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Enantioselektivitiit der Biotransformation eines neuen Theophyllindenvats

Enantioselektivitat der Biotransformation eines neuen Theophyllinderivats*) Christian Harschea),Herbert OelschlageB)*und Jiirgen Engelb) Institut fiir PharmazeutischeChemie der Johann Wolfgang Goethe-Universitat,Georg-Voigt-Str. 14, D-6000 Frankfurt am Main b,

Pharma-Forschung der ASTA-Pharma, D-6000 Frankfurt am Main

Eingegangen am 14. August 1991

7-((RS)2-((RS)-1 -Methyl-2-phenylethylamino)propyl)-theophyllin 3 laDt sich vorteilhafter durch reduktive Aminierung von 7-Acetonyltheophyllin (4) mit (RS)-Amphetamin (2) (Diastereomerenverhhltnis 1:1) als durch SN-ReaktiOn von Proxyphyllintosylat mit (RS)-2 darstellen (Diastereomerenverhdtnis 9:l). 3 ist infolge sterischer Hinderung praktisch kein Rodrug mehr fiir die intermediiire Bildung von (RS)-2 (Ratte). Die Enantioselektivitiit des nach oraler Gabe im 24-h Ham in Mengen von ca. I% der Dosis aus 3 gefundenen (RS)-2 wurde HPLC auf einer Cyclobond-Saule iiber seine Isoindolderivate, gebildet aus o-Phthalaldehyd, Thioglykolsaure und 2, zu 65.2% (Bereich 63-688) S(+)- und 34.8% R(-)-Amphetamin (Bereich 32-37%) bestimmt.

Problemstellung Fenetyllin ([email protected],1) wird seit iiber 23 Jahen erfolgreich zur Therapie des hyperkinetischenSyndroms bei Kindem eingesetzt”. Im Vergleich rnit Amphetamin (2) und verwandten Psychostimulantien tritt nach seiner Gabe psychische Abhiingigkeit wesentlich seltener ein”. Neuere Untersuchungen betonen sein eigenstiindiges Wirkprofil*)und folgem daraus, da6 1 zu Unrecht untes die Betiiubungsmittelverschreibungsverordnung gestellt worden ist, weil es in gewissem Umfang ein Prodrug fiir 2 ist. Unsere Arbeitsgruppe beschiiftigt sich seit geraumer %it rnit der Frage der Stereoselektivitiit des Metabolismus von 1zu 2 sowohl an der Ratte als auch am Menschen. Die Versuche an Ratten (Schlundsondierung) fiihrten zu dem Ergebnis, da6 die oxidative N-Dealkylierung von 1 unter Bildung von 2 nicht stereospezifisch,sondern stereoselektivverltiuft. Das entstandene Amphetamin setzt sich im Durchschnitt (n = 6) aus 63.3% S(+)- und 36.7% R(-)-Enantiomer zusammen. Das VerhlUUtnis S zu R der Stereoisomeren betriigt somit 1.7S3? Die Versuche an Probanden (n = 6) ergaben nach oraler Gabe fur 2 ein Verhamis von S zu R von 1.32, also im Mittel einen Anteil von rund 57% S(+)-Amphetamin3), dessen zentralstimulierende Wirkung 3-Smal @ b r ist als die des R(-)-Enantiomeren4’. Unter quantitativen Aspekten wurde bei der Ratte nach oraler Applikation von 10-50 m a g 1eine Bildung von (RS)-2 zu ca. 4.3% der Dosis (Bereich 2.5-6.84). beim Menschen nach oraler Dosis von SO mg 1durchschnittlich 11.3% (Bereich 5.5-16.9%), ermittelt3! Diese Ergebnisse wurden mit Hilfe einer von Oefschfigerund Fend?) entwickelten Reaktion erzielt, die auf der Bildung der S(-)-Phenylethylisocyanat- (= PEIC) Derivate und HPLCT r e ~ ~ der n gbeiden Stereoisomereals Diastereomereberuht. Die Derivatisierung von Amphetamin, aber auch von Fenetyllin, mit S(-)-PEIC verlauft in unprotischen Uisungsmitteln (z.B. Diethylether oder Ethylacetat) nach halbstiindiger Reaktion nahezu quantitativ.

