Lange u. a.: Nachweis von FIBs-Antigen mit dem Hepanostika-Teot
I58I
Dtsch. med. Wschr. 102 (1977), 1581-1585
© Georg Thieme Verlag, Stuttgart
Der Nachweis von HBs-Antigen mit dem Hepanostika -Test, einem Enzymimmunoassay W. Lange, H. Köhler, J. Apodaca, A. Ott und U. Sucker' Robert-Koch-Institut des Bundesgesundheitsamtes, Berlin, Abteilung Virologie, Fachgebiet für Hepatitis
In einer Vergleichsuntersuchung wurden Empfindlichkeit, Spezifität und Praktikabilität des Hepanostika-Tests, eines neu entwickelten Enzymimmunoassays von Organon-Teknika zum Nachweis von HBs-Antigen, dem Ausria 11125-Test gegenübergestellt. Als geringste nachweisbare Konzentration des HBs-Antigens wurden für den Hepanostika-Test 3,125 ng/ml bei Antigen der Subgruppe ad und 2,08 ng/ml bei Antigen der Subgruppe ay und für den Ausria 11125-Test 1,04 ng/ml für beide Subgruppen ermittelt. Unter 2930 Blutspendern wurden mit beiden Tests übereinstimmend 85 Antigenträger festgestellt, während der Hepanosticon-Test, eine passive Hämagglutination von Organon, nur neun Antigenträger erfaßte. Auch bei der Untersuchung von Serienblutentnahmen von Patienten mit verschiedenen Erkrankungen wurden nur geringe Differenzen zwischen beiden Tests festgestellt. Der Hepanostika-Test zeigte in 1,6-3,8 8°/o, der Ausria II 125-Test in 0,5-0,8°/o unspezifische Reaktionen. Beide Tests erwiesen sich damit als erheblich spezifischer als die passiven Hämagglutinationen. Der Hepanostika-Test wird besonders angesichts der zunehmenden Probleme de"r Umweltbelastung mit radioaktiven Substanzen als Alternative zum Ausria II 125-Test angesehen. Er kann wegen seiner hohen Empfindlichkeit neben dem Ausria 11125-Test für die Untersuchung auf HBs-Antigen im Blutspendewesen und im klinischen Laboratorium empfohlen werden. Der Ausria II 125-Test hatte sich in früheren Untersuchungen unter sieben verschiedenen serologischen Verfahren in Empfindlichkeit, Spezifität und Praktikabilität als bester Test zum Nachweis von Hepatitis-B(Surface)Antigen (HBs-Antigen) erwiesen. Die Anwendung dieses Tests war daher insbesondere für das Blutspendewesen empfohlen worden (2,3). * Berliner Blutspendedienst
Demonstration of HBs antigen with the Hepanostika test, an enzyme immunoassay Sensitivity, specificity and practicability of the Hepanostika test, a newly developed enzyme immunoassay by Organon Teknika for the demonstration of HBs-antigen, was compared with results of the Ausria II 125 test. Smallest demonstrable concentration of the antigen in the Hepanostika test was 3.125 ng/ml with antigens of sub-
group ad and 2.08 ng/ml in those of subgroup ay, while it was 1.04 ng/ml for both subgroups with the Ausria test. Among 2930 blood donors 85 antigen carriers were discovered by both tests, while with the Hepanosticon test, a passive haemagglutination test from Organon, only nine were discovered. In serial blood samples of patients with various diseases there was only a slight difference between the two tests. The Hepanostika test had 1.6-3.88°/o nonspecific reactions, compared with O.S-0.8°/o with the Ausria 11125 test. Both tests thus gave much more specific results than passive haemagglutination. The Hepano-
stika test is thus a satisfactory alternative to the Ausria test. Because of its high sensitivity it can be recommended for the diagnosis of HBs antigen among blood donors and in clinical laboratories.
Mit dem Hepanostika-Test von Organon-Teknika steht der erste Enzymimmunoassay zum Nachweis von HBs-Antigen zur Verfügung. Er unterscheidet sich im Prinzip nur dadurch vom Ausria H 125-Test, daß das HBs-Antigen nicht mit einem mit 1J markierten, sondern mit einem mit Meerrettichperoxidase beladenen Antikörper reagiert. Beim Radioimmunoassay werden die Impulse des gebundenen radioaktiv markierten Anti-
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Nr. 44, 4. November 1977, 102. Jg.
körpers gezählt, beim Enzymimmunoassay wird die Intensität der Farbreaktion bestimmt. Wir stellten diesen neuen Test daher im direkten Vergleich dem Ausria 11 125-Test gegenüber und berichten im folgenden über die Ergebnisse dieses Vergleichs.
Material und Methoden 1. Seren. Für die Untersuchung standen 652 Seren von 69 Patienten mit Hepatitis B aus unterschiedlichen Stadien der Erkrankung und aus der Rekonvaleszenz, 702 Seren von Patienten mit verschiedenen Erkrankungen der Leber und anderer Organsysteme aus der Routinediagnostik, ferner Seren von 2930 Blutspendern des Berliner Blutspendedienstes und 180 Seren von Blutspendern zur Verfügung, die früher im Hepanosticon-Test, einer passiven Hämagglutination von Organon-Teknika, positiv reagiert hatten. Zur Bestimmung der geringsten nachweisbaren Antigenkonzentration wurden 34 verschiedene Konzentrationen von HBs-Antigen der Subgruppen ad und ay mit in Nanogramm pro Milliliter (ng/ml) definiertem Antigengehalt untersucht, die uns vom Referenzlaboratorium für Hepatitis am Hygiene-Institut in Göttingen im Jahre 1974 zur Verfügung gestellt worden waren. Diese Materialien wurden bis zur Untersuchung bei -20 oe aufbewahrt. Weiterhin wurden Verdünnungsreihen von HBs-Antigen beider Subgruppen untersucht, das wir als Referenzmaterial mit einem Antigengehalt von 100 ng/ml vom Referenzlaboratorium für Hepatitis im Januar 1977 erhalten haben. Diese Referenzmaterialien hatten die Lot-Nummer 300176.
