratreduktion und damit gekoppelt die Ammoniumasslmilation bei Pisum bevorzugt in der Wurzel erfolgt, eine Vorstellung, die nicht ganz in das Bfld zu passen scheint, dag bei den meisten hSheren Pflanzen der Sprog bevorzugter Ort der N-Assimilation sei (vgl. Beevers und Hageman, 1969). Aus den Untersuchungen von Wallace und Pate (1965, 1967) sowie Oghoghorie und Pate (1972) wissen wit jedoch, dag gerade Pisum Nitrat-N bevorzugt in der Wurzel reduziert und assimiliert. Einen verst/~rkten Nitrattransport in den Sprol~ und dort ablaufende Reduktion und Assimilation linden die Autoren erst bei relativ hohem Nitratangebot im N/ihrsubstrat. Dieser Befund steht in Einklang mit eigenen (unver6ffentlichten) Ergebnissen, die zeigen, dab die Intensit/~t des GDtI-II-Isoenzymspektrums im/Llteren Pisum.SproB mit steigender Nitratkonzentration im N/~hrmedium zunimmt. Die Bfldung des GDH-II-Isoenzymspektrums wird in vitro, z.B. in isolierten S10roBsloitzen dutch NH~-Ionen stimuliert und dureh Glucose wirkungsvoll unterdriickt. W/~hrend man in der Stimulierung dureh NIt +, die sich ja auch im in vivo-Versuch (s. Abb. 2) nachweisen 1/~$t, einen spezifisehen Effekt vermuten daft, l~gt sieh die Hemmwirkung durch Glucose nur sehwer deuten. Eine Klgrung des Effekts bleibt weiteren Versuchen vorbehalten. In diesem Zusammenhang sei auch die yon Pahlieh (1972) und Pablieh et al. (1972) naeh SO2-Begasung beobachtete 24ndertmg des GDH-Isoenzymsloektrums im Pisum-Sprog noehmals erw/~hnt. Aufgrund der vorliegenden Befunde ist es h6ehst unwahrscheinlieh, dag es sich bei diesem Effekt um eine sloezifische Wirkung des SOs handelt, wie sie yon den genannten Autoren diskutiert wird. Bei der beschriebenen Anderung der GDH-Isoenzymspektren stellt sieh die Frage nach dem Mechanismus, der dieser ~mderung zugrunde liegt. Aus den Untersuchungen von Pahlieh (1972) wissen wit, dal3 s/~mtliche GDH-Isoenzyme aus Pisum I-Iomopolymere mit identisehen Molekulargewiehten (Mol.-Gew. 208000) darstellen. Bei Medicago sativa kamen wir zu dem gleiehen Ergebnis (Hartmann et al., 1973). Pahlich nimmt an, dag es sich bei den individuellen Isoenzymen um Konformer eines Proteins handelt. Die GDH-I- und GDH-II-Isoenzymspektren bestehen aus je 7 Isoenzymen. Diese Zahl ist 101ausibel, wenn man davon ausgeht, dag je zwei untersehiedliehe oder verschieden modifizierte Untereinheiten zu einem Hexamer assozfieren. In weiteren Versuehen wird die Natur der Isoenzyme genau zu analysieren sein. Often ist im Augenbliek aueh noch die Frage, ob die Anderung des GDH-Isoenzymspektrums im Sprog allein auf Modifikation (oder Aktivierung) des im @rob vorhandenen Enzymmaterials zur/iekzuffihren ist,
136 T.Hartmann: Isoenzymspektrum derNAD-spezifisehen Glutamatdehydrogenase oder ob eine E n z y m n e u s y n t h e s e beteiligt ist. Die Frage ist vor allem deshalb schwer zu beantworten, well die qualitative Xnderung im Isoe n z y m s p e k t r u m nich$ allein zu einer merkHchen E r h 6 h u n g der in vitro meBbaren GDH-Aktivit/~t ffihrt, sondern gleichzeitig die kinetischen Eigenschaften der G D H modifizier$ werden. Untersuchungen zur K1/s rung dieser )'rage sind im Gange. Frau E. GieBler-Andersen danke ich ffir sorgf~ltige teehnische Assistenz. Literatur Beevers, L., Hageman, R. H. : Nitrate reduction in higher plants. Ann. t~ev. Plant Physiol. 20, 495--522 (1969). Hartmann, T., Nagel, IV[., Ilert, H.-I.: Organspezifische multiple Formen der Glutamatdehydrogenase in Medicaffo sativa. Planta (Berl.) 111, 119--128 (1973). Oghoghorie, C. G. 0., Pate, J. S. : Exploration of the nitrogen transport system of a nodulated legume using 15N. Planta (Berl.) 104, 35--49 (1972). Pahlich, E.: Sind die multiplen Formen der Glutamatdehydrogenase aus Erbsenkeimlingen Conformer ? Planta (Berl.) 104, 78--88 (1972). Pahlich, E., J~ger, H.'-J., Steubing, L.: Beeinflussung der Aktivit~ten yon Glutamatdehydrogenase und Glutaminsynthetase ans Erbsenkeimlingen dutch SO2. Angew. Bot. 46, 183--197 (1972). Wallace, W., Pate, J. S. : 1Nitrate reductase in the field pea (Pisum arvense L.). Ann. Botany 29, 655--671 (1965). Wallace, W., Pate, J. S.: Nitrate assimilation in higher plants with special reference to the eocklebur (Xanthium pennsysvanicum Wallr.). Ann. Botany 31, 213--228 (1967).