Ziel unserer z.Zt. laufenden prap. Bemiih~ngen~) ist es, biotransformationsstabile Fenetyllinderivate zu finden, deren pharmakodynamisches Profil im Rahmen des Fenetyl*)

Enantioselective Blotransformation of a New Theophylline Derivative Reductive amination of 4 with (RS)-2 is an improved method to obtain 7-((RS)2-((RS)-l-Methyl-2-phenylethylamino)propyl)-theophylli~(3) (ratio of diastereomers 1:l) compared with SN-displacement of proxyphyllintosylate with (RS)-2 (ratio of diastereomers 9:l). Due to steric hindrance 3 is no noteworthy prodrug for the intermediate formation of (RS)-2 in rats. The enantioselectivity of 2 after a single oral dose of 3 is determined in 24-h urine by HPLC on a Cyclobond-column using the isoindole derivatives, formed from o-phthalaldehyde. thioglycolic acid, and 2. The R(-)-amphetamine isomer is formed to a lesser amount (34.8%, range 32-37%) than the S(+)-isomer (65.22, range 6348%).

Iin-Profils liegt, die aber kein Prodrug fur 2 darstellen. iiber eine erste Substanz, die diesen Anfordemngen entsprechen konnte, haben wir bereits berichtet6).

Ergebnisse Das 7-((RS)2-((RS)-1-Methyl-2-phenylethylamino)propy1)-theophyllin (3) wurde durch Umsetzung von (RS)Proxyphyllintosylat rnit iiberschiissigem (RS)-2 bei 150°C in 35~1-02,Ausbeute (Diastereomerenverhaltnis 9: 1, ‘HNMR-Spektrum) erhalted). Vorteilhafter l%t sich 3, wie wir fanden, durch reduktive Aminiemng von 7-Acetonyltheophyllin (4)’) mit (RS)-2 unter Normaldruck und 6OoC bei Einsatz eines 5proz. Pd-Katalysators gewinnen (Diaste1:I, genau 495 1 ‘H-NMR-Spekreomerenverhiiltnis trum). Die Ausbeute betragt 52%, wahrend die SN-Reaktion nur 35% erbrachte. 3 besitzt 2 Chiralitatszentren,dernzufolge sind 2 Enantiomerenpaare moglich, die auf einer Chiralcel OD-Saule nachgewiesen werden konnten. 3 wurde als Diastereomerengemisch an Mausen im Vergleich mit (RS)-2 und 1auf motorische Aktivitat im Motility-Test nach Boissier und auf psychostimulierende Wirkung im Tail-Suspension-Test geprtift, wobei die tierpharmakologischen Befunde gut rnit dem pharmakologischen Wirkprofil von 1,nicht aber mit dem von (RS)-2 iibereinstimmten6). Hinsichtlich der Biotransformation von 3 zeigten Versuche an Ratten (n = 8, orale Gabe), daE durchschnittlich nur 1% der theoretisch moglichen Menge (RS)-2 bei der Korperpassage gebildet wird, was bedeutet, daB 3 im Vergleich zu 1lediglich zu 115 in Richtung auf 2 metabolisiert wird6).

-

H e m Prof. Dr.M.Protiva, Prag, in freundschaftlicherVerbundenheit zum 70. Geburtstag gewidmet.

Arch. Pharm. (Weinheim) 325,593-595 (1992)

OVCH VerlagsgesellschaftmbH, D-6940 Weinheim, 1992 0365-6233/92/0909-0593 S 3.50 + .1-5/0

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Harsche, Oelschlgger und Engel

1

CH3

mit Thiolen und primaren Aminen unter Bildung von Isoindoldenvaten an. Anstelle des bevorzugten wenig polaren P-Mercaptoethanols wurde Thioglycolsaure (TGA) als Thiol eingesetzt, da die TGA-Isoindolderivate von 2 aufgrund der starken Polaritat der Carboxylgruppe leichter von der verwendeten Cyclobond-I-Saule eluieren.

2

TGA-lsohdol-derivat

Abb. 3: Reaktion von 2 mit o-Phthalaldehyd und Thioglykolsiiure

-4

CH3

Abb. 1: Formeln der Verbindungen 1-4 0

1

0

1

1

H

,

1

10 20 30 40

1

1

1

1

I

2 622 8J

Neben dem Vorteil der sehr kurzen Dauer (1 min) der Derivatisierungsreaktion bietet das Verfahren auch die Moglichkeit, eine enantioselektive HPLC fur 2 im Reversed-Phase-Modus durchzufuhren. Die quantitative HPLCAnalytik von Amphetaminen durch Pre-column-Derivatisierung mittels dieser Reaktion wurde bereits 1982 von Fame11 und JefSeries") entwickelt, aber die Frage der Stereoselektivitat hatten die Autoren ausgeklammert. Das UV-Absorptionsmaximum des TGA-Isoindolderivats liegt in ijbereinstimmung mit analogen Isoindolderivaten bei 340 nm. Unter diesen Bedingungen erhielten wir eine sehr gut analytisch verwertbare Trennung der Enantiomeren (o! = 1.08, R = 1.3).