2. Hepanostika-Test, Der als Hepanostika-Test bezeichnete Enzymimmunoassay wurde für die Untersuchungen von OrganonTeknika zur Verfügung gestellt. Benutzt wurden Kirs der Lot-Nummer 704418. Die Ausführung des Tests erfolgte nach der Anweisung des Herstellers. Die Prozedur bestand aus folgenden Schritten: a) In mit Antikörpern gegen HBs-Antigen vom Schaf beschichteten Mikrotiterplatten wurden 0,1 ml der zu untersuchenden Seren über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert. b) Anschließend wurden die Seren abgesaugt, und die Platte wurde viermal gewaschen. Wir benutzten dazu ein automatisches Waschgerät, das von Organon-Teknika zur Verfügung gestellt wurde. Die Waschung erfolgte mit einem mitgelieferten Waschpuffer. c) In die gewaschenen Löcher der Mikrotiterplatte wurden jeweils 0,1 ml eines ebenfalls vom Schaf stammenden, mit Meerrettichperoxidase markierten Antikörpers gegen HBs-Antigen einpipettiert. Die Inkubation erfolgte bei 37 oe für 2 Stunden. d) An die zweite Inkubation schloß sich eine weitere Waschprozedur wie oben an. e) Die Löcher wurden mit dem Enzymsubstrat (Orthophenylendiamin) in Mengen von 0,1 ml beschickt und für 50 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Diese Inkubation erfolgte im Dunkeln. f) Exakt nach dieser Zeit wurde die Reaktion mit 0,05 ml einer 4 n-Schwefelsäure pro Loch gestoppt und sofort abgelesen. Die Ablesung erfolgte in ständigem Vergleich mit den positiven und negativen Kontrollen.
g) Die Spezifität positiver Enzymreaktionen wurde in einem Bestätigungstest geprüft. Hierzu wurden drei Löcher einer Platte mit je 0,1 ml der Serumprobe gefüllt und bei Zimmertemperatur über Nacht inkubiert. Danach wurden zwei der drei Löcher gewaschen und in das erste Loch vier Tropfen eines Antikörpers gegen HBsAntigen sowie in das zweite Loch vier Tropfen einer Kontrollflüssigkeit ohne Antikörper eingefüllt. Das dritte Loch blieb in diesem Schritt unbehandelt. Nach zweistündiger Inkubation bei 37 oe wurden alle drei Löcher wie oben gewaschen und entsprechend der normalen Testprozedur weiterbehandelt. Als spezifisch positiv wurde ein Ergebnis angesehen, wenn Abstufungen in der Farbreaktion zwischen den Kontrollen und dem zusätzlich mit dem HBsAntikörper inkubierten Loch erkennbar waren.
Deutsche Medizinische Wochenschrift
3. Ausria 1I 12S-Test. Der Ausria 11 125-Test wurde in der üblichen Prozedur mit Inkubationszeiten von zwei Stunden und einer Stunde im Wasserbad bei 45 oe und Zählung der Impulse für eine Minute ausgeführt. Zur Verfügung standen Kits der Lot-Nummer 71.959.BX.1 4. Hepanosticon-Test, Die Seren von Blutspendern wurden im Berliner Blutspendedienst mit dem Hepanosticon-Test entsprechend den Anweisungen des Herstellers untersucht. 5. Hepatest, Eine kleine Anzahl von Seren wurde zusätzlich im Hepatest von Wellcome untersucht. Dabei handelt es sich um eine passive Hämagglutination (3). Auch die Durchführung dieses Tests entsprach den Anweisungen des Herstellers. Im übrigen sind Durchführung und Ergebnisse von Ausria 11 125-, Hepanosricon- und Hepatest an anderer Stelle ausführlich beschrieben worden (2,3). Alle Tests wurden unabhängig voneinander von verschiedenen Personen und mit kodierten Materialien durchgeführt.
Ergebnisse 1. Geringste nachweisbare Antigenkonzentration. Für die Bestimmung der geringsten nachweisbaren Konzentration des HBs-Antigens wurden in ng/ml definierte Verdünnungsstufen von HBs-Antigen in Kälberserum untersucht, die uns im Jahre 1974 vom Referenzlaboratorium für Hepatitis zur Verfügung gestellt worden waren. Insgesamt wurden 34 Materialien mit Antigen der Subgruppen ad und ay untersucht. Tab. 1. Geringste nachweisbare Konzentrationen von Hßs-Antigen (Angaben in ng/rnl) Test
Subgruppe
I
ad
I
ay
Ausria 11 125-Test
1,0
1,5
Hepanostika-Test
4,0
2,9
31,0
47,0
130,0
93,0
Hepatest" Hepanosticon-Test**
* passive Hämagglutination von Wellcome ** passive Hämagglutination von Organon-Teknika
Das Ergebnis der Untersuchung ist in Tabelle 1 zusammengestellt. Sie zeigt, daß der Ausria 11 125-Test noch geringere Antigenkonzentrationen erkennen konnte als der Hepanostika-Test. Zum Vergleich sind die früher mit dem Hepanosticon-Test und dem Hepatest, zwei passiven Hämagglutinationen, erzielten Ergebnisse angefügt (2,3). Zusätzlich wurde die Empfindlichkeit beider Tests an Verdünnungsreihen eines neuen Referenzmaterials aus dem Göttinger Referenzlaboratorium für Hepatitis" untersucht. Diese Referenzantigene der Subgruppen ad und ay hatten einen Antigengehalt von 100 ng/mI. Die Verdünnungsreihen wurden so gewählt, daß im Bereich geringer Antigenkonzentrationen nahe beieinander liegende Stufen erreicht wurden. Dies wurde dadurch ermöglicht, daß zwei Verdünnungsreihen in Zweierstufen, ausgehend von unverdünntem und 1:3 verdünntem Material, hergestellt wurden. Wir danken der Firma Abbott für die Bereitstellung der Test-Kits. Wir danken Prof. Dr. R. Thomssen für die überlassung der Referenzmaterialien. 1
2
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Lange u. a.: Nachweis von HBs-Antigen mit dem Hepanostika-Test
Im Ausria 11 125-Test wurden bei beiden Subgruppen noch Antigenkonzentrationen von 1,Q4 ng/ml nachgewiesen, im Hepanostika-Test 3,125 ng/ml des Subtyps ad und 2,08 ng/ml des Subtyps ay. Tab. 2. Nachweis von HBs-Antigen bei 2930 Blutspendern davon positive Reaktion reprodu-'I zierbar speziifISCh
Test
Hepanosticon-Test
9
9
I positiv o/p
9
0,3
Hepanostika-Test
133
85
85
. 2,9
Ausria II 125-Test
100
85
85
2,9
Unspezifische Reaktionen wurden im Ausria 11 125-Test in 0,5% und im Hepanostika-Test in 1,6010 festgestellt.
