Klin. Pädiatr. 204 (1992)
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Klinische Bedeutung des Hepatitis-B-Virus-DNS-Nachweises im Serum von Kindern mit chronischer Hepatitis B S. Wirth, U. Möllers, E. Schaejer, U. Schwarze, B. Zabel
Zusammenfassung Zum Nachweis von HBV DNS wurden 206 Seren von 172 Kindern mit einer chronischen Hepatitis B mittels der dot-blot-Hybridisierung untersucht. 111 waren HBV-DNS-positiv, 95 negativ. 103 (78,6070) der positiven Patienten hatten HBeAg und 5 (7,70/0) anti-HBe im Serum. 60 (92,3070) der anti-HBe-positiven Seren wiesen keine HBV-DNS auf. Kinder mit pathologischen Leberfunktionsproben waren in 80,1070 HBV-DNS-positiv, während bei 71,6070 der Patienten mit normalen Leberwerten keine HBV-DNS nachweisbar war. Bei 87 der 95 dot-blot-negativen HBsAg-Trägern wurde die Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt. 73 (83,9070) Kinder waren mit dieser Untersuchungsmethode HBV-DNS-seropositiv. Alle HBeAg-positiven Patienten und jene mit erhöhten Transaminasen gehörten in diese Gruppe. Bei 56 anti-HBe-positiven chronischen HBsAg-Trägern war ebenfalls HBV-DNS nachweisbar, 14 waren negativ. Unsere Daten zeigen, daß replikative virale Sequenzen bei allen HBeAg-positiven und bei den meisten der antiHBe-positiven Kinder nachgewiesen werden können. Diese Patienten müssen als potentiell infektiös betrachtet werden. Für enge Bezugspersonen ist daher grundsätzlich eine aktive Schutzimpfung zu empfehlen.
Die chronische Hepatitis B ist durch den immunserologischen Nachweis von HBsAg charakterisiert. Weitere Marker sind HBeAg und der korrespondierende Antikörper anti-HBe. HBeAg im Serum wird mit einer aktiven Virusreplikation verbunden, während antiHBe in der Regel eine geringe entzündliche Aktivität der Erkrankung und eine verminderte Virusreplikation signalisiert (3, 12). Die Bestimmung von HBeAg und anti-HBe ist jedoch zur exakten Beurteilung einer Virusvermehrung und potentiellen Infektiosität nicht ausreichend. In den letzten Jahren hat sich die HBV-DNS-Analyse als zuverlässige und empfindliche Methode zum Virusnachweis erwiesen. Es stehen konventionelle Hybridisierungsverfahren (dot-blot-Hybridisierung) und technologisch aufwendigere Methoden wie die Polymerase-Kettenreaktion zur Verfügung (4, 7, 13). Die Nachweisgrenze der konventionellen Hybridisierungstechniken liegt bei etwa 0,1 pg, ent-
Klin. Pädialr. 204 (1992) 155-157 © 1992 F. Enke Verlag Slullgart
Clinical Significance of HBV DNA in Serum of Children with Chronic Hepatitis B 206 sera from 172 children with chronic hepatitis Binfeetion were tested for HBV DNA by dot blot hybridization. 111 were positive and 95 negative for HBV DNA. 103 (78.6070) of the positive patients had HBeAg and 5 (7.7070) anti-HBe. In 60 (92.3~IO) of the anti-HBe positive sera no HBV DNA could be detected. Children with elevated liver enzymes had HBV DNA in 80.1 %, whereas in 71.6070 of the chronic HBsAg carriers with normalliver enzymes no HBV DNA was found. In 87 of the 95 dot blot negative patients polymerase chain reaction was performed. 73 (83.9070) children of this group were HBV DNA positive. All HBeAg positive patients and those with elevated aminotransferases had HBV DNA in their serum. 56 anti-HBe-positive HBsAg carriers were also positive; 14 were negative for HBV DNA. Dur results demonstrate that viral sequences can be found in all HBeAg positive and in most of the antiHBe positive children. Patients with ongoing virus replication have to be considered infectious and recommendation for vaccination of dose relatives of these patients must be stressed.
sprechend 30000 Hepatitis-B-Virus-Genome. Untersuchungen bei Erwachsenen haben gezeigt, daß über 80070 der HBeAg und etwa 25070 der anti-HBe-positiven Seren HBV-DNS mit der dot-blot-Hybridisierung aufweisen (9). Mit der Polymerase-Kettenreaktion kann die Sensitivität des HBV-DNS-Nachweises wesentlich erhöht werden, so daß bei über 80070 der anti-HBe-positiven Patienten HBVDNS mit der PCR nachgewiesen werden konnte (1, 10). Bei Kindern ist die Kenntnis einer potentiellen Infektiosität von klinischer Bedeutung, da enge Bezugspersonen durch eine aktive Schutzimpfung zuverlässig vor der Infektion geschützt werden können. Wir haben daher die HBV-DNS bei Kindern mit chronischer Hepatitis B mit einer konventionellen Hybridisierungstechnik und der Polymerase-Kettenreaktion bestimmt, um die Häufigkeit des HBV-DNS-Nachweises mit den konventionellen HBVMarkern zu vergleichen.
