ラ ッ トの 実 験 的 関 節 炎 疹 痛 に 対 す る ピア ル ロ ン酸 ナ ト リウ ム の 効 果 相原

静 彦1)， 村 上

尚 史1・2)， 石井

律 子1)， 仮 家

公 夫2)

東

陽 子1)， 濱 田 くみ 子1)， 梅 本

準 治1)， 前 田

誠 二1)

マ ル ポ(株)開 発 本 部 研 究 所1)，神 戸学 院大 学 薬 理 学 教 室2) (1992年7月7日)

要 約:ラ

ッ トの膝 関 節 内 に 尿 酸 ナ トリウ ム の 針 状 結 晶(MSU)を

行 異 常 がみ られ ， 同 時 に関 節 液 中 の ブ ラ ジ キ ニ ン(BK)お

注 入 す る と関 節 炎 に伴 う痙 痛 の た め 歩

よび プ ロス タゲ ラ ン ジ ンE2(PGE2)濃

上 昇 が み られ た ． そ こ で ， ピア ル ロ ン酸 ナ トリウ ム(Na・HA)溶 投 与 し，この 歩 行 状 態改 善 を指 標 にNa・HAの 度 の 上 昇 に 対 す るNa・HAの

入 の1時 間前 に 膝 関 節 内

鎮 痛 効 果 を調 べ る と と もに 関節 液 中 のBKお

影 響 を検 討 した ．MSUを

量4．7×105(HA・47)，9．5x105(HA・95)お

液 をMSU注

よびPGE2濃

注 入 す る と歩 行 異 常 ス コ ア は上 昇 す る が ， 分 子

よび2。02×106(HA・200)の1．0%Na・HA溶

液 を膝 関 節

内 に 前 投 与 す る と 分 子 量 の 大 き さ に従 っ て歩 行 異 常 の 改 善 が 認 め ら れ ， 特 に ，HA・200投 MSU注

入4お

度の

与群 のみ が

よび6時 間 後 に お い て有 意 な作 用 が 認 め られ た ． ま た ，0．1，0．3および1．0%のHA・200

溶 液 を前 投 与 す る と ，濃 度 依 存 的 な歩 行 異 常 改 善 作 用 が 認 め られ ，1．0%HA・200溶 鎮 痛 効 果 が認 め ら れ た ．MSUを

関 節 内 に注 入 す る と関 節 液 中 のBKお

4時 間 後 に最 大 値 を示 した ．分 子 量 の 異 な る1．0%Na・HA溶 95お よびHA・200に

よ びPGE2濃

度 は上 昇 し，注 入

液 を前 投 与 す る とBK濃

お い て 分子 量 の 大 き さに 従 って 抑 制 さ れ ，特 に ，HA・200投

有 意 に 抑 制 され た ． ま た ，PGE2濃

液 投 与 群 で は有 意 な

度 の 上 昇 はHA-47，HA・95お

よ びHA-200の

い て も対 照 群 に比 べ有 意 に 抑 制 され た ．以 上 の 結 果 か ら ，Na・HA前

度 の 上昇 はHA・

与 群 で は対 照 群 に比 べ いずれの投与群 にお

投 与 はMSUの

関節内注入 による

関 節 炎痙 痛 に対 して鎮 痛 効 果 を示 し，特 に ，H:A・200は 有意 で最 も強 い効 果 を示 す こ とが 明 らか とな った ． ま た ， こ の鎮 痛 効 果 に は 関 節 内 に お け るBKお