2. HBs-Antigen bei Blutspendern. 2930 Seren von Blutspendern des Berliner Blutspendedienstes wurden parallel in Hepanostika-, Ausria 11 125- und Hepanosticon-Test untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tab. 3. Spezifität positiver Reaktionen bei 180 ausgewählten Seren positive Reaktion
Test
davon
ifi h spezi sc
12,2
180
158
22
Hepanostika-Test
165
158
7
3,88
Ausria 11 125-Test
158
158
-
-
3. Vergleich der Spezifitat an Seren von Blutspendern, die im Hepanosticon-Test früher positiv reagiert hatten. Über längere Zeit wurden Seren von Blutspendern gesammelt, die im Hepanosticon-Test positiv reagiert hatten. Durch Nachuntersuchung und Spezifitätstest war bereits bekannt, daß ein Teil dieser Seren im HepanosticonTest unspezifisch reagiert hatte. Hier sollte geprüft werden, wieweit auch Hepanostika- und Ausria 11 125-Test solche unspezifisch reagierenden Seren erfaßten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Tab. 4. Dauer der Antigenpersistenz nach Hepatitis B bei 69 Patienten mit Hepatitis B Hepanostika-Test positiv
I
0/0
Tab. 5. Vergleich der Ergebnisse im Hepanostika- und Ausria 11 125-Test bei Einzelseren von 702 Patienten r::
., 0
>.-
010 unspeziunspezifisch fisch
o .,
spezifisch
positiv
Hepanostika-Test
214
202
28,7
12
1,7
Ausria 11 125-Test
213
207
29,3
6
0,85
Test
'p~ 'Vj
(';S
0/0
o.~
0/ 0
I unspezi-/ unspezifisch fisch
Hepanosticon-Test
Zeit nach Beginn der Hepatitis
4. Antigenpersistenz nach Hepatitis B. Bei 69 Patienten mit Hepatitis B wurden Serienblutentnahmen über 10 Monate nach Beginn der Hepatitis entnommen und auf HBs-Antigen untersucht. Die Ergebnisse des Hepanostika- und Ausria 11 125-Tests sind in Tabelle 4 zusammengestellt. _ 5. Untersuchung von Einzelseren aus der Routinediagnostik. Von 702 Patienten mit verschiedenen Erkrankungen der Leber und anderer Organsysteme wurden Einzelseren parallel im Hepanostika- und Ausria 11.125Test auf HBs-Antigen untersucht. Darunter befanden sich Patienten mit akuter Hepatitis, chronischen Leberschädigungen, Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems und anderen Krankheiten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt.
Ausria 11 125-Test positiv
I
0/0
1 Woche
69
100,0
69
2 Wochen
69
100,0
69
100,0
4 Wochen
69
100,0
69
100,0
6 Wochen
64
92,7
64
92,7
8 Wochen
46
66,7
49
71,0
10 Wochen
31
44,9
34
49,2
12 Wochen
19
27,5
20
29,0
100,0
4 Monate
12
17,4
12
17,4
6 Monate
6
8,7
6
8,7
8 Monate
6
8,7
6
8,7
10 Monate
5
7,2
5
7,2
Diskussion In früheren Untersuchungen (2, 3) war festgestellt worden, daß der als Ausria 11 125-Test bezeichnete Radioimmunoassay von Abbott der empfindlichste der zur Verfügurig stehenden Tests zum Nachweis von Hßs-Antigen war. Da dieser Test gleichzeitig in Spezifität und Praktikabilität sehr gut abschnitt, wurde er für die Untersuchung von Blutspendern auf HBs-Antigen empfohlen. Mehrere passive Hämagglutinationstests hatten sich als deutlich weniger empfindlich und als stärker belastet mit unspezifischen Reaktionen erwiesen. Ende 1976 untersuchten wir den Hepanostika-Test, einen Enzymimmunoassay der Firma Organon-Technika". Es sollte festgestellt werden, in welchem Qualitätsbereich dieser neue Test einzuordnen ist. Vom Prinzip her und aus einer ersten Mitteilung in der Literatur (4) war eine ähnlich hohe Empfindlichkeit zu erwarten wie beim Ausria 11 125-Test. In unseren Untersuchungen wurde daher der Hepanostika-Test direkt an der Leistungsfähigkeit des Ausria 11 125-Tests gemessen. Der Vergleich zeigte, daß beide Tests noch Antigenkonzentrationen unterhalb vori 5 ng/rnl erfassen konnten. Der Ausria 11 125-Test lag bei uns früher in einem Empfindlichkeitsbereich von 1 ng/ml für die Subgruppe ad und von 1,5 ng/ml für die Subgruppe ay (2, 3). Bei der erneuten Untersuchung der Referenzantigene von 1974 Ende 1976 wurden die gleichen Ergebnisse erzielt. Damit konnte gezeigt werden, daß die Lagerung dieser Materialien bei -20 -c innerhalb von 2 Jahren nicht zu einer Beeinträchtigung der Nachweisbarkeit des HBs-Antigens im Ausria 11 125-Test geführt hatte. Der Hepanostika-Test wies in diesen Referenz3 Wir danken der Firma Organon-Teknika für die überlassung der Test-Kits.
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Lange u. a.: Nachweis von Hßs-Anrigen mit dem Hepanostika-Test
Nr. 44, 4. November 1977, 102. ]g.
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materialien noch Antigenkonzentrationen von 4 ng/rnl für die Subgruppe ad und 2,9 ng/ml für die Subgruppe ay nach. Um sicherzustellen, daß dieses Ergebnis durch die Lagerung der untersuchten Antigenkonzentrationen nicht beeinträchtigt worden ist, wurden zusätzlich neue Referenzmaterialien vom Januar 1977 in beiden Tests untersucht. Dabei wurde als geringste nachweisbare Antigenkonzentration für den Ausria 11 125-Test übereinstimmend für beide Subgruppen 1,04ng/ml ermittelt. Der HepanostikaTest kam bei dieser Untersuchung auf 3,125 ng/ml für die Subgruppe ad und 2,08 ng/ml für die Subgruppe ay. Dieses Ergebnis wurde in drei unabhängig voneinander durchgeführten Untersuchungen reproduziert. Wolters und Mitarbeiter (4) ermittelten als geringste nachweisbare Antigenkonzentration mit dem Hepanostika-Test für die Subgruppe ad 10,5 ng/ml und für die Subgruppe ay 2,4 ng/ml. Bei uns schnitt der Hepanostika-Test damit deutlich besser ab. Die Differenz zwischen Ausria 11 125- und Hepanostika-Test ist erheblich geringer als zwischen Ausria 11 125-Test und den passiven Hämagglutinationen. Der bei der Bestimmung der geringsten nachweisbaren Antigenkonzentration festgestellten hohen Empfindlichkeit des Hepanostika-Tests entsprach auch das Ergebnis der. Untersuchung von Blutspendern. Im Ausria 11 125und Hepanostika-Test wurden übereinstimmend 85 Antigenträger ermittelt, im Hepanosticon-Test aber nur neun. Die Differenz zwischen Ausria 11 125- und Hepanostika-Test einerseits und dem Hepanosticon-Test andererseits entspricht den Erwartungen aufgrund unserer früheren Befunde (2,3). Auch bei der Untersuchung von Serienblutentnahmen von Hepatitispatienten wurde ein nahezu identisches Ergebnis im Ausria 11 125- und Hepanostika-Test ermittelt. Bei der Bestimmung der Dauer der Antigenpersistenz nach Hepatitis B zeigten beide Tests bis zu vier Wochen nach Beginn der Erkrankung in 100% der Seren HBsAntigen an. In der folgenden Zeit sank die Zahl der positiven Seren, wobei von der achten bis zwölften Woche nach Krankheitsbeginn der Ausria 11 125-Test etwas mehr antigenhaltige