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Kinderklinik der Johannes-Gulenberg-Universitäl
S. Wirth et 01.
Klin. Pädiotr. 204 (1992) Material und Methode Insgesamt wurde HBV DNS in 206 Seren von 172 Kindern mit chronischer Hepatitis Buntersucht. Das Alter der Patienten lag zwischen 0,3 und 20 Jahren (Mittelwert II Jahre). Die Krankheitsdauer betrug bei der Untersuchung 0,3-16,5 Jahre (Mittelwert 4,7 Jahre). Bei allen Patienten erfolgte gleichzeitig die Bestimmung der Serumtransaminasen und konventionellen immunserologischen Hepatitis-B-Marker (HBsAg, HBeAg, anti-HBe, anti-HBc; Abbott Diagnostika).
HB V DNS im Serum
Tab. 1 Nachweis von Hepatitis-B-Virus-DNS mit der dot-blotHybridisierung bei Kindern mit chronischer Hepatitis B In Relation zum HBeAg/anti-HBe-Status
HBeAg + Anti-HBe + HBeAg/Anti-HBe -
103 (78,6%) 5(7,7%) 3 (30,0%)
28 (21,4%) 60 (92,3%) 7 (70,0%)
131 65 10
Summe
111
95
206
Tab. 2 Hepatitis-B-Virus-DNS (dot-blot-Hybridisierung) im Serum von Kindern mit chronischer Hepatitis B in Bezug zu den Serumtransaminasen
I HBV DNS + I HBV DNS - I Summe
Transaminasen
Polymerose-Kettenreoktion Für die PCR wurden Sequenzen aus der HBV-preC/C-Region synthetisiert (Applied Biosystems, DNS-Synthesegerät) und als Primer verwendet (Primer I: 5'-CCACTGTTCAAGCCTCCAAAG-3 " Primer 2: 5'TTAGTGCGAATCCACACTC-3 '). Das Reaktionsgemisch zur Amplifizierung bestand aus I I1g Phenol/Chloroform gereinigte DNS aus 100 111 Serum, 0,4 I1mol/1 jeden Primers, 200 I1mol/1 jeden Nukleotids, 50 mM KCI, 1,5 mM MgClz, 10 mM Tris HCI pH 8.3, 0,01010 Gelatine und 2,5 U Taq-Polymerase (perkin Eimer Cetus). Es wurden 40 Zyklen durchgeführt (2 Min. 94°, 2 Min. 55°, 3 Min. 72 0C). Negative und definierte positive Kontrollen wurden in jedem Experiment mitbestimmt. Nach der Amplifizierung wurden 10 111 jeder Probe auf ein 2% Agarosegel aufgetragen und mit Ethidiumbromid gefärbt. Anschließend erfolgte der Transfer auf eine Nylonmembran (Genescreen-plus-Membran, NEN).Die Southern-blot-Hybridisierung wurde mit einer kompletten 32CTP-markierten HBV-DNS-Probe durchgeführt und anschließend bei -70°C autoradiografiert (Hyperfilm-MT, Amersham). Die Amplifikationsprodukte hatten eine Länge von 427 Basenpaaren. Ergebnisse Von den 206 auf HBV DNS untersuchten Seren waren in der dot-blot-Hybridisierung 111 positiv. Bei 95 Untersuchungen konnte mit diesem Verfahren keine HBV-DNS nachgewiesen werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt. 78,6% der HBeAg positiven, 7,7% der anti-HBe-positiven und 30% der HBeAg und anti-HBe-negativen Seren waren HBV-DNS-positiv. 21,4% der HBeAg positiven und 92,3% der anti-HBe-po-
I Summe
-
HBV DNS +
Dot-blot-Hybridisierung 100111 Serum wurden nativ auf eine Nylonmembran (Nytran, Schleicher & Schuell) aufgetropft und unter leichtem Vakuum filtriert. Nach Denaturierung und Neutralisation der Nylonmembran erfolgte die Hybridisierung mit einer klonierten HBV-DNS-Sonde. Diese Sonde wurde durch Nick-translation mit 32p_CTP markiert, wobei regelmäßig eine spezifische Aktivität von 2-4 x 10 8 cpm/l1g DNS erreicht wurde.