よびPGE2の

産 生 に 対 す るNa・HAの

抑 制 作 用 が関 与

して い る と推 察 され る ．

関節 症 患 者 の 関節 液 は 健 常 者 の関 節 液 に 比 べ ， 関節 液 緒

言

ピ ア ル ロ ン酸(HA)は1>:一

アセ チ ル ーD・ グ ル コサ ミソ と

中 のHA濃

度 は 低 下 す る と と も に そ の 分 子 量 も低 下 す

る と報 告 され て お り6∼8)，この よ うなHAの

化学 的変 化

D一グル ク ロ ソ酸 の2糖 単 位 の 繰 り返 し構 造 よ りな る グ リ

はHAの

コサ ミノ グ リカ ンで ，生 体 内 に広 く分 布 し， 特 に 関 節 液

度 の 低 下 な ど関 節 液 の性 状 を 変 え る こ と に よ り8)，関節

の 主 成 分 の 一 つ と して知 られ て い る ．

疾 患 の 症状 を進 展 させ る と考 え られ て い る．

HAは

，好 中球 の遊 走 機 能 抑 制 作 用1)，好 中球 の 貧 食

HAナ

機 能 に変 化 を も た らす と と もに ， 関 節 液 の 粘

トリ ウム(Na-HA)溶

液 は ，既 に 変 形 性 関節 症

抑 制 作 用2)お よび フ リー ラジ カ ル の捕 捉 作 用3)な ど炎 症

患 者 に対 して 臨 床 で使 用 され て お り， 関 節 内 にNa・HA

抑 制 に 関 与 す るほ か ， 滑 膜 細 胞 増 殖 抑 制 作 用4)あ るい は

を 投 与 す る と， 関 節 可動 域 の改 善 とと もに 疹 痛 も緩 和 す

関 節 滑 膜 被 覆 細 胞 のHA合

成 促 進 作 用5)な どを 有 し，

る こ とが 報 告 され て い る9)．また ， 種 々 の 内 因性 発痛 物

分 子 量 お よび 濃 度 に 依 存 して い

質 を 関 節 内 に 投 与 す る こ とに よ り作 製 した 関 節 疹 痛 モデ

これ らの 作 用 はHAの

る と報 告 され て い る1・4・5)．

ルを 用 い て濃 度 の異 な るNa-H:Aの

1)〒531大 阪 市 北 区 大 淀 中1-8-23 2)〒651-21神 戸 市 西 区 伊 川 谷 町 有 瀬518

され ，高 濃 度 のNa-HAに

疹痛 抑 制 作 用 が 検 討

鎮 痛 効 果 が 認 め られ て い るlo)．

しか し，本 モ デ ル で認 め られ たNa・HAの

鎮痛作用の作

用 機 構 に関 して は ， 関節 内 に 投 与 され たNa・HAは

関節

内面 を 広 く覆 い ， また ， ピア ル ロニ ダ ー ゼを 関 節 内 に 投 与 す る と ，Na-HAの Na-HAが

鎮痛 作 用 が消失 す る ことか ら，

内 因 性 発 痛 物 質 を 捕 捉 す る と と も に ， 滑膜 な

どに 存 在 す る痛 覚 受 容 体 を 被 覆 す る た め で あ る と考 察10) され て い る．

調製法

95℃ に加 熱 した蒸 留 水1600mlに

尿 酸 ナ トリ ウ ム8g

を 入 れ ，撹 拝 しなが ら完 全 に 溶 解 させ ， 室 温 で 一 晩 放置 して 結 晶 化 させ た ． そ の 結 晶 を120℃ で ，2時

間加 熱 滅

菌 した ．結 晶形 は 顕 微 鏡 下 で 針 状 結 晶 で あ る こ とを確 認 した ．

本 研 究 は 関節 炎 モ デ ル を使 用 して ， 最 も強 い 鎮 痛 効 果 が 得 られ るNa-HAの Na-HAの

4．MSUの

分 子 量 お よび濃 度 を 知 る と と もに ，

鎮 痛 作 用 機 構 を 明 らか に す る 目的 で 着 手 した ．

ラ ッ トの 関節 内 に尿 酸 ナ ト リウム針 状 結 晶(MSU)を

5．MSUに

よ る関節 炎痙 痛 の誘 発 とNa・HAの

前投与

寺 澤 らll)の方 法 に 準 じて エ ー テ ル 麻 酔 下 で ラ ッ トの 右 膝 関 節 内 に5．0%MSU生

理 食 塩 液 懸 濁 液 を0．05ml

注 入 し，2，4，6お よび24時 間 後 に 歩 行状 態 を観 察 した ．

注 入 して誘 発 させ た 関 節 炎 では 疹 痛 の た め 歩 行 異常 が み

歩 行 状 態 は 正 常 歩 行(0点)，

られ る こ とが 報 告11)さ れ て い る の で ， 本 報 告 で は こ の

の肢 行(2点)，

つ ま先 立 った 歩 行(3点)お

モ デ ル を使 用 して歩 行 異 常 の改 善 を 指 標 に 分 子量 あ る い

行(4点)の5段

階 に分 類 し， カ ッ コ内 に示 した ス コ ア

は濃 度 の 異 な るNa・HAの

を用 いて そ れ ぞ れ の 歩 行状 態 を評 価 した ．被 験 薬 物 溶 液

ブ ラ ジ キ ニ ン(BK)は

鎮 痛 効 果 を 比 較 した ． ま た ，

発 痛 物 質 で あ り， プ ロス タ グ ラ

ン ジ ンE2(PGE2)は

， 痛 覚 受 容 体 の 感 受 性 を増 大 させ

と してNa-HA溶

軽 い 肢 行(1点)，

液0．05mlをMSU注

入 の1時 間 前 に

同関 節 部 位 に投 与 した ． な お ，対 照 群 に はNa-HA溶

る物 質 で あ る と報 告 され て い る12)の で ， 両 物 質 の 関 節

の溶 媒 で あ る生 理 食 塩 液 を 同容 量 投 与 した 。

内産 生 に対 して 分 子 量 の 異 な るNa・HAの

6． 関 節 液 中 のBK測

影響を検討 し

た．

液

定法

西 野 ら15)の方 法 に ほ ぼ 準 拠 して 測 定 した ． た だ し， 次 に示 すBK合 実

験

方

法

Na・HAは

成 と分 解 阻 害 剤 の 組 成 は 大 塚 製 薬 の マ

ニ ュ アル に 従 って 調製 した ．す なわ ち ， ラ ッ トを 断 頭 に

1． 被 験 薬 物

よ り放 血致 死 した後 ， ア プ ロチ ニ ン75単 位 ， ポ リブ レン 非 病 原 性 ， 非 溶 血 性 のS㌍

goo￠毎4θ〃z伽3を 子 量(粘

中程度

よび3足 歩

卿oooα6s

用 い て 発 酵 法 に よ り生 産 さ れ ， そ の 分

度 法)は1．8×106∼2．1×106で

で は 平 均 分 子 量2．02×106(HA-200)お

30ng，1，10一フ ェナ ン トロ リ ン75ngお ngを 含 有 した 生 理 食 塩 液0．5mlを

よ びEDTAI50

用いて関節内を洗浄

あ る13)． 本 研 究

し， そ の洗 浄 液 を 回収 した ． こ の関 節 洗 浄 液 に2倍 量 の

よ び これ を 加 熱

エ タ ノ ー ル を 加 え ，BKを

抽 出 し ，radioimmunoassay

処 理 に よ り低 分 子 化 し た 平 均 分 子 量4，7×105(HA-47)