Seren erfaßte als der Hepanostika-Test. Vom vierten Monat nach Beginn der Hepatitis ab wurden wiederum übereinstimmende Ergebnisse erzielt. Die Differenz in der Anzeige von antigenhaitigen Seren in der Zeit von der achten bis zur zwölften Woche nach Beginn der Hepatitis könnte darauf zurückzuführen sein, daß in den Seren sehr niedrige Antigenkonzentrationen vorhanden waren, die von dem etwas empfindlicheren Radioimmunoassay noch erfaßt wurden, nicht aber vom Enzymimmunoassay. In Einzelseren von Patienten mit verschiedenartigen Erkrankungen zeigte der Hepanostika-Test 0,6% weniger Antigenträger an als der Ausria 11 125-Test. Auch diese Differenz dürfte Ausdruck des geringen Unterschiedes in der Empfindlichkeit beider Tests sein. Bei der Prüfung der Spezifität erwiesen sich im Hepanostika-Test 1,6-3,88% der positiven Reaktionen als nicht reproduzierbar und nicht spezifisch. Der Ausria 11 125-Test zeigte in 0,5-0,8 % unspezifische Reaktionen. Beide Tests liegen in diesem Punkt deutlich über
den passiven Hämagglutinationen, bei denen wir früher zwischen 37,5 und 55,3% unspezifische Reaktionen festgestellt hatten (2,3). Als drittes Kriterium für die Beurteilung der Qualität eines Tests sollte die Praktikabilität herangezogen werden. Wir hatten zu Beginn der Untersuchungen Probleme mit der Ablesung des Hepanostika-Tests, besonders im Bereich schwach positiver Reaktionen. In diesem Punkte erwies sich der Test als gewöhnungsbedürftig. Er stellte darin höhere Anforderungen als der Ausria 11 125-Test. Da die Herstellerfirma für den Hepanostika-Test die Benutzung eines Photometers zur Bewertung der Farbreaktionen nicht zwingend vorschreibt und in der Praxis aus Kostengründen die Ablesung mit dem Auge vorgezogen werden dürfte, verzichteten wir ebenfalls auf eine photometrische Auswertung. Aufgrund unserer Erfahrungen würden wir es jedoch begrüßen, wenn OrganonTeknika ein speziell an diesen Test angepaßtes Photometer einführen würde. Ein solches Photometer würde eine exakte Auswertung des Hepanostika-Tests im schwach positiven Bereich ermöglichen. Die Empfindlichkeit des Enzymsystems macht eine strenge Einhaltung der vom Hersteller vorgeschriebenen Testprozedur notwendig. Vor einer Abweichung von dieser Vorschrift muß dringend gewarnt werden. Das betrifft besonders die Inkubationszeiten. Wir beobachteten eine Verringerung der Empfindlichkeit des Tests bei Verkürzung der ersten Inkubationszeit. Nach Angaben des Herstellers sollen Metallionen sowie Lösungsmittel- und Säuredämpfe die Enzymreaktion beeinflussen. Ferner ist es notwendig, beim Einpipettieren des enzymmarkierten Antikörpers eine Verunreinigung der Wand der Mikrotiterlöcher zu vermeiden. An die Wand der Löcher gebrachte Proteine werden unspezifisch gebunden und können durch die Waschprozedur nicht beseitigt werden. Wenn enzymmarkierte Antikörper auf diese Weise gebunden worden sind, kann ein falsch-positives Ergebnis erzielt werden. In diesem Punkt erinnert der Test an den früheren Ausria 125-Test, den Vorläufer des heute gebräuchlichen Ausria 11 125-Tests. Bis zum fertigen Untersuchungsergebnis ist beim Hepanostika-Test mit 5-6 Stunden zu rechnen, wenn man die erste Inkubation bei 37 oe für zwei Stunden wählt, und entsprechend mehr, wenn die Inkubation über Nacht vorgezogen wird. Der Ausria 11 125-Test ist bereits nach etwa vier Stunden fertig. Beide Tests benötigen für die Prüfung der Spezifität nochmals etwa die gleiche Zeit. Sie dürften im allgemeinen hinsichtlich des Zeitaufwandes den Anforderungen des Blutspendewesens entsprechen. Auf der Grundlage unserer Untersuchungen können wir feststellen, daß nunmehr zwei hochempfindliche Testsysteme zum Nachweis von HBs-Antigen zur Verfügung stehen. Beide Tests stehen in bezug auf ihre Empfindlichkeit weit über allen anderen Testverfahren. Beide wiesen HBs-Antigen noch in Konzentrationen unter 5 ng/ml nach. Diesen beiden Tests kommt in der Empfindlichkeit - allerdings mit Abstand - der Auscell-Test, eine passive Hämagglutination von Abbott, am nächsten, der als ge-
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Lange u. a.: Nachweis von HBs-Antigen mit dem Hepanostika-Test
ringste Konzentration des HBs-Antigens 16 bzw. 23 ng/ml nachwies (2). Wie neuere Untersuchungen zeigten, ist dieser Test heute besser auswertbar als bei unserer Untersuchung im Jahre 1974/75 (Fricke, H.: persönliche Mitteilung 1977). Mit dem ersten Enzymimmunoassay steht eine Alternative zum Radioimmunoassay zur Verfügung. Das ist insbesondere angesichts der zunehmenden Umweltbelastung mit radioaktiven Substanzen von Interesse. Auch im Hinblick auf zu erwartende verschärfte Bestimmungen für den Umgang mit radioaktiven Substanzen ist die Entwicklung dieses neuen Testsystems zu begrüßen. Wir empfehlen daher den Hepanostika-Test ebenso wie den Ausria 11 125-Test für die Anwendung im Bereich des Blutspendewesens, aber auch für alle anderen Untersuchungen auf HBs-Antigen. Unsere langjährigen Erfahrungen mit der parallelen Untersuchung von Seren von Hepatitispatienten und anderen Patienten auf HBsAntigen im Ausria 11 125-Test und in einem passiven Hämagglutinationstest haben gezeigt, daß es nicht ausreicht, klinische Materialien allein mit einer passiven Hämagglutination zu untersuchen. Nur im Falle der Untersuchung von Seren aus der Frühphase der Hepatitis ist kaum eine Differenz zwischen Radioimmunoassay und passiver Hämagglutination zu erkennen (2,3). Bezüglich der Zielsetzung der Routineuntersuchung auf HBs-Antigen hat sich in der letzten Zeit eine Um-
orientierung vollzogen. Während früher Untersuchungen auf Hßs-Antigen der Differenzierung zwischen Hepatitis B und anderen Hepatitisformen dienten, werden heute in zunehmendem Maße solche Untersuchungen vorgenommen, um Antigenträger unter neu aufgenommenen Krankenhauspatienten zu erkennen und zu isolieren. Daher muß auch für das klinische Laboratorium die Benutzung eines möglichst empfindlichen Tests empfohlen werden. Dabei kann es sich nach dem heutigen Stand der Entwicklung nur um den Ausria 11 125- oder den Hepanostika- Test handeln. Literatur (1) Kouroupis, G. M., W. D. Leers: Radioimmunoassay-complement fixation and counter-immunoelectrophoresis in the laboratory diagnosis of hepatitis B. Arch. ges. Virusforsch. 43 (1973), 112. (2) Lange, W., H. Köhler, ]. Apodaca: Der Nachweis von Hepatiris-B-(Surface)Antigen. Ein Vergleich verschiedener serologischer Verfahren. Drsch. med. Wschr. 100 (1975), 508.