I HBV DNS
Marker
SGOT/SGPT erhöht SGOT/SGPT normal
89 (80,1%) 22 (19,9%) 111
Summe
27 128,4%) 68 (71,6%)
116 90
95
206
Tab. 3 Nachweis viraler DNS mit der Polymerase-Kettenreaktion bei 87 Kindern mit chronischer Hepatitis B in Relation zum HBeAg/anti-HBe-Status und den Leberfunktionsproben. Alle Seren waren in der dot-blot-Hybridisierung negativ Marker
HBV DNS +
HBV DNS -
HBeAg + Anti-HBe + HBeAg/anti-HBe -
14 56 3
0 14 0
Transaminasen erhöht Transaminasen normal
19 54
0 14
sitiven bzw. 70% der HBeAg/anti-HBe-negativen Proben hatten keine HBV-DNS im Serum. Patienten mit erhöhten Serumtransaminasen hatten in 80,1% HBV-DNS im Serum, während 71,6% der Kinder mit normalen Leberwerten negativ waren (Tabelle 2). Bei 28,4% der Patienten mit erhöhten Leberfunktionsproben konnte keine HBVDNS nachgewiesen werden. Von den 95 im dot-blot-Verfahren negativen Seren, wurden 87 mit der PCR weiter untersucht. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. 73 Patienten waren HBV-DNS positiv und 14 negativ. Von den 14 HBeAg positiven Kindern hatten alle HBV-DNS im Serum. Das gleiche galt für die 19 untersuchten Patienten mit erhöhten Leberwerten. 56 antiHBe-positive chronische HBsAg-Träger wiesen ebenfalls HBV-DNS im Serum auf. 14 Seren waren HBV-DNS negativ; alle hatten anti-HBe. Insgesamt konnte also nur bei 14 von 87 (16,1%) der untersuchten Patienten auch mit der PCR keine HBV-DNA nachgewiesen werden. Diskussion Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, daß die Bestimmung der HBV-DNS im Serum von chronischen HBsAg-Trägern der empfindlichste Parameter darstellt, eine Virusreplikation und damit Infektiosität nach-
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Hepatitis-B- Virus-DNS-Nachweis im Serum von Kindern mit chronischer Hepatitis B
Die chronische Hepatitis B im Kindesalter ist durch zwei verschiedene Phasen charakterisiert. In der ersten, relativ frühen Phase der Erkrankung, bestehen laborchemisch und histologisch meist erhebliche Aktivitätszeichen. Die Seren dieser Kinder sind HBeAg positiv. Im Verlauf kann es zu einer im Einzelfall nicht prognostizierbaren Sero konversion von HBeAg zu anti-HBe kommen. Diese zweite Phase geht in der Regel mit der Normalisierung der Serumtransaminasen und der Besserung des histologischen Befundes einher. Von besonderer klinischer Bedeutung ist in diesem Zusammenhang der Nachweis der potentiellen Infektiosität. Nach unseren Ergebnissen haben fast 80070 aller HBeAg-positiven Patienten mit dem dot-blot-Verfahren nachweisbare HBV-DNS im Serum. Auch ein geringer Prozentsatz (7,7070) der anti-HBe-positiven Kinder weist noch HBV-DNS im Serum auf. Nimmt man bei den negativen Befunden die Polymerase-Kettenreaktion zu Hilfe, so läßt sich zeigen, daß die übrigen 20070 der HBeAg-positiven Kinder, die zuvor negativ waren, ebenfalls replikative Sequenzen aufweisen. Darüber hinaus haben lediglich 20070 der anti-HBe-positiven, im dot blot negativen Seren, auch mit der PCR keine nachweisbare HBV-DNS. Diese Daten stimmen mit Untersuchungen bei Erwachsenen überein (5, 6, 8). Bei Kindern mit erhöhten Leberfunktionsproben ist unabhängig vom HBeAg/anti-HBe-Status eine aktive Virusreplikation zu erwarten. Die Ergebnisse unterstreichen, daß die PCR die derzeit empfindlichste Untersuchungsmethode ist, um virale Sequenzen im Serum von chronischen HBsAg-Trägern nachzuweisen. Es wird deutlich, daß mit der Serokonversion von HBeAg zu anti-HBe keineswegs ein vollständiger Stop der Virusreplikation eintritt. Die Konzentration viraler Sequenzen ist bei diesen Kindern aber wesentlich niedriger. Man kann also davon ausgehen, daß fast jeder chronische HBsAg-Träger unabhängig von seinem HBeAg/anti-HBe-Status als potentiell infektiös zu gelten hat. Es wurde bei Schimpanzen gezeigt, daß auch kleinste Mengen HBV-DNS, die nur mit der PCR nachgewiesen werden konnten, eine akute Hepatitis induzieren können (15). Ebenso ist eine Ansteckung Neugeborener durch ihre anti-HBe-positiven Mütter bekannt. Diese Kinder entwikkein häufig eine fulminante Hepatitis B (14). Unsere Daten zeigen aber, daß das Infektionsrisiko bei anti-HBe-po-