法 に てBK濃

お よ び9．5×105(HA-95)のNa-HAを

の経 時 的変 化 を調 べ る実 験 では ， ラ ッ ト2匹 分 の 関節 洗

れ も1．0%生

使 用 した ． い ず

理 食 塩 液 溶 液 と し て 資 生 堂 よ り供 与 さ れ た ．

2． 使 用 試 薬 カ ラ イ テ ス ク)， イ ン ド メ タ シ ン

放 線 菌 ピ ア ル ロ ニ ダ ー ゼ(生

ン 酸 緩 衝 食 塩 水(PBS，

フ ェ ナ ン ト ロ リ ン(ナ

ク)， ア プ ロ チ ニ ン(Behringwerke)， ン 四 酢 酸 ニ ナ ト リ ウ ム(EDTA，

塚 製 薬)，PGE2測

キ ッ ト，Cayman)を

リ

カライテス

エチ レンジア ミ ナ カ ラ イ テ ス ク)， ポ

リ ブ レ ン(Sigma)，1251-BK(大 serum(大

化 学 工 業)，

和 光 純 薬)， 牛 血 清 ア ル ブ ミ ン

(BSA，Sigma)，1，10一

塚 製 薬)，antiBK 定 試 薬14)(PGE2EIA

使 用 した ．

7．関 節 液 中 のPGE2測

雄 性 ラ ッ トは 日 本 チ ャ ー ル ス ・ リバ ー か ら

動 物 飼 育 室 に て1週

， 湿 度55±10

間 飼 育 後 ，歩 行 な どに異 常 を認

め なか った もの を 実 験 に 供 した ．

定法

ラ ッ トを断 頭 に よ り放 血 致 死 した 後 ， イ ン ドメ タ シ ン 10μg/m1を

含 有 す る生 理 食 塩 液0．5mlを

用 い て 関節 内

を洗 浄 し， そ の洗 浄液 を 回収 した ． この 関 節 洗 浄 液 を4 ℃ ，5200gで

，10分 間 遠 心 分 離 し， 上 清 を 試 料 と した ．

試 料 中 のPGE2濃

度 は 試 料 を0'bymeら16)の

方法に準

じて 前 処 理 した 後 ， 測 定 し た ． す な わ ち ，試 料150μ1 に0．02単 位/m1の

BSAを

5週 齢 で 購 入 した ． ラ ッ トは 温 度24±2℃ %の

浄 液 を合 わ せ て1試 料 と し ， この 試 料 に つ い てBK濃

え ，37℃ で1時

3． 実 験 動 物 Crj:CD系

度

度 を測 定 した ．

尿 酸 ナ ト リ ウ ム(ナ (Sigma)，

度 を 測 定 した ． な お ，関 節 液 中BK濃

放 線 菌 ピ ア ル ロ ニ ダ ー ゼ10μ1を 加

間 反 応 後 ，0．01MEDTAお

含 有 す るPBSl50μ1を

μ1に飽 和 硫 安 溶 液300μ1を

よび10%

加 え た ．そ の反 応 液150 加 え て遠 心 分 離 後 ， そ の 上

清 を 採 取 し た ． 上 清 中 のPGE2濃 キ ッ ト14)を用 い て測 定 した ．

度 はPGE2EIA

8． 統計 学 的 処 理

行 異 常 の 改 善 が み られ た ． 特 に ，0．3%HA-200溶

測定 値 は平 均 値 ±標 準 誤 差 で表 わ した ． 群 間 の 有 意 差 検 定 はWilcoxonの

順 位 和 検定 で 実 施 し， 危 険 率 が5%

1．0%HA・200溶

以下 の場 合 に有 意 であ る と判 定 した ． 実 1．MSU誘

験

結

液 投 与 群 で はMSU注

入 後 の いず れ の

鎮痛 効果

分 子 量 と 鎮 痛 効 果(図1) 入2，4，6お

間 後 に お い て そ れ ぞ れ2．2，3．6，3．7お

びHA-200溶

よ

よ び1．9

で あ っ た ． こ れ に 対 して ，1．0%のHA-47，HA-95お

よ

液投与 群 のス コアは，対照 群 のそれに比

較 し てNa-HAの

分 子 量 依 存 的 に 低 値 を 示 し， 歩 行 異 常

の 改 善 が み ら れ た ． 特 に ，1．0%HA-200溶 はMSU注

液投

よ び24時 間 後 に:おい て ， ま た ，

果

対 照 群 の 歩 行 異 常 ス コ ア はMSU注 び24時

入2お

測 定 時 間 に お い て も対 照 群 の そ れ に 比 較 して 有 意 に 低 い

発 関 節 炎 疹 痛 に 対 す るNa・HAの

1)Na-HAの

与 で はMSU注

入4お

よ び6時

れ ぞ れ 対 照 群 の63．9お

液投与群 で

間 後 に お い て ， ス コア は そ

よ び59．5%と

な り有 意 な 鎮 痛 効 果

が 認 め られ た ． 2)HA-200の

濃 度 と 鎮 痛 効 果(図2)

対 照 群 の 歩 行 異 常 ス コ ア はMSU注 び24時

入2，4，6お