(3) Lange, W., H. Köhler, J. Apodaca: Der Nachweis von Hepariris-B-(Sudace)Antigen mit dem Hepatesr. Ein neuer passiver Hämagglutinationstest. Dtsch. med. Wschr. 101 (1976), 1273. (4) Wolrers, G., L. Kuijpers, ]. Kacaki, A. Schuurs: Solid-phase enzymeimmunoassay for detection of hepatitis B surface antigen. ]. clin, Path, 29 (1976), 873.
Dr. W. Lange, Dr. H. Köhler, Dr. J. Apodaca, Angelika Ott Fachgebiet für Hepatitis, Abteilung Virologie Robert-Koch-Institut des Bundesgesundheitsamtes 1000 Berlin 65, Nordufer 20 Dr. U. Sucker Berliner Blutspendedienst 1000 Berlin 65, Amrumer Straße 27
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group ad and 2.08 ng/ml in those of subgroup ay, while it was 1.04 ng/ml for both subgroups with the Ausria test. Among 2930 blood donors 85 antigen carriers were discovered by both tests, while with the Hepanosticon test, a passive haemagglutination test from Organon, only nine were discovered. In serial blood samples of patients with various diseases there was only a slight difference between the two tests. The Hepanostika test had 1.6-3.88°/o nonspecific reactions, compared with O.S-0.8°/o with the Ausria 11125 test. Both tests thus gave much more specific results than passive haemagglutination. The Hepano-
stika test is thus a satisfactory alternative to the Ausria test. Because of its high sensitivity it can be recommended for the diagnosis of HBs antigen among blood donors and in clinical laboratories.
Mit dem Hepanostika-Test von Organon-Teknika steht der erste Enzymimmunoassay zum Nachweis von HBs-Antigen zur Verfügung. Er unterscheidet sich im Prinzip nur dadurch vom Ausria H 125-Test, daß das HBs-Antigen nicht mit einem mit 1J markierten, sondern mit einem mit Meerrettichperoxidase beladenen Antikörper reagiert. Beim Radioimmunoassay werden die Impulse des gebundenen radioaktiv markierten Anti-
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Nr. 44, 4. November 1977, 102. Jg.
körpers gezählt, beim Enzymimmunoassay wird die Intensität der Farbreaktion bestimmt. Wir stellten diesen neuen Test daher im direkten Vergleich dem Ausria 11 125-Test gegenüber und berichten im folgenden über die Ergebnisse dieses Vergleichs.
Material und Methoden 1. Seren. Für die Untersuchung standen 652 Seren von 69 Patienten mit Hepatitis B aus unterschiedlichen Stadien der Erkrankung und aus der Rekonvaleszenz, 702 Seren von Patienten mit verschiedenen Erkrankungen der Leber und anderer Organsysteme aus der Routinediagnostik, ferner Seren von 2930 Blutspendern des Berliner Blutspendedienstes und 180 Seren von Blutspendern zur Verfügung, die früher im Hepanosticon-Test, einer passiven Hämagglutination von Organon-Teknika, positiv reagiert hatten. Zur Bestimmung der geringsten nachweisbaren Antigenkonzentration wurden 34 verschiedene Konzentrationen von HBs-Antigen der Subgruppen ad und ay mit in Nanogramm pro Milliliter (ng/ml) definiertem Antigengehalt untersucht, die uns vom Referenzlaboratorium für Hepatitis am Hygiene-Institut in Göttingen im Jahre 1974 zur Verfügung gestellt worden waren. Diese Materialien wurden bis zur Untersuchung bei -20 oe aufbewahrt. Weiterhin wurden Verdünnungsreihen von HBs-Antigen beider Subgruppen untersucht, das wir als Referenzmaterial mit einem Antigengehalt von 100 ng/ml vom Referenzlaboratorium für Hepatitis im Januar 1977 erhalten haben. Diese Referenzmaterialien hatten die Lot-Nummer 300176.
2. Hepanostika-Test, Der als Hepanostika-Test bezeichnete Enzymimmunoassay wurde für die Untersuchungen von OrganonTeknika zur Verfügung gestellt. Benutzt wurden Kirs der Lot-Nummer 704418. Die Ausführung des Tests erfolgte nach der Anweisung des Herstellers. Die Prozedur bestand aus folgenden Schritten: a) In mit Antikörpern gegen HBs-Antigen vom Schaf beschichteten Mikrotiterplatten wurden 0,1 ml der zu untersuchenden Seren über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert. b) Anschließend wurden die Seren abgesaugt, und die Platte wurde viermal gewaschen. Wir benutzten dazu ein automatisches Waschgerät, das von Organon-Teknika zur Verfügung gestellt wurde. Die Waschung erfolgte mit einem mitgelieferten Waschpuffer. c) In die gewaschenen Löcher der Mikrotiterplatte wurden jeweils 0,1 ml eines ebenfalls vom Schaf stammenden, mit Meerrettichperoxidase markierten Antikörpers gegen HBs-Antigen einpipettiert. Die Inkubation erfolgte bei 37 oe für 2 Stunden. d) An die zweite Inkubation schloß sich eine weitere Waschprozedur wie oben an. e) Die Löcher wurden mit dem Enzymsubstrat (Orthophenylendiamin) in Mengen von 0,1 ml beschickt und für 50 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Diese Inkubation erfolgte im Dunkeln. f) Exakt nach dieser Zeit wurde die Reaktion mit 0,05 ml einer 4 n-Schwefelsäure pro Loch gestoppt und sofort abgelesen. Die Ablesung erfolgte in ständigem Vergleich mit den positiven und negativen Kontrollen.
g) Die Spezifität positiver Enzymreaktionen wurde in einem Bestätigungstest geprüft. Hierzu wurden drei Löcher einer Platte mit je 0,1 ml der Serumprobe gefüllt und bei Zimmertemperatur über Nacht inkubiert. Danach wurden zwei der drei Löcher gewaschen und in das erste Loch vier Tropfen eines Antikörpers gegen HBsAntigen sowie in das zweite Loch vier Tropfen einer Kontrollflüssigkeit ohne Antikörper eingefüllt. Das dritte Loch blieb in diesem Schritt unbehandelt. Nach zweistündiger Inkubation bei 37 oe wurden alle drei Löcher wie oben gewaschen und entsprechend der normalen Testprozedur weiterbehandelt. Als spezifisch positiv wurde ein Ergebnis angesehen, wenn Abstufungen in der Farbreaktion zwischen den Kontrollen und dem zusätzlich mit dem HBsAntikörper inkubierten Loch erkennbar waren.