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sitiven Kindern wesentlich niedriger ist als bei den meisten HBeAg-positiven Patienten. Aufgrund der potentiellen Infektiosität sollte jedoch immer die aktive Schutzimpfung enger Bezugspersonen durchgeführt werden. Literatur Baker, B. L., A. M. Di Bisceglie, S. Kaneko, R. Miller, S. M. Feinstone, J. G. Waggoner, J. H. Hoofnagle: Determination of hepatitis B virus DNA in serum using the polymerase ehain reaetion: dinieal signifieanee and eorrelation with serologieal and bioehemieal markers. Hepatology 13 (1991) 632-636 2 Bonino, F.: The importanee of hepatitis B viral DNA in serum and Iiver. J. Hepatol. 3 (1986) 136-141 3 Bortolotti, F., P. Cadrobbi, C. Crivellaro, M. Guido, M. Rugge, F. Noventa, R. Calzia, G. Realdi: Long-term outeome of ehronie type B hepatitis in patients who aequire hepatitis B virus infection in ehildhood. Gastroenterology 99 (1990) 805-810 4 Feinman, S. v., B. Berr/s, O. Fay, R. Sooknanan, H. E. Tanno, W. W. Tung, H. M. Lieberman: Serum HBV-DNA (Hepatitis B Virus DNA) in aeute and ehronie hepatitis Binfeetion. Clin. Invest. Med. I1 (1988) 286-291 5 Gerken, G., P. Paterlini, M. Manns, C. Housset, S. Terre, H.-P. Dienes, G. Hess, W. H. GerIich, P. Berthelost, K.-H. Meyer zum Büschenfelde, C. Brechot: Assay of hepatitis B virus DNA by polymerase chain reaction and its relationship to pre-S- and S-eneoded viral surface antigens. Hepatology 13 (1991) 158-166 6 Hofmann, H., W. Tuma, F. X. Heinz, Ch. Kunz: Virale Nukleinsäure im Serum von Hepatitis-B-Patienten. Wien. Klin. Wochensehr. 100 (1988) 52-55 7 Kaneko, S., R. H. Miller, A. M. Di Biseglie, S. M. Feinstone, J. H. Hoofnagle, R. H. PureeIl: Deteetion of hepatitis B virus DNA in serum by polymerase ehain reaetion. Gastroenterology 99 (1990) 799804 8 Karayannis, P., M. J. F. Fowler, A. S. F. Lok, C. Greenfield, J. Monlardino, H. C. Thomas: Deteetion of serum HBV-DNA by moleeular hybridization. J. Hepatol. 1 (1985) 99-106 9 Kroogsgard, K.: Hepatitis B virus DNA in Serum. Applied moleeular biology in the evaluation of hepatitis Binfeetion. Liver 8 (1988) 257283 10 Monjardino, J., J. Velosa, H. C. Thomas, M. Carneiro de Moura: Serum HBV DNA deteeted by PCR in dot blot negative HBV ehronie carriers with aetive liver disease. J. Hepatol. 13 (1991) 44-48 11 Pao, C. c., D. S. Yao, C. Y. Lin, S. M. Kao, K. C. Tsao, C. F. Sun, Y. F. Liaw: Serum hepatitis B virus DNA in hepatitis B ~irus seropositive and seronegative patients with normalliver funetion. Am. J. Clin. Pathol. 95 (1991) 591-596 12 Ruiz-Moreno, M., T. Camps, J. G. Aguado. J. C. Pon'es, H. Oliva, J. Bartolome, V. Carreno: Serologieal and histologieal follow up of chronie hepatitis Binfeetion. Areh. Dis. Child. 64 (1989) 1165-1169 13 Santantonio, T., P. Pontisso, M. Milella, L. Chemello, N. Luchena, G. Pastore: Deteetion of hepatitis B virus DNA in serum by spot hybridization teehnique: sensitivity and speeifity of radiolabeled and biotin-Iabeled probes. Res. Clin. Lab. 20 (1990) 29-35 14 Terazawa, S., M. Kojima, T. Yamanaka, S. Yotsumoto, H. Okamoto, F. Tsuda, Y. Miyakawa, M. Mayumi: Hepatitis B virus mutants with preeore region defeets in two babies with fulminant hepatitis and their mothers positive for antibody to hepatitis B e antigen. Ped. Res. 29 (1991) 5-9 15 Thiers, V., E. Nakajima, D. Kremsdorf, D. Mack, H. Schellekens, F. Driss, A. Goudeau, J. Wands, J. Sninsky, P. Tiollais, C. Brechot: Transmission of hepatitis B from hepatitis B seronegative subjeets. Laneet 2 (1988) 1273-1276 1
Dr. med. Stefan Wirth Kinderklinik der J ohannes-Gutenberg-U niversität Langenbeekstraße 1 6500 Mainz
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zuweisen (2). Die konventionellen Hybridisierungsverfahren haben eine begrenzte Sensitivität, so daß nur mit der wesentlich empfindlicheren Polymerase-Kettenreaktion kleinste Mengen viraler Sequenzen entdeckt werden können (11). Ein gewisses Problem bei dieser Methode ist gerade die hohe Sensitivität, da die geringste Kontaminierung zu falsch positiven Ergebnissen führt. Bei unseren Untersuchungen waren alle Negativkontrollen regelmäßig negativ, so daß wir bei den Ergebnissen Kontaminationen ausschließen konnten.
