Rev. Fr. Transfus. Hemobiol., 1992, 35, 239-254
239
MEMOIRE ORIGINAL
Caract6risation d'anticorps monoclonaux murins dirig6s contre les 6rythrocytes feetaux p a r D . B l a n c h a r d , D. B e r n a r d , M . J . L o i r a t , Y. F r i o u x , J. G u i m b r e t i 6 r e , L. G u i m b r e t i 6 r e CRTS Nantes
RESUME Des souris Balb/c ont dtd immunisdes par injection intra-pdritondale d'drythrocytes fa~taux traitds dz la papafne et leurs spldnocytes ont dt~ utilisds pour la production d'anticorps monoclonaux. Diff~rents hybrides cellulaires sdcrdtant des anticorps dirigds contre des antig~nes [ortement exprimds sur les drythrocytes fcetaux et de sang de cordon ont dtd sdlectionn~s et clon~s. Les clones NaM61-1A2 NaM61-768 synthdtisent des anticorps de type IgM reconnaissant une structure sensible d l'endo-~galactosidase de Bacteroides fragilis et identifide d I'antig~ne i. Ces anticorps constituent d'excellents rdactifs de groupe sanguin utilisables dans les techniques d'agglutination en tube, en gel et de cytomdtrie en flux. Le cldne NaM46-4A8 sdcr~te un anticorps de cIasse IgG qui reconna~t une structure antigdnique accessible apr~s traitement des drythrocytes de fa~tus et de nouveau-ntis par la papa~ne, la ficine, Ia bromdline et l'endo-~Jgalactosidase. La structure antigOnique correspondante n'a pas dtd Olucidde.
Tirds d part : D. Blanchard, Centre R6gional de Transfusion Sanguine, 34, boulevard Jean-Monet, BP 349, 44011 Nantes Cedex 01.
240
BLANCHARD D. et coll. SUMMARY
Characterization of murine monoclonal antibodies directed against fetal red cells Balb/c mice were immunized against papain-treated fetal erythrocytes and splenocytes were fused with Sp2/O-Ag-14 myeloma cells. Several hybrids secreting antibodies directed against antigenic determinants predominantly exposed on fetal and cord cells were selected and cloned twice. Antibodies NaM61-1A2 and NaM61-768 (IgM class) were shown to be specific for an endo-~galactosidase sensitive oligosaccharidic chain. The antigen, strongly expressed on fetal and cord cells, was identified as the i blood group antigen. The antibodies represent powerful blood group reagents to be use in conventional agglutination techniques as well as in the gel typing system and in indirect flow cytometry. The antibody NaM46-4A8 (IgG class) is specific for an antigenic structure express on fetal cells and accessible only after papain, ficin, bromelin and endo-~galactosidase treatment. The antigen was not identified.
INTRODUCTION L'antig6ne i repr6sente un des marqueurs les plus pr6coces de la membrane 6rythrocytaire f0etale puisqu'il est exprim6 ~ la surface des h6moblastes des ernbryons de 20 jours, son expression est forte sur les 6rythrocytes du nouveau-n6 et diminue au cours de la premi6re ann6e [17]. Parall61ement, l'antig6ne I apparait pour 6tre /~ son expression maximale vers deux arts. Les antigbnes I e t i sont port6s par diff6rents composants de la membrane 6rythrocytaire : glycolipides (glycolipides neutres, gangliosides et polyglycosylc6ramides) et glycoprot6ines (bande 3 et bande 4.5) [2, 6-9, 11, 17]. Les structures antig4niques correspondent/~ des chaines oligosaccharidiques lin6aires (i) et branch6es (I) de type 2, i apparaissant c o m m e le substrat de I dont la biosynth6se rdsulte de l'action de glycosyltransf4rases sp6cifiques [16]. Les antig6nes, largement distribu6s dans les tissus et les liquides biologiques, sont d6finis par des auto-anticorps froids de type IgM, g6n6ralement d6velopp6s lors de diff6rentes h6mopathies malignes. Certains anti-i de nature IgG sont d4velopp6s au cours de mononucl6oses infectieuses et repr6sentent des r6actifs rares. Quelques anticorps monoclonaux de sp6cificit6 i (ou i-like), dirig6s contre une structure glucidique non branch6e faite d'unit6s rdp6titives Gall31-4GlcNAC, ont 6t6 obtenus par transformation de lymphocytes humains par le virus d'Epstein-Barr [ 10, 15, 20]. Nous rapportons darts ce travail la production d'anticorps monoclonaux murins dirig4s contre des structures antig6niques fortement repr6sent6es sur les 6rythrocytes fcetaux et faiblement exprim6es sur les 6rythrocytes d'adultes. Ces anticorps repr6sentent des outils de choix pour l'analyse de
MONOCLONAUX ANTI-I ET 1-LIKE
241
l'expression des antig6nes, marqueurs de l'ontogen~se et de l'oncogen&se, dans les syndromes my61oprolif6ratifs et autres associ6s / t u n e augmentation de l'expression de l'antigbne i, ou pour la raise en 6vidence d'h6maties fcetales dans le sang de la m6re, pendant la grossesse ou apr6s l'accouchement.