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3. Ausria 1I 12S-Test. Der Ausria 11 125-Test wurde in der üblichen Prozedur mit Inkubationszeiten von zwei Stunden und einer Stunde im Wasserbad bei 45 oe und Zählung der Impulse für eine Minute ausgeführt. Zur Verfügung standen Kits der Lot-Nummer 71.959.BX.1 4. Hepanosticon-Test, Die Seren von Blutspendern wurden im Berliner Blutspendedienst mit dem Hepanosticon-Test entsprechend den Anweisungen des Herstellers untersucht. 5. Hepatest, Eine kleine Anzahl von Seren wurde zusätzlich im Hepatest von Wellcome untersucht. Dabei handelt es sich um eine passive Hämagglutination (3). Auch die Durchführung dieses Tests entsprach den Anweisungen des Herstellers. Im übrigen sind Durchführung und Ergebnisse von Ausria 11 125-, Hepanosricon- und Hepatest an anderer Stelle ausführlich beschrieben worden (2,3). Alle Tests wurden unabhängig voneinander von verschiedenen Personen und mit kodierten Materialien durchgeführt.
Ergebnisse 1. Geringste nachweisbare Antigenkonzentration. Für die Bestimmung der geringsten nachweisbaren Konzentration des HBs-Antigens wurden in ng/ml definierte Verdünnungsstufen von HBs-Antigen in Kälberserum untersucht, die uns im Jahre 1974 vom Referenzlaboratorium für Hepatitis zur Verfügung gestellt worden waren. Insgesamt wurden 34 Materialien mit Antigen der Subgruppen ad und ay untersucht. Tab. 1. Geringste nachweisbare Konzentrationen von Hßs-Antigen (Angaben in ng/rnl) Test
Subgruppe
I
ad
I
ay
Ausria 11 125-Test
1,0
1,5
Hepanostika-Test
4,0
2,9
31,0
47,0
130,0
93,0
Hepatest" Hepanosticon-Test**
* passive Hämagglutination von Wellcome ** passive Hämagglutination von Organon-Teknika
Das Ergebnis der Untersuchung ist in Tabelle 1 zusammengestellt. Sie zeigt, daß der Ausria 11 125-Test noch geringere Antigenkonzentrationen erkennen konnte als der Hepanostika-Test. Zum Vergleich sind die früher mit dem Hepanosticon-Test und dem Hepatest, zwei passiven Hämagglutinationen, erzielten Ergebnisse angefügt (2,3). Zusätzlich wurde die Empfindlichkeit beider Tests an Verdünnungsreihen eines neuen Referenzmaterials aus dem Göttinger Referenzlaboratorium für Hepatitis" untersucht. Diese Referenzantigene der Subgruppen ad und ay hatten einen Antigengehalt von 100 ng/mI. Die Verdünnungsreihen wurden so gewählt, daß im Bereich geringer Antigenkonzentrationen nahe beieinander liegende Stufen erreicht wurden. Dies wurde dadurch ermöglicht, daß zwei Verdünnungsreihen in Zweierstufen, ausgehend von unverdünntem und 1:3 verdünntem Material, hergestellt wurden. Wir danken der Firma Abbott für die Bereitstellung der Test-Kits. Wir danken Prof. Dr. R. Thomssen für die überlassung der Referenzmaterialien. 1
2
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Lange u. a.: Nachweis von HBs-Antigen mit dem Hepanostika-Test
Im Ausria 11 125-Test wurden bei beiden Subgruppen noch Antigenkonzentrationen von 1,Q4 ng/ml nachgewiesen, im Hepanostika-Test 3,125 ng/ml des Subtyps ad und 2,08 ng/ml des Subtyps ay. Tab. 2. Nachweis von HBs-Antigen bei 2930 Blutspendern davon positive Reaktion reprodu-'I zierbar speziifISCh
Test
Hepanosticon-Test
9
9
I positiv o/p
9
0,3
Hepanostika-Test
133
85
85
. 2,9
Ausria II 125-Test
100
85
85
2,9
Unspezifische Reaktionen wurden im Ausria 11 125-Test in 0,5% und im Hepanostika-Test in 1,6010 festgestellt.
2. HBs-Antigen bei Blutspendern. 2930 Seren von Blutspendern des Berliner Blutspendedienstes wurden parallel in Hepanostika-, Ausria 11 125- und Hepanosticon-Test untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tab. 3. Spezifität positiver Reaktionen bei 180 ausgewählten Seren positive Reaktion
Test
davon
ifi h spezi sc
12,2
180
158
22
Hepanostika-Test
165
158
7
3,88
Ausria 11 125-Test
158
158
-
-
3. Vergleich der Spezifitat an Seren von Blutspendern, die im Hepanosticon-Test früher positiv reagiert hatten. Über längere Zeit wurden Seren von Blutspendern gesammelt, die im Hepanosticon-Test positiv reagiert hatten. Durch Nachuntersuchung und Spezifitätstest war bereits bekannt, daß ein Teil dieser Seren im HepanosticonTest unspezifisch reagiert hatte. Hier sollte geprüft werden, wieweit auch Hepanostika- und Ausria 11 125-Test solche unspezifisch reagierenden Seren erfaßten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Tab. 4. Dauer der Antigenpersistenz nach Hepatitis B bei 69 Patienten mit Hepatitis B Hepanostika-Test positiv
I
0/0
Tab. 5. Vergleich der Ergebnisse im Hepanostika- und Ausria 11 125-Test bei Einzelseren von 702 Patienten r::
., 0
>.-
010 unspeziunspezifisch fisch
o .,
spezifisch
positiv
Hepanostika-Test
214
202
28,7
12
1,7
Ausria 11 125-Test
213
207
29,3
6
0,85
Test
'p~ 'Vj
(';S
0/0
o.~
0/ 0
I unspezi-/ unspezifisch fisch
Hepanosticon-Test
Zeit nach Beginn der Hepatitis
4. Antigenpersistenz nach Hepatitis B. Bei 69 Patienten mit Hepatitis B wurden Serienblutentnahmen über 10 Monate nach Beginn der Hepatitis entnommen und auf HBs-Antigen untersucht. Die Ergebnisse des Hepanostika- und Ausria 11 125-Tests sind in Tabelle 4 zusammengestellt. _ 5. Untersuchung von Einzelseren aus der Routinediagnostik. Von 702 Patienten mit verschiedenen Erkrankungen der Leber und anderer Organsysteme wurden Einzelseren parallel im Hepanostika- und Ausria 11.125Test auf HBs-Antigen untersucht. Darunter befanden sich Patienten mit akuter Hepatitis, chronischen Leberschädigungen, Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems und anderen Krankheiten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt.