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Klinische Bedeutung des Hepatitis-B-Virus-DNS-Nachweises im Serum von Kindern mit chronischer Hepatitis B S. Wirth, U. Möllers, E. Schaejer, U. Schwarze, B. Zabel
Zusammenfassung Zum Nachweis von HBV DNS wurden 206 Seren von 172 Kindern mit einer chronischen Hepatitis B mittels der dot-blot-Hybridisierung untersucht. 111 waren HBV-DNS-positiv, 95 negativ. 103 (78,6070) der positiven Patienten hatten HBeAg und 5 (7,70/0) anti-HBe im Serum. 60 (92,3070) der anti-HBe-positiven Seren wiesen keine HBV-DNS auf. Kinder mit pathologischen Leberfunktionsproben waren in 80,1070 HBV-DNS-positiv, während bei 71,6070 der Patienten mit normalen Leberwerten keine HBV-DNS nachweisbar war. Bei 87 der 95 dot-blot-negativen HBsAg-Trägern wurde die Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt. 73 (83,9070) Kinder waren mit dieser Untersuchungsmethode HBV-DNS-seropositiv. Alle HBeAg-positiven Patienten und jene mit erhöhten Transaminasen gehörten in diese Gruppe. Bei 56 anti-HBe-positiven chronischen HBsAg-Trägern war ebenfalls HBV-DNS nachweisbar, 14 waren negativ. Unsere Daten zeigen, daß replikative virale Sequenzen bei allen HBeAg-positiven und bei den meisten der antiHBe-positiven Kinder nachgewiesen werden können. Diese Patienten müssen als potentiell infektiös betrachtet werden. Für enge Bezugspersonen ist daher grundsätzlich eine aktive Schutzimpfung zu empfehlen.
Die chronische Hepatitis B ist durch den immunserologischen Nachweis von HBsAg charakterisiert. Weitere Marker sind HBeAg und der korrespondierende Antikörper anti-HBe. HBeAg im Serum wird mit einer aktiven Virusreplikation verbunden, während antiHBe in der Regel eine geringe entzündliche Aktivität der Erkrankung und eine verminderte Virusreplikation signalisiert (3, 12). Die Bestimmung von HBeAg und anti-HBe ist jedoch zur exakten Beurteilung einer Virusvermehrung und potentiellen Infektiosität nicht ausreichend. In den letzten Jahren hat sich die HBV-DNS-Analyse als zuverlässige und empfindliche Methode zum Virusnachweis erwiesen. Es stehen konventionelle Hybridisierungsverfahren (dot-blot-Hybridisierung) und technologisch aufwendigere Methoden wie die Polymerase-Kettenreaktion zur Verfügung (4, 7, 13). Die Nachweisgrenze der konventionellen Hybridisierungstechniken liegt bei etwa 0,1 pg, ent-
Klin. Pädialr. 204 (1992) 155-157 © 1992 F. Enke Verlag Slullgart
Clinical Significance of HBV DNA in Serum of Children with Chronic Hepatitis B 206 sera from 172 children with chronic hepatitis Binfeetion were tested for HBV DNA by dot blot hybridization. 111 were positive and 95 negative for HBV DNA. 103 (78.6070) of the positive patients had HBeAg and 5 (7.7070) anti-HBe. In 60 (92.3~IO) of the anti-HBe positive sera no HBV DNA could be detected. Children with elevated liver enzymes had HBV DNA in 80.1 %, whereas in 71.6070 of the chronic HBsAg carriers with normalliver enzymes no HBV DNA was found. In 87 of the 95 dot blot negative patients polymerase chain reaction was performed. 73 (83.9070) children of this group were HBV DNA positive. All HBeAg positive patients and those with elevated aminotransferases had HBV DNA in their serum. 56 anti-HBe-positive HBsAg carriers were also positive; 14 were negative for HBV DNA. Dur results demonstrate that viral sequences can be found in all HBeAg positive and in most of the antiHBe positive children. Patients with ongoing virus replication have to be considered infectious and recommendation for vaccination of dose relatives of these patients must be stressed.
sprechend 30000 Hepatitis-B-Virus-Genome. Untersuchungen bei Erwachsenen haben gezeigt, daß über 80070 der HBeAg und etwa 25070 der anti-HBe-positiven Seren HBV-DNS mit der dot-blot-Hybridisierung aufweisen (9). Mit der Polymerase-Kettenreaktion kann die Sensitivität des HBV-DNS-Nachweises wesentlich erhöht werden, so daß bei über 80070 der anti-HBe-positiven Patienten HBVDNS mit der PCR nachgewiesen werden konnte (1, 10). Bei Kindern ist die Kenntnis einer potentiellen Infektiosität von klinischer Bedeutung, da enge Bezugspersonen durch eine aktive Schutzimpfung zuverlässig vor der Infektion geschützt werden können. Wir haben daher die HBV-DNS bei Kindern mit chronischer Hepatitis B mit einer konventionellen Hybridisierungstechnik und der Polymerase-Kettenreaktion bestimmt, um die Häufigkeit des HBV-DNS-Nachweises mit den konventionellen HBVMarkern zu vergleichen.