MATERIELS ET METHODES Erythrocytes Les 6rythrocytes d'adultes sains ont 6t6 obtenus de pr61~vements de donneurs de sang du CRTS de Nantes. Les 6rythrocytes de foetus (21 h 25 semaines), de nouveau-ntis (sang de cordon) et de femmes venant d'accoucher ont 6t6 collect6s au CHR de Nantes. Le traitement des cellules par la trypsine (Serva, 55 U/rag), la ficine (Serva, solution h 1%), la bromeline (Sigma, solution ~ 750 U/l), la neuraminidase de Vibrio cholerae (NVC: Behring Werke, 1 U/ml) et l'endo-[3-galactosidase (Bcehringer, 0,1 U/ml) ont 6t6 effectu6s selon les m6thodes d6crites dans la litt6rature [3, 12, 13, 18]. Les cellules ont 6t6 trait6es par la papaine (Diagast) selon la m6thode pr6conis6e par le fabricant.
Pr6paration des anticorps monoclonaux Les spl4nocytes utilis6s pour la fusion 46 ont 6t6 obtenus d'une souris Balb/c immunis6e par injection intrap6riton6ale/t J0 de 5 x 108 h6maties foetales (groupe A) et ~ J44 de la m~me quantit6 d'h6maties foetales papain6es. La souris Balb/c utilis6e pour la fusion 61 a 4t6 immunis6e de la m6me fa~on/t J0 et J44 e t a subi une nouvelle injection de 5 x 100 6rythrocytes f0etaux papain4s 5 mois apr6s la pr6c6dente immunisation. Les souris ont 6t6 sacrifi6es 4 jours apr6s la dernihre injection. Les spl4nocytes ont 6t4 fusionn6s avec des cellules my61omateuses de souris SP2/0-Agl4 et les hybrides ont 6t6 s61ectionn6s sur milieu RPMI/HAT selon la m6thode d6crite par Campbell [1]. Les hybrides s6crdteurs ont 6t6 identifi6s par l'activit6 agglutinante des surnageants de culture et clon6s deux lois successivement par la m6thode de dilution limite en milieu liquide. Plusieurs cl6nes cellulaires ont 6t6 s61ectionn6s pour leur capacit6 de s6cr6tion d'anticorps agglutinant les hdmafies fcetales non trait6es ou papain6es : un cl6ne originaire de la fusion 46 (NaM46-4A8) et deux cl6nes originaires de la fusion 61 (NaM61-1A2 et NaM61-7G8). Les caract6ristiques des surnageants correspondants, d6nomm6s pour simplifier 46-4A8, 61-1A2 et 61-7G8 sort rapport6s dans les tableaux I d I K
242
B L A N C H A R D D. et coll.