-

t hinl Abb. 2: Trennung von 3 in die Stereoisomeren t

In

Eine offene Frage war nun, in welchem Verhalmis die Stereoisomeren von 2 bei der Biotransfonnation von 3 durch die Ratte entstehen. Da die Abklarung der Stereoselektivitat iiber die PEIC-Derivate, also als Diastereomere, durch HPLC auf achiralen Saulen einen erheblichen expenmentellen Mehraufwand impliziert, haben wir den Versuch unternommen, eine direkte HPLC-Trennung der Enantiomeren von 2 auf chiralen Saulen als Isoindolderivate durchzufuhren. Erfolgreiche Versuche, eine Trennung auf chiralen Saulen durch Normalphasenchromatographiezu erreichen, wurden bereits von Nagai und Kamiyama') sowie von Doyle und Brunnep) durchgefuhrt, nachdem die Enantiomere von 2 in ihre Benzoylderivate bzw. 3,5-Dinitrobenzoylderivate ubergefiihrt worden sind. Ein Nachteil dieser Verfahren ist aber, daL3 zunachst zeitaufwendig die Amide durch 20 min Reaktion in wasserfreiem Milieu hergestellt und danach extrahiert werden mussen. Unser analytisches Verfahren lehnt sich an die von Sirnons und J ~ h r n o n gefundene ~~) Reaktion von o-Phthalaldehyd

b

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Abb. 4: Trennung der TGA-Isoindol-Derivate von 2

Im 24-h Sammelham von 6 mannlichen White WistarRatten (250-300 g) wurden nach einmaliger oraler Gabe (Schlundsondierung von 80 [email protected] von 3 als Diastereomerengemisch) die durch oxidative N-Dealkylierung gebildeten 2-Enantiomeren bestimmt. Tab. 1 zeigt, da8 R(-)-2 zu durchschnittlich 34.8% (Bereich 32-3796) und S(+)-2 zu 65.2% (Bereich 63-68%) gebildet wird. Die Gesamtmenge an durch Biotransformation entstandenem 2 liegt, wie bereits berichtet6', bei ca. 1% der applizierten Dosis 3. Dem Fonds der Chemischen Industrie, Frankfurt a.M., und der Deutschen Forschungsgemeinschaft, Bonn-Bad Godesberg, sind wir fur die F6rderung vorstehender Arbeit verbunden. Herrn Dr.D.Rorhley danken wir fur wenvolle Diskussionen.

Arch. Pharm. (Weinheim)325,593-595 (1992)

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Enantioselektivitiit der Biotransformation eines neuen Theophyllinderivats

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o

io

20

[email protected]&

3.96 (m; 4H. N-CH2), 3.41 und 3.36 (s; 3H, N-CH,, N-3), 3.23 und 3.19 (s; 3H, N-CH3, N-l), 3.13-3.05 (m; 2H, CH-N), 2.80-2.76 (m; 2H, N-CH), 2.71-2.65 und 2.41-2.31 (2m; 2H, CH2-Phenyl), 1.34 und 1.22 (s; IH, NH, aust.), 0.91 und 0.85 (d;J = 7 Hz, 3H, N-CH2-CH-CH3),0.89 und 0.76 (d; J = 7 Hz, 3H, Phenyl-CH2-CH-CH3). SI.1

Biotransformation

-

t lminl

Abb. 5: HPLC-Chromatogramm (24-h Ham) der Amphetamin-Enantiomere und intemer Standard (Phenylethylamin)

Tab. 1: R(-)- und S(+)-Amphetamin (in %) im 24-h Ham, entstanden durch Biotransformation von 3

R(-)-Amphetamin

S(+)-Amphetamin

32 35 34 37 36 35

68 65 66 63

Ratte 1 Ratte 2 Ratte 3 Ratte 4 Ratte 5 Ratte 6

64 65

An 6 manniiche White-Wistar Ratten (250-300 g, Fa. Ivanowas, KisslegglBRD) wurde 3-Hydrochlorid oral (80 [email protected]) als waSrige Losung per Schlundsonde appliziert. In Stoffwechselkatigen wurde der 24-h Ham gesammelt und sofort aufgearbeitet. Die Urinproben wurden mittels Festphasenextraktion iiber Bondelut Certify-Kartuschen (ICT, Frankfurt) nach der von Analytichem International empfohlenen Methode extrahiert. Die Eluate wurden im trockenen N2-Strom bei 35°C eingeengt, der Ruckstand wurde in 1 ml H20 gelost. Nach Zugabe von 100 p1 o-Phthaldialdehyd-Rz. (Fa. Sigma-Chemie, Deisenhofen, BRD, ohne Thiolzusatz; das Rz. enthat 50 mg o-Phthaldialdehydund 3 g Borsaure in 100 ml H20, eingestellt auf pH 10.5) und 100 p1 ThioglycolsSurel6sung (100 pl TGA auf 15 ml Methanol) wurde 1 min geschiittelt und danach mit Eluens verdiinnt. Zur HPLC-Untersuchung wurden 20 p1 eingesetzt.