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Kinderklinik der Johannes-Gulenberg-Universitäl
S. Wirth et 01.
Klin. Pädiotr. 204 (1992) Material und Methode Insgesamt wurde HBV DNS in 206 Seren von 172 Kindern mit chronischer Hepatitis Buntersucht. Das Alter der Patienten lag zwischen 0,3 und 20 Jahren (Mittelwert II Jahre). Die Krankheitsdauer betrug bei der Untersuchung 0,3-16,5 Jahre (Mittelwert 4,7 Jahre). Bei allen Patienten erfolgte gleichzeitig die Bestimmung der Serumtransaminasen und konventionellen immunserologischen Hepatitis-B-Marker (HBsAg, HBeAg, anti-HBe, anti-HBc; Abbott Diagnostika).
HB V DNS im Serum
Tab. 1 Nachweis von Hepatitis-B-Virus-DNS mit der dot-blotHybridisierung bei Kindern mit chronischer Hepatitis B In Relation zum HBeAg/anti-HBe-Status
HBeAg + Anti-HBe + HBeAg/Anti-HBe -
103 (78,6%) 5(7,7%) 3 (30,0%)
28 (21,4%) 60 (92,3%) 7 (70,0%)
131 65 10
Summe
111
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Tab. 2 Hepatitis-B-Virus-DNS (dot-blot-Hybridisierung) im Serum von Kindern mit chronischer Hepatitis B in Bezug zu den Serumtransaminasen
I HBV DNS + I HBV DNS - I Summe
Transaminasen
Polymerose-Kettenreoktion Für die PCR wurden Sequenzen aus der HBV-preC/C-Region synthetisiert (Applied Biosystems, DNS-Synthesegerät) und als Primer verwendet (Primer I: 5'-CCACTGTTCAAGCCTCCAAAG-3 " Primer 2: 5'TTAGTGCGAATCCACACTC-3 '). Das Reaktionsgemisch zur Amplifizierung bestand aus I I1g Phenol/Chloroform gereinigte DNS aus 100 111 Serum, 0,4 I1mol/1 jeden Primers, 200 I1mol/1 jeden Nukleotids, 50 mM KCI, 1,5 mM MgClz, 10 mM Tris HCI pH 8.3, 0,01010 Gelatine und 2,5 U Taq-Polymerase (perkin Eimer Cetus). Es wurden 40 Zyklen durchgeführt (2 Min. 94°, 2 Min. 55°, 3 Min. 72 0C). Negative und definierte positive Kontrollen wurden in jedem Experiment mitbestimmt. Nach der Amplifizierung wurden 10 111 jeder Probe auf ein 2% Agarosegel aufgetragen und mit Ethidiumbromid gefärbt. Anschließend erfolgte der Transfer auf eine Nylonmembran (Genescreen-plus-Membran, NEN).Die Southern-blot-Hybridisierung wurde mit einer kompletten 32CTP-markierten HBV-DNS-Probe durchgeführt und anschließend bei -70°C autoradiografiert (Hyperfilm-MT, Amersham). Die Amplifikationsprodukte hatten eine Länge von 427 Basenpaaren. Ergebnisse Von den 206 auf HBV DNS untersuchten Seren waren in der dot-blot-Hybridisierung 111 positiv. Bei 95 Untersuchungen konnte mit diesem Verfahren keine HBV-DNS nachgewiesen werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt. 78,6% der HBeAg positiven, 7,7% der anti-HBe-positiven und 30% der HBeAg und anti-HBe-negativen Seren waren HBV-DNS-positiv. 21,4% der HBeAg positiven und 92,3% der anti-HBe-po-
I Summe
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HBV DNS +
Dot-blot-Hybridisierung 100111 Serum wurden nativ auf eine Nylonmembran (Nytran, Schleicher & Schuell) aufgetropft und unter leichtem Vakuum filtriert. Nach Denaturierung und Neutralisation der Nylonmembran erfolgte die Hybridisierung mit einer klonierten HBV-DNS-Sonde. Diese Sonde wurde durch Nick-translation mit 32p_CTP markiert, wobei regelmäßig eine spezifische Aktivität von 2-4 x 10 8 cpm/l1g DNS erreicht wurde.