Ausria 11 125-Test positiv
I
0/0
1 Woche
69
100,0
69
2 Wochen
69
100,0
69
100,0
4 Wochen
69
100,0
69
100,0
6 Wochen
64
92,7
64
92,7
8 Wochen
46
66,7
49
71,0
10 Wochen
31
44,9
34
49,2
12 Wochen
19
27,5
20
29,0
100,0
4 Monate
12
17,4
12
17,4
6 Monate
6
8,7
6
8,7
8 Monate
6
8,7
6
8,7
10 Monate
5
7,2
5
7,2
Diskussion In früheren Untersuchungen (2, 3) war festgestellt worden, daß der als Ausria 11 125-Test bezeichnete Radioimmunoassay von Abbott der empfindlichste der zur Verfügurig stehenden Tests zum Nachweis von Hßs-Antigen war. Da dieser Test gleichzeitig in Spezifität und Praktikabilität sehr gut abschnitt, wurde er für die Untersuchung von Blutspendern auf HBs-Antigen empfohlen. Mehrere passive Hämagglutinationstests hatten sich als deutlich weniger empfindlich und als stärker belastet mit unspezifischen Reaktionen erwiesen. Ende 1976 untersuchten wir den Hepanostika-Test, einen Enzymimmunoassay der Firma Organon-Technika". Es sollte festgestellt werden, in welchem Qualitätsbereich dieser neue Test einzuordnen ist. Vom Prinzip her und aus einer ersten Mitteilung in der Literatur (4) war eine ähnlich hohe Empfindlichkeit zu erwarten wie beim Ausria 11 125-Test. In unseren Untersuchungen wurde daher der Hepanostika-Test direkt an der Leistungsfähigkeit des Ausria 11 125-Tests gemessen. Der Vergleich zeigte, daß beide Tests noch Antigenkonzentrationen unterhalb vori 5 ng/rnl erfassen konnten. Der Ausria 11 125-Test lag bei uns früher in einem Empfindlichkeitsbereich von 1 ng/ml für die Subgruppe ad und von 1,5 ng/ml für die Subgruppe ay (2, 3). Bei der erneuten Untersuchung der Referenzantigene von 1974 Ende 1976 wurden die gleichen Ergebnisse erzielt. Damit konnte gezeigt werden, daß die Lagerung dieser Materialien bei -20 -c innerhalb von 2 Jahren nicht zu einer Beeinträchtigung der Nachweisbarkeit des HBs-Antigens im Ausria 11 125-Test geführt hatte. Der Hepanostika-Test wies in diesen Referenz3 Wir danken der Firma Organon-Teknika für die überlassung der Test-Kits.
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Lange u. a.: Nachweis von Hßs-Anrigen mit dem Hepanostika-Test
Nr. 44, 4. November 1977, 102. ]g.
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materialien noch Antigenkonzentrationen von 4 ng/rnl für die Subgruppe ad und 2,9 ng/ml für die Subgruppe ay nach. Um sicherzustellen, daß dieses Ergebnis durch die Lagerung der untersuchten Antigenkonzentrationen nicht beeinträchtigt worden ist, wurden zusätzlich neue Referenzmaterialien vom Januar 1977 in beiden Tests untersucht. Dabei wurde als geringste nachweisbare Antigenkonzentration für den Ausria 11 125-Test übereinstimmend für beide Subgruppen 1,04ng/ml ermittelt. Der HepanostikaTest kam bei dieser Untersuchung auf 3,125 ng/ml für die Subgruppe ad und 2,08 ng/ml für die Subgruppe ay. Dieses Ergebnis wurde in drei unabhängig voneinander durchgeführten Untersuchungen reproduziert. Wolters und Mitarbeiter (4) ermittelten als geringste nachweisbare Antigenkonzentration mit dem Hepanostika-Test für die Subgruppe ad 10,5 ng/ml und für die Subgruppe ay 2,4 ng/ml. Bei uns schnitt der Hepanostika-Test damit deutlich besser ab. Die Differenz zwischen Ausria 11 125- und Hepanostika-Test ist erheblich geringer als zwischen Ausria 11 125-Test und den passiven Hämagglutinationen. Der bei der Bestimmung der geringsten nachweisbaren Antigenkonzentration festgestellten hohen Empfindlichkeit des Hepanostika-Tests entsprach auch das Ergebnis der. Untersuchung von Blutspendern. Im Ausria 11 125und Hepanostika-Test wurden übereinstimmend 85 Antigenträger ermittelt, im Hepanosticon-Test aber nur neun. Die Differenz zwischen Ausria 11 125- und Hepanostika-Test einerseits und dem Hepanosticon-Test andererseits entspricht den Erwartungen aufgrund unserer früheren Befunde (2,3). Auch bei der Untersuchung von Serienblutentnahmen von Hepatitispatienten wurde ein nahezu identisches Ergebnis im Ausria 11 125- und Hepanostika-Test ermittelt. Bei der Bestimmung der Dauer der Antigenpersistenz nach Hepatitis B zeigten beide Tests bis zu vier Wochen nach Beginn der Erkrankung in 100% der Seren HBsAntigen an. In der folgenden Zeit sank die Zahl der positiven Seren, wobei von der achten bis zwölften Woche nach Krankheitsbeginn der Ausria 11 125-Test etwas mehr antigenhaltige Seren erfaßte als der Hepanostika-Test. Vom vierten Monat nach Beginn der Hepatitis ab wurden wiederum übereinstimmende Ergebnisse erzielt. Die Differenz in der Anzeige von antigenhaitigen Seren in der Zeit von der achten bis zur zwölften Woche nach Beginn der Hepatitis könnte darauf zurückzuführen sein, daß in den Seren sehr niedrige Antigenkonzentrationen vorhanden waren, die von dem etwas empfindlicheren Radioimmunoassay noch erfaßt wurden, nicht aber vom Enzymimmunoassay. In Einzelseren von Patienten mit verschiedenartigen Erkrankungen zeigte der Hepanostika-Test 0,6% weniger Antigenträger an als der Ausria 11 125-Test. Auch diese Differenz dürfte Ausdruck des geringen Unterschiedes in der Empfindlichkeit beider Tests sein. Bei der Prüfung der Spezifität erwiesen sich im Hepanostika-Test 1,6-3,88% der positiven Reaktionen als nicht reproduzierbar und nicht spezifisch. Der Ausria 11 125-Test zeigte in 0,5-0,8 % unspezifische Reaktionen. Beide Tests liegen in diesem Punkt deutlich über