Tests d'agglutination Les tests d'agglutination lors du - screening ,, des hybrides s4cr6teurs ont 6t6 effectu6s en plaques de rnicrotitration en U (Greiner) en utilisant 25 gl des suspensions 4rythrocytaires a 2 % en PBS, pH 7,4 et 25 gl des surnageants de culture, avec une incubation d ' u n e h e u r e ~ 4 °C. La technique en tube de Kahn a 6t6 effectu6e en incubant 15 min ou 1 h, /t 4, 22 ou 37 °C, 50 ktl de suspension 6rythrocytaire ~ 4 % et 50 gl de surnageant de culture. Les agglutinats ont 6t6 observ6s aprhs centrifugation 1 min/~ 400 g e t les scores ont 6t6 calcul6s selon la rn6thode de cotation des r4actions [ 14]. Pour le test de Coornbs indirect, une anti-IgG humaine (Coornbs IgG sp6cifique, CRTS de Nantes) ou un anticorps de lapin anti-IgG de souris (Bioatlantic, Nantes ; 0,08 rng/rnl, concentration finale) ont 4t6 utilis4s. La technique d'agglutination en gel a 6t6 effectu6e selon les recommandations du fabricant (Diarned) en utilisant les plaques p o u r test NaC1, enzymatique et agglutinines froides (produit Diarned - ID, Rdf. 5011). Pour les tests d'absorption, un volume de surnageant de culture a 6t4 incub4 avec 1 vol. de culot globulaire lav6 trois fois en PBS, pH 7,4, pendant 18 h ~ 4 °C. Les surnageants obtenus par centrifugation (4 rnin x 1 500 g) ont 6t4 analys6s par la technique d'agglutination en tube. Cytom6trie en flux Les 4rythrocytes (40 gl d ' u n e suspension/~ 10 % soit environ 40 x 106 cellules) ont 6t6 sensibilis6s par incubation avec 200 gl de surnageant de culture pendant 1 h / t 4 °C puis lav6s trois lois en PBS, pH 7,4, contenant 1 % d'albumine bovine (PBS-BSA). Les cellules ont 4t4 incub4es pendant 30 min ~ 4 °Cavec 200 gl d'anticorps de ch6vre anti-IgG de souris purifi6 par affinit4 et rnarqu6 FITC (GAM-FITC, Bioatlantic, Nantes, dilu6 au 1/40) puis lav4es trois lois en PBS-BSA et analys6es au cytomhtre en flux (Ortho Spectrurn III).
RESULTATS Spdcificit6 des anticorps monoclonaux Trois cl6nes cellulaires d6nomrn6s NaM61-1A2, NaM61-7G8 et NaM46-4A8 ont bt6 s61ectionn6s par agglutination d'6rythrocytes provenant de sang de cordons, de foetus ou d'adultes (tabl. I). Les anticorps 61-1A2 et 61-7G8 agglutinent fortement les 6rythrocytes foetaux ou de sang de c o r d o n ind6pendarnrnent de leur groupe sanguin dans le syst6rne ABO. Les 6rythrocytes d'adultes sont faiblernent agglutinfs /~ + 4 °C ; cependant ces agglutinats sont rapidernent dissoci6s /~ ternp6rature ambiante, ce qui n'est pas le cas avec les 4rythrocytes foetaux (ou de cordon).
MONOCLONA UX ANTI-I ET I-LIKE
243
Tableau I
Spdcificitg des anticorps monoclonaux dirig~s contre les ~rythrocytes [oztaux (1). Anticorps (surnageants de culture) Erythrocytes
Groupe
61-1 A2
61-7G8
46-4A8 (2)
Faetus Cordon Cordon Cordon Adulte Adulte
A B O B O
64 64 64 32 2 2
32 32 32 32 2 2
16 16 16 16 0 0
Cordon
O
61-1A2/DTT (3) 0
61-7G8/DTT (3) 0
46-4A8/DTr (3) 16
(]) Les r6sultats sont exprim6s en titre agglutinant ; technique microplaque, incubation 1 h fi 4 °C (2) Les 6rythrocytes ont 6t6 pr6alablement trait6s fi la papaine pour les tests d'agglutination effectu6s avec l'anticorps 46-4A8 (3) Les surnageants de culture ont 6t6 dilu6s au 1/2 en PBS, pH 7,0, contenant 10 mM de DTT avant incubation avec la suspension 6rythrocytaJre.
L'anticorps 46-4A8 poss6de 6galement la propri6t6 d'agglutiner les 6rythrocytess de sang de foetus ou de c o r d o n ~t condition qu'ils aient 6t6 prhalablement trait6s par la papaine. Aucune agglutination n ' a 6t6 observde avec des 6rythrocytes non traitds en utilisant une antiglobulme polyvalente humaine ou un anticorps secondaire anti-IgG de souris. Les cellules de sang d'adultes, papa/n6es, ne sont pas reconnues. L'activit6 agglutinante des anticorps 61-1A2 et 61-7G8 est ddtruite par traitement des surnageants de culture au DTT (tabl. I), montrant que les immunoglobulines monoclonales sont de nature IgM. Par contre, l'anticorps 46-4A8 n'dtant pas althr6 par traitement A l'agent r6ducteur, est de classe IgG. Ces premiers r4sultats m o n t r e n t que les anticorps monoclonaux, obtenus par immortalisation de spl6nocytes de souris immunis6es contre des 6rythrocytes foetaux reconnaissent un antig6ne fortement exprim6 sur les 6rythrocytes de sang de cordon et de foetus. La caract6risation des anticorps a 6t4 poursuivie en c o m p a r a n t leur activit6 biologique avec celle d ' u n anticorps polyclonal h u m a i n dirig6 contre l'antig6ne i caract6ristique des h6maties foetales.
Specificit6 vis-A-vis d'6rythrocytes trait6s par les enzymes ANTICORPS 61-1A2 ET 61-7G8 L'agglntination des 6rythrocytes de sang de cordon (Oi), par les anticorps 61-1A2 et 61-7G8 est facilit6e par traitement /t l'aide des enzymes prot6olytiques (trypsine, papa/he, ficine, et bromeline) ou par la neuraminidase de Vibrio cholerae (tabl. II). Cependant, l'agglutination
244
BLANCHARD D. et coll.
o
~
~
o o
~
©
,
o
~
o
o
g
O0
O0
000
O0
~'~
~.~ ~.~
•"
2
2
~
MONOCLONA UX ANTI-I ET I-LIKE
245
des 6rythrocytes adultes (OI) est 6galement accrue et la difference de titre entre les cellules OI et Oi n'est plus significative, surtout apr~s traitement la bromeline. L'anti-i h u m a i n (s6rum Gau.) agglutine ~galement plus facilement les firythrocytes Oi trait~s par les enzymes prot6olytiques. Les 6rythrocytes adultes deviennent cependant agglutinables apr&s traitement mais la diff6rence de titre observ6e reste significative (tabl. II). Les 6rythrocytes d'adukes et de sang de cordon trait6s par la neuraminidase sont reconnus de fagon comparable par l'anticorps polyclonal. Les mSmes r6sultats ont ~t6 obtenus avec les anticorps 61-1A2 et 61-7G8 montrant que les 6pitopes recolmus par les diff&rents anficorps sont rendus plus accessibles par hydrolyse des acides sialiques. La r6activit6 des anticorps 61-1A2 et 61-7G8 ainsi que celle de l'anti-i humain est compl~tement abolie par traitement des cellules/~ l'endo-~galactosidase (tabI. II), sugg6rant que les anticorps monoclonaux reconnaissent une structure antigfinique identique g celle reconnue par l'anticorps polyclonal. L'hydrolyse par l'endo-[3-galactosidase des chaines oligosaccharidiques lin6aires, correspondant/t l'antig6ne i est sp6cifique [18] et permet de conclure quant /t la reconnaissance sp~cifique de l'antig~ne i par ces anticorps monoclonaux. ANTICORPS 46-4A8 L'anticorps 46-4A8 provoque l'agglutination des 6rythrocytes de cordon trait6s par la papaine, la ficine ou la bromeline (tabl. II) indiquant que l'antigbne correspondant est d6masqu6 apr~s hydrolyse de composants prot6iques de surface. Les 6rythrocytes de sang d'adultes, trait~s de fagon identique, n'6taient pas agglutin6s. Cependant, une agglutination faible, + h ++, a 6t6 observ6e pour environ 50 % des 6rythrocytes d'adultes analys6s (cf. tabl. V). Par contre, la trypsine et la neuraminidase de sp6cificit6 plus restreinte que les enzymes pr6cit6es, ne permettent pas l'accessibilit6 & l'antigbne. De faqon particulibrement int6ressante, le traitement par l'endo-[3galactosidase favorise l'agglutination, contrairement /t ce qui a 6t6 observ~ avec les autres anticorps. L'anticorps 46-4A8 reconnait donc une structure antig6nique non accessible sur les cellules non trait6es, vraisemblablement port6e par des composants lipidiques de la membrane, sp6cifique des 6rythrocytes feetaux ou de sang de cordon, et diff6rente de l'antig6ne i.
Caract6ristiques s6rologiques des anticorps DI~PENDANCEDE LATEMPERATURE Les anticorps monoclonaux pr6sentent c o m m e l'anticorps polyclonal humain de sp6cificit6 i, un optimum t h e r m i q u e / t + 4 °C (tabl. III). A
246
BLANCHARD D. et coll.
T a b l e a u lII Activitd agglutinante des anticot 9s monoclonaux (surnageants de culture ; p H 7,2) ~ 4, 22 et 37 °C (1 Tempfrature Anticorps
GR
4 °C
22 °C
37 °C
OI Oi
0-1 (0-5) 8-32 (37-57)
8-16 (37-45)
0-0(0-0)
0-0 (0-0) 1-2 (8-10)
NaM61-7G8
OI Oi
0-1 (0-5) 32-32 (52-57)
0-0 (0-0) 8-8 (37-39)
0-0 (0-0) 8-8 (33-35)
Na-M46-4A8
OI (2) Oi (2)
0-1 (0-5) 8-16 (37-47)
0-0 (0-0) 2-4 (17-25)
0-0 (0-0) 4-8 (25-39)
Gan.
OI Oi
0-0 (0-0) 128-256 (85-90)
0-0 (0-0) 1-1 (5-5)
0-0 (0-0) 0-0 (0-0)
NaM61-1A2
(1) Les r6sultats obtenus avec deux h6maties (GR) adultes (0I) ou de sang de cordon (Oi) sont exprimes en titre agglutinant et en score (entre parentheses). (2) Erythrocytes traitds ~ la papaine.
cette tempdrature cependant, les h6maties d'adukes sont faiblement agglutin&s par les m o n o c l o n a u x qui ont une spdcificit6 moindre par rapport au polyclonal. Les anticorps 61-1A2 et 61-7G8 qui m o n t r e n t une sp6cificit6 stricte pour les 6rythrocytes Oi et conservent une activit6 suffisante ~ 22 °C (titre 8-16, score 37-45) seront pr6f6rablement utilis6s /~ cette t e m p 6 r a t u r e en technique tube salin. Notons que l'anti-i h u m a i n correspondant a la classe d'anticorps d 6 n o m m 6 s , agglutinines froides ,, est strictement d6pendant de la temp6rature, son activit6 devient ndgligeable/~ t e m p e r a t u r e ambiante. L'anticorps 46-4A8 devient 6galement sp&ifique ~ temp6rature ambiante mais est trop faiblement agglutinant. Un titre et u n score convenable (titre 4-8, score 25-39) sont obtenus par incubation/~ 37 °C sur h6maties papain6es, ce qui n'est pas surprenant puisque l'anticorps est de classe IgG, D E P E N D A N C E DU
pH
Les anticorps m o n o c l o n a u x conservent un titre agglutinant comparable dans la g a m m e de pH .6,5 ~ 8,5. Cependant les scores sont 16g6rem e n t plus devds/~ pH 6,5 par les anticorps 61-1A2 et 61-7G8, et/t pH 7,5 pour l'anticorps 46-4A8 (rdsultats non montr6s). Notons q u ' a u x diff,rents p H utilisds, aucune agglutination d'drythrocytes d'adultes n ' a 6t6 observ6e. ABSORPTION
Les surnageants de culture 61-1A2 et 61-7G8 pr6alablement incub6s avec des 6rythrocytes de c o r d o n (Oi) n'agglutinent pas les 6rythrocytes d'adultes ou de cordons/~ + 4 °C (r6sultats non montrds).
MONOCLONA UX ANTI-I ET I-LIKE
247
Notons que les anticorps sont totalement absorb6s par incubation avec les 6rythrocytes de c o r d o n alors que dans les m 6 m e s conditions, ils ne le sont que partiellement p a r les 6rythrocytes d'adultes. Globalement, ces r6sultats d' absorption d 6 m o n t r e n t que les anticorps 61-1A2 et 61-7G8 reconnaissent un antighne c o m m u n aux 6rythrocytes d'adultes et foetaux (et de sang de cordon) mais plus faiblement exprim6 sur les 6rythrocytes de sang d'adultes. L ' a n t i c o r p s 4A8 n ' e s t pas absorb6 p a r les 6rythrocytes non traitds de cordon. En c o n c o r d a n c e avec les tests d'agglutination, ce r6sultat d 6 m o n t r e que l'anticorps reconnait un antig6ne masqu6 et non accessible de la m e m b r a n e 6rythrocytaire foetale. VALIDATIONET UTILISATIONDES ANTICORPSNaM61-1A2 ET NaM61-7G8 La rdactivit6 de l'anticorps 61-1A2 a 6t6 test4e vis-a-vis de 106 4chantillons de sang en technique tube en milieu salin ~ t e m p d r a t u r e a m b i a n t e (tabl. IV). Aucune agglutination n ' a fit4 not6e avec les 4rythrocytes de 61 des 62 donneurs de sang analys6s alors q u ' u n e faible r6activit6 (agglutination +) a 4t6 observ6e avec un 6chantillon (soit 1,6 % des cas). La frbquence de r6actions faiblement positives est significativem e n t a u g m e n t 6 e p o u r les f e m m e s venant d ' a c c o u c h e r (33,3 % des cas). Les 6rythrocytes de t o u s l e s 4chantillons de sang de cordon ou de foetus ainsi que les 4rythrocytes H e m p a s , e x p r i m a n t de fa~on a n o r m a l e l'antig6ne i, ont 6t6 f o r t e m e n t agglutin6s. Des r6sultats c o m p a r a b l e s ont 6t6 obtenus dans la technique d'agglutination en gel en utilisant les plaques c o m m e r c i a l e s Diamed p o u r test NaC1. Des petits agglutinats ont fit6 observ6s avec 2 6chantillons de sang d'adultes sur 17 et avec un 6chantillon de sang de f e m m e s venant d ' a c c o u c h e r sur 9. Notons que cette technique qui a donn6 d'excellents r6sultats, facile d'interpr6tation, semble 16ghrement moins sensible par c o m p a r a i s o n / : la technique classique en tube puisque la fr6quence de cas positifs p a r m i les f e m m e s venant d' a c c o u c h e r est plus faible. Par contre, l'agglutination des 6rythrocytes de sang de cordon et de foetus a 6t6 franche dans tous les cas. L' anticorps a de m 6 m e 6t4 utilis4 en cytom6trie en flux indirecte (tabl. IV). Une faible p r o p o r t i o n des 4rythrocytes de sang de dormeurs est r e c o n n u e p a r l'anticorps, et ceci darts tous les cas analys6s, avec une m o y e n n e de 2,2 % de cellules positives (fig. I). En accord avec les tests d'agglutination effectu6s par la technique tube, une p r o p o r t i o n plus i m p o r t a n t e (soit environ 5 %) des 6rythrocytes des f e m m e s venant d ' a c c o u c h e r est r e c o n n u e p a r l'anticorps. Environ 50 % et prbs de 80 % des 6rythrocytes de sang de cordons ou de foetus, respectivement, sont fluorescents dans les conditions du test. La m o y e n n e de fluorescence des 6rythrocytes foetaux (112,7) est sup6rieure celle des 6rythrocytes de sang de c o r d o n (102,2) dans l'exemple pr6sent6 (fig. I), repr6sentatif des diff6rents profils obtenus. Notons que, dans un m61ange artificiel de 50 % d'h6maties de cordon et d'h6maties adultes, 28 % des cellules sont fluorescentes et s6par6es de la population n6gative avec une i m a g e de double population (fig_ I). Ce r6sultat est tout
248
BLANCHARD D. et coll.
OgOA~
~ N
~
~
g
+ +
+
us
03
.~
÷ + 00~-
o
~ ~
=~ ~
"~.~
MONOCLONA UX ANTI-I E T I-LIKE
249 ~00
200
~0
200
~0
200
+{, ,}©
d
i
gi!t .
[:.!!]?:iY;~
-
~
-
~..~
E~.x. L._-__~ •
I
= ¢;,'-,',.~76.:--~@:~i}~
40
80
120
1 6 0 "~.~00
i?OO
,tO
O~e')
l ~0
1 ~,(:~ ~ 0 0
POO #ii~~='i~i,
e
160
200
~
FIG. 1 - Utilisation de l'anticorps m o n o c l o n a l NaM61-1A2 en cytom~trie en flux. Les 6rythrocytes ont 6t6 analys+s selon le protocole d6crit dans ,, Mat&tel et M6thodes ,,. Erythrocytes : a) Adultes, b) Nouveau-n6s, c) Foetus (21 semaines), d) H e m p a s (Dub.), e) et f) M61ange 50 % aduhes et 50 % nouveau-n~s. Pour les exp6riences a, b, c, d, f, les cellules ont 6t6 incub6es avec l'anticurps monoclonal dilu6 au 1/16 puis avec le r6actif secondaire m a r q u 6 au FITC. Pour l'exp6rience e, les cellules ont 6t6 settlement ineub6es avec le r6acfif secondaire. Les cellules darts les zones de fluorescence 4 (exp6riences a, b, c et d) et 2 (experiences e et t) c o r r e s p o n d e n t aux cellules positives ayant r6agi avec l'anticorps. En ordonn6e est indiqu6e la florescente relative des cellules et en abscisse le n o m b r e relatif de cellules analys+es.
BLANCHARD
250
D. et coll.
/