I HBV DNS
Marker
SGOT/SGPT erhöht SGOT/SGPT normal
89 (80,1%) 22 (19,9%) 111
Summe
27 128,4%) 68 (71,6%)
116 90
95
206
Tab. 3 Nachweis viraler DNS mit der Polymerase-Kettenreaktion bei 87 Kindern mit chronischer Hepatitis B in Relation zum HBeAg/anti-HBe-Status und den Leberfunktionsproben. Alle Seren waren in der dot-blot-Hybridisierung negativ Marker
HBV DNS +
HBV DNS -
HBeAg + Anti-HBe + HBeAg/anti-HBe -
14 56 3
0 14 0
Transaminasen erhöht Transaminasen normal
19 54
0 14
sitiven bzw. 70% der HBeAg/anti-HBe-negativen Proben hatten keine HBV-DNS im Serum. Patienten mit erhöhten Serumtransaminasen hatten in 80,1% HBV-DNS im Serum, während 71,6% der Kinder mit normalen Leberwerten negativ waren (Tabelle 2). Bei 28,4% der Patienten mit erhöhten Leberfunktionsproben konnte keine HBVDNS nachgewiesen werden. Von den 95 im dot-blot-Verfahren negativen Seren, wurden 87 mit der PCR weiter untersucht. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. 73 Patienten waren HBV-DNS positiv und 14 negativ. Von den 14 HBeAg positiven Kindern hatten alle HBV-DNS im Serum. Das gleiche galt für die 19 untersuchten Patienten mit erhöhten Leberwerten. 56 antiHBe-positive chronische HBsAg-Träger wiesen ebenfalls HBV-DNS im Serum auf. 14 Seren waren HBV-DNS negativ; alle hatten anti-HBe. Insgesamt konnte also nur bei 14 von 87 (16,1%) der untersuchten Patienten auch mit der PCR keine HBV-DNA nachgewiesen werden. Diskussion Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, daß die Bestimmung der HBV-DNS im Serum von chronischen HBsAg-Trägern der empfindlichste Parameter darstellt, eine Virusreplikation und damit Infektiosität nach-
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Hepatitis-B- Virus-DNS-Nachweis im Serum von Kindern mit chronischer Hepatitis B
Die chronische Hepatitis B im Kindesalter ist durch zwei verschiedene Phasen charakterisiert. In der ersten, relativ frühen Phase der Erkrankung, bestehen laborchemisch und histologisch meist erhebliche Aktivitätszeichen. Die Seren dieser Kinder sind HBeAg positiv. Im Verlauf kann es zu einer im Einzelfall nicht prognostizierbaren Sero konversion von HBeAg zu anti-HBe kommen. Diese zweite Phase geht in der Regel mit der Normalisierung der Serumtransaminasen und der Besserung des histologischen Befundes einher. Von besonderer klinischer Bedeutung ist in diesem Zusammenhang der Nachweis der potentiellen Infektiosität. Nach unseren Ergebnissen haben fast 80070 aller HBeAg-positiven Patienten mit dem dot-blot-Verfahren nachweisbare HBV-DNS im Serum. Auch ein geringer Prozentsatz (7,7070) der anti-HBe-positiven Kinder weist noch HBV-DNS im Serum auf. Nimmt man bei den negativen Befunden die Polymerase-Kettenreaktion zu Hilfe, so läßt sich zeigen, daß die übrigen 20070 der HBeAg-positiven Kinder, die zuvor negativ waren, ebenfalls replikative Sequenzen aufweisen. Darüber hinaus haben lediglich 20070 der anti-HBe-positiven, im dot blot negativen Seren, auch mit der PCR keine nachweisbare HBV-DNS. Diese Daten stimmen mit Untersuchungen bei Erwachsenen überein (5, 6, 8). Bei Kindern mit erhöhten Leberfunktionsproben ist unabhängig vom HBeAg/anti-HBe-Status eine aktive Virusreplikation zu erwarten. Die Ergebnisse unterstreichen, daß die PCR die derzeit empfindlichste Untersuchungsmethode ist, um virale Sequenzen im Serum von chronischen HBsAg-Trägern nachzuweisen. Es wird deutlich, daß mit der Serokonversion von HBeAg zu anti-HBe keineswegs ein vollständiger Stop der Virusreplikation eintritt. Die Konzentration viraler Sequenzen ist bei diesen Kindern aber wesentlich niedriger. Man kann also davon ausgehen, daß fast jeder chronische HBsAg-Träger unabhängig von seinem HBeAg/anti-HBe-Status als potentiell infektiös zu gelten hat. Es wurde bei Schimpanzen gezeigt, daß auch kleinste Mengen HBV-DNS, die nur mit der PCR nachgewiesen werden konnten, eine akute Hepatitis induzieren können (15). Ebenso ist eine Ansteckung Neugeborener durch ihre anti-HBe-positiven Mütter bekannt. Diese Kinder entwikkein häufig eine fulminante Hepatitis B (14). Unsere Daten zeigen aber, daß das Infektionsrisiko bei anti-HBe-po-
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sitiven Kindern wesentlich niedriger ist als bei den meisten HBeAg-positiven Patienten. Aufgrund der potentiellen Infektiosität sollte jedoch immer die aktive Schutzimpfung enger Bezugspersonen durchgeführt werden. Literatur Baker, B. L., A. M. Di Bisceglie, S. Kaneko, R. Miller, S. M. Feinstone, J. G. Waggoner, J. H. Hoofnagle: Determination of hepatitis B virus DNA in serum using the polymerase ehain reaetion: dinieal signifieanee and eorrelation with serologieal and bioehemieal markers. Hepatology 13 (1991) 632-636 2 Bonino, F.: The importanee of hepatitis B viral DNA in serum and Iiver. J. Hepatol. 3 (1986) 136-141 3 Bortolotti, F., P. Cadrobbi, C. Crivellaro, M. Guido, M. Rugge, F. Noventa, R. Calzia, G. Realdi: Long-term outeome of ehronie type B hepatitis in patients who aequire hepatitis B virus infection in ehildhood. Gastroenterology 99 (1990) 805-810 4 Feinman, S. v., B. Berr/s, O. Fay, R. Sooknanan, H. E. Tanno, W. W. Tung, H. M. Lieberman: Serum HBV-DNA (Hepatitis B Virus DNA) in aeute and ehronie hepatitis Binfeetion. Clin. Invest. Med. I1 (1988) 286-291 5 Gerken, G., P. Paterlini, M. Manns, C. Housset, S. Terre, H.-P. Dienes, G. Hess, W. H. GerIich, P. Berthelost, K.-H. Meyer zum Büschenfelde, C. Brechot: Assay of hepatitis B virus DNA by polymerase chain reaction and its relationship to pre-S- and S-eneoded viral surface antigens. Hepatology 13 (1991) 158-166 6 Hofmann, H., W. Tuma, F. X. Heinz, Ch. Kunz: Virale Nukleinsäure im Serum von Hepatitis-B-Patienten. Wien. Klin. Wochensehr. 100 (1988) 52-55 7 Kaneko, S., R. H. Miller, A. M. Di Biseglie, S. M. Feinstone, J. H. Hoofnagle, R. H. PureeIl: Deteetion of hepatitis B virus DNA in serum by polymerase ehain reaetion. Gastroenterology 99 (1990) 799804 8 Karayannis, P., M. J. F. Fowler, A. S. F. Lok, C. Greenfield, J. Monlardino, H. C. Thomas: Deteetion of serum HBV-DNA by moleeular hybridization. J. Hepatol. 1 (1985) 99-106 9 Kroogsgard, K.: Hepatitis B virus DNA in Serum. Applied moleeular biology in the evaluation of hepatitis Binfeetion. Liver 8 (1988) 257283 10 Monjardino, J., J. Velosa, H. C. Thomas, M. Carneiro de Moura: Serum HBV DNA deteeted by PCR in dot blot negative HBV ehronie carriers with aetive liver disease. J. Hepatol. 13 (1991) 44-48 11 Pao, C. c., D. S. Yao, C. Y. Lin, S. M. Kao, K. C. Tsao, C. F. Sun, Y. F. Liaw: Serum hepatitis B virus DNA in hepatitis B ~irus seropositive and seronegative patients with normalliver funetion. Am. J. Clin. Pathol. 95 (1991) 591-596 12 Ruiz-Moreno, M., T. Camps, J. G. Aguado. J. C. Pon'es, H. Oliva, J. Bartolome, V. Carreno: Serologieal and histologieal follow up of chronie hepatitis Binfeetion. Areh. Dis. Child. 64 (1989) 1165-1169 13 Santantonio, T., P. Pontisso, M. Milella, L. Chemello, N. Luchena, G. Pastore: Deteetion of hepatitis B virus DNA in serum by spot hybridization teehnique: sensitivity and speeifity of radiolabeled and biotin-Iabeled probes. Res. Clin. Lab. 20 (1990) 29-35 14 Terazawa, S., M. Kojima, T. Yamanaka, S. Yotsumoto, H. Okamoto, F. Tsuda, Y. Miyakawa, M. Mayumi: Hepatitis B virus mutants with preeore region defeets in two babies with fulminant hepatitis and their mothers positive for antibody to hepatitis B e antigen. Ped. Res. 29 (1991) 5-9 15 Thiers, V., E. Nakajima, D. Kremsdorf, D. Mack, H. Schellekens, F. Driss, A. Goudeau, J. Wands, J. Sninsky, P. Tiollais, C. Brechot: Transmission of hepatitis B from hepatitis B seronegative subjeets. Laneet 2 (1988) 1273-1276 1
Dr. med. Stefan Wirth Kinderklinik der J ohannes-Gutenberg-U niversität Langenbeekstraße 1 6500 Mainz
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zuweisen (2). Die konventionellen Hybridisierungsverfahren haben eine begrenzte Sensitivität, so daß nur mit der wesentlich empfindlicheren Polymerase-Kettenreaktion kleinste Mengen viraler Sequenzen entdeckt werden können (11). Ein gewisses Problem bei dieser Methode ist gerade die hohe Sensitivität, da die geringste Kontaminierung zu falsch positiven Ergebnissen führt. Bei unseren Untersuchungen waren alle Negativkontrollen regelmäßig negativ, so daß wir bei den Ergebnissen Kontaminationen ausschließen konnten.
Klin. Pädiatr. 204 (1992)