den passiven Hämagglutinationen, bei denen wir früher zwischen 37,5 und 55,3% unspezifische Reaktionen festgestellt hatten (2,3). Als drittes Kriterium für die Beurteilung der Qualität eines Tests sollte die Praktikabilität herangezogen werden. Wir hatten zu Beginn der Untersuchungen Probleme mit der Ablesung des Hepanostika-Tests, besonders im Bereich schwach positiver Reaktionen. In diesem Punkte erwies sich der Test als gewöhnungsbedürftig. Er stellte darin höhere Anforderungen als der Ausria 11 125-Test. Da die Herstellerfirma für den Hepanostika-Test die Benutzung eines Photometers zur Bewertung der Farbreaktionen nicht zwingend vorschreibt und in der Praxis aus Kostengründen die Ablesung mit dem Auge vorgezogen werden dürfte, verzichteten wir ebenfalls auf eine photometrische Auswertung. Aufgrund unserer Erfahrungen würden wir es jedoch begrüßen, wenn OrganonTeknika ein speziell an diesen Test angepaßtes Photometer einführen würde. Ein solches Photometer würde eine exakte Auswertung des Hepanostika-Tests im schwach positiven Bereich ermöglichen. Die Empfindlichkeit des Enzymsystems macht eine strenge Einhaltung der vom Hersteller vorgeschriebenen Testprozedur notwendig. Vor einer Abweichung von dieser Vorschrift muß dringend gewarnt werden. Das betrifft besonders die Inkubationszeiten. Wir beobachteten eine Verringerung der Empfindlichkeit des Tests bei Verkürzung der ersten Inkubationszeit. Nach Angaben des Herstellers sollen Metallionen sowie Lösungsmittel- und Säuredämpfe die Enzymreaktion beeinflussen. Ferner ist es notwendig, beim Einpipettieren des enzymmarkierten Antikörpers eine Verunreinigung der Wand der Mikrotiterlöcher zu vermeiden. An die Wand der Löcher gebrachte Proteine werden unspezifisch gebunden und können durch die Waschprozedur nicht beseitigt werden. Wenn enzymmarkierte Antikörper auf diese Weise gebunden worden sind, kann ein falsch-positives Ergebnis erzielt werden. In diesem Punkt erinnert der Test an den früheren Ausria 125-Test, den Vorläufer des heute gebräuchlichen Ausria 11 125-Tests. Bis zum fertigen Untersuchungsergebnis ist beim Hepanostika-Test mit 5-6 Stunden zu rechnen, wenn man die erste Inkubation bei 37 oe für zwei Stunden wählt, und entsprechend mehr, wenn die Inkubation über Nacht vorgezogen wird. Der Ausria 11 125-Test ist bereits nach etwa vier Stunden fertig. Beide Tests benötigen für die Prüfung der Spezifität nochmals etwa die gleiche Zeit. Sie dürften im allgemeinen hinsichtlich des Zeitaufwandes den Anforderungen des Blutspendewesens entsprechen. Auf der Grundlage unserer Untersuchungen können wir feststellen, daß nunmehr zwei hochempfindliche Testsysteme zum Nachweis von HBs-Antigen zur Verfügung stehen. Beide Tests stehen in bezug auf ihre Empfindlichkeit weit über allen anderen Testverfahren. Beide wiesen HBs-Antigen noch in Konzentrationen unter 5 ng/ml nach. Diesen beiden Tests kommt in der Empfindlichkeit - allerdings mit Abstand - der Auscell-Test, eine passive Hämagglutination von Abbott, am nächsten, der als ge-
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ringste Konzentration des HBs-Antigens 16 bzw. 23 ng/ml nachwies (2). Wie neuere Untersuchungen zeigten, ist dieser Test heute besser auswertbar als bei unserer Untersuchung im Jahre 1974/75 (Fricke, H.: persönliche Mitteilung 1977). Mit dem ersten Enzymimmunoassay steht eine Alternative zum Radioimmunoassay zur Verfügung. Das ist insbesondere angesichts der zunehmenden Umweltbelastung mit radioaktiven Substanzen von Interesse. Auch im Hinblick auf zu erwartende verschärfte Bestimmungen für den Umgang mit radioaktiven Substanzen ist die Entwicklung dieses neuen Testsystems zu begrüßen. Wir empfehlen daher den Hepanostika-Test ebenso wie den Ausria 11 125-Test für die Anwendung im Bereich des Blutspendewesens, aber auch für alle anderen Untersuchungen auf HBs-Antigen. Unsere langjährigen Erfahrungen mit der parallelen Untersuchung von Seren von Hepatitispatienten und anderen Patienten auf HBsAntigen im Ausria 11 125-Test und in einem passiven Hämagglutinationstest haben gezeigt, daß es nicht ausreicht, klinische Materialien allein mit einer passiven Hämagglutination zu untersuchen. Nur im Falle der Untersuchung von Seren aus der Frühphase der Hepatitis ist kaum eine Differenz zwischen Radioimmunoassay und passiver Hämagglutination zu erkennen (2,3). Bezüglich der Zielsetzung der Routineuntersuchung auf HBs-Antigen hat sich in der letzten Zeit eine Um-
orientierung vollzogen. Während früher Untersuchungen auf Hßs-Antigen der Differenzierung zwischen Hepatitis B und anderen Hepatitisformen dienten, werden heute in zunehmendem Maße solche Untersuchungen vorgenommen, um Antigenträger unter neu aufgenommenen Krankenhauspatienten zu erkennen und zu isolieren. Daher muß auch für das klinische Laboratorium die Benutzung eines möglichst empfindlichen Tests empfohlen werden. Dabei kann es sich nach dem heutigen Stand der Entwicklung nur um den Ausria 11 125- oder den Hepanostika- Test handeln. Literatur (1) Kouroupis, G. M., W. D. Leers: Radioimmunoassay-complement fixation and counter-immunoelectrophoresis in the laboratory diagnosis of hepatitis B. Arch. ges. Virusforsch. 43 (1973), 112. (2) Lange, W., H. Köhler, ]. Apodaca: Der Nachweis von Hepatiris-B-(Surface)Antigen. Ein Vergleich verschiedener serologischer Verfahren. Drsch. med. Wschr. 100 (1975), 508.
(3) Lange, W., H. Köhler, J. Apodaca: Der Nachweis von Hepariris-B-(Sudace)Antigen mit dem Hepatesr. Ein neuer passiver Hämagglutinationstest. Dtsch. med. Wschr. 101 (1976), 1273. (4) Wolrers, G., L. Kuijpers, ]. Kacaki, A. Schuurs: Solid-phase enzymeimmunoassay for detection of hepatitis B surface antigen. ]. clin, Path, 29 (1976), 873.
Dr. W. Lange, Dr. H. Köhler, Dr. J. Apodaca, Angelika Ott Fachgebiet für Hepatitis, Abteilung Virologie Robert-Koch-Institut des Bundesgesundheitsamtes 1000 Berlin 65, Nordufer 20 Dr. U. Sucker Berliner Blutspendedienst 1000 Berlin 65, Amrumer Straße 27
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