HPLC-Parameterf i r Amphetamin ERMA ERC-7210, UV-Detektor h = 340 nm.- Saule: Cyclobond-I (250/4.6 mm, Astec).- Eluens: 18 Teile Acetonitril (Merck), 82 Tei1e.- 20 mmol NH4N03/2 mmol Tetrabutylammoniumbromid (Fluka) Puffer, pH 6.15 (isokratisch).- Flow rate: 1.5 ml/min.- Int. Standard PhenylethylaminHCl(50 pglml), Schmp. 221°C.

HPLC-Parameterfiir IEnanriomere

Experimenteller Teil

Shimadzu SPDdA, UV-Detektor h = 271 nm.- Saule: Chiralcel OD (250/4.6 mm, Daicel).- Eluens: Hexaflthanol (99 + l)/plus 0.1 ml Triethylamin.- Flow rate: 1.0 ml/min.

Synthese von 7-((RS)2-((RS)-l -Methyl-2-phenylethylamino)propyl)-theophyllin (3)

Literatur

1.5 g (0.0064 mol) 7-Acetonyltheophyllin,bereitet aus Theophyllin-KSalz und Chloraceton gem56'). und 1.8 g (0.0132 mol) racem. Amphetaminbase werden in 70 ml wasserfreiem Ethanol unter Zugabe von 300 mg 5proz. Pd/C-Katalysator und 2 g getrocknetem Na2S04 bei 60°C unter Nonnaldruck bis zur Beendigung der H2-Aufnahme hydriert (= 4 h). Man l a t abkiihlen, filaiert und destilliert das Losungmittel i.Vak. ab.- Der Ruckstand wird sc iiber 70 g Kieselgel Woelm TSC (Saule 50 x 2.5 cm) mit Ethylacetat/Ethanol(95 + 5) gereinigt. Die Produkt-Fraktionen werden vereinigt (dc Priifung) und i.Vak. eingeengt. Das zuriickbleibende 61 wird in Diethylether gelost und mit etherischer HCI versetzt: Hydrochlorid als 1: 1 Diastereomerengemisch. Schmp. der farblosen Kristalle 234-241"C. Ausbeute 1.3 g (52%).

G. Kristen, A. Schaefer und A. v. Schlichtegroll, Drug Alcohol Depend. 17,259 (1986). 2 B. Nickel, G. Niebch, G. Peter, A. v. Schlichtegroll und U. Tibes, Drug Alcohol Depend. 17,235 (1986). 3 R. Fendt, Dissertation, UniversitZt Frankfurt a.M. (1990). 4 R. Young und R.A. Glennen, Med. Res. Rev. 6, 108 (1986). 5 C. Harsche, Dissertation, UniversitXt Frankfurt a.M. (in Vorbereitung). 6 H. Oelschlager, C. Harsche und J. Engel, Arch. P h m . (Weinheim) 324,543 (1991). 7 R. Zelnik, M. Pesson und M. Polonovski, Bull. SOC.Chim. Fr., P. 888 (1956); rf. C.A. 51,1203 (1956). 8 T. Nagai und S. Kamiyama, J. Chromatogr. 525,203 (1990). 9 T.D. Doyle, C.A. Bnmner und D.G. Cunningham, Poster Presentation, Association of Official Analytical Chemists Annual Meeting, Palm Beach,FL,U.S.A., 1988. 10 S.S. Simons und D.F. Johnson, J. Org. Chem. 43,2886 (1978). 11 B.M. Farrell und T.M. Jefferies, J. Chromatogr. 272, 111 (1983). [Ph982]

Spektroskopie der 3-Base Bruker AC 300, 'H-NMR (300 MHz, DMSO-d6, TMS als int. Standard.-

6 (ppm) = 7.99 und 7.81 (s; lH, H-8), 7.27-7.03 (m;lOH, aromat.), 4.18-

Arch. Pharm. (Weinheim)325.593-595 (1992)

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[Enantioselective biotransformation of a new theophylline derivative].

Reductive amination of 4 with (RS)-2 is an improved method to obtain 7-((RS)2-((RS)-1-Methyl-2-phenyl-ethylamino)propyl)-theophylline (3) (ratio of di...
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