間 後 に お い て そ れ ぞ れ3．5，3．9，4．0お

よ

よ び2．6

で あ っ た ． こ れ に 対 し て ，0．1，0．3:お よ び1．0%のHA200溶

液 投 与 群 の ス コ ア は 濃 度 依 存 的 に 低 値 を 示 し， 歩

Fig. 2 Antinociceptive effects of HA 2 0 0 at various concentrations (A : 0. 1%, EI: 0.3%, 0: 1.0 °/) on gait scores of monosodium urate (MSU) -in duced arthritis in rats. Either 0. 05 ml vehicle (40) or 0. 05 ml HA-200 was administered intra-articular ly 1 hr prior to MSU injection. Each point and ver tical bar represent the mean ±S.E. from 9^-10 rats. *P and Seiji MAEDA') (1) Division of Phar macology, Research Laboratories, Maruho Co., Ltd., 1-8-23 Oyodo Naka, Kita-ku, Osaka 531, Japan and 2) Department of Pharmacology , Faculty of Pharmaceutical Sciences, Kobe-Gakuin University, 518 Arise Ikawadani-cho, Nishi-ku, Kobe 651-21, Japan). Folia pharmacol. japon. 100, 359^365 (1992) Antinociceptive effects of sodium hyaluronate (Na-HA) were studied on the basis of improvement in the graded abnormal gait elicited by arthritis induced by intra-articular administration of monosodium urate crystal (MSU) to rats. One hour before MSU injection, intra-articular administration of a 1.0% solution of Na-HA with different molecular weights, ranging from 4.70 x 105 to 2.02 x 106 (HA-200), im proved the score of abnormal gait in a molecular weight-dependent manner in the experimental arthritis model. Similarly, administrations of HA-200 at concentrations ranging from 0.1 to 1.0 % prior to MSU treatment resulted in improvement of the score in abnormal gait in a dose-dependent manner. To elucidate the antinociceptive mechanisms of Na-HA, effects of pretreatment with Na-HA (1.0%) of dif ferent molecular weights on prostaglandin E2 (PGE2) and bradykinin (BK) releases in synovial fluid 3 hr after MSU injection were studied. Increases in PGE2 and BK concentration in the synovial fluid were depressed in a molecular weight-dependent manner by Na-HA (1.0 %) pretreatment. These results indicate that Na-HA attenuates the nociceptive responses inflicted by the MSU-induced arthritis. Such an antinociceptive effect may be due to the inhibition of PGE2 and BK synthesis in the synovial joint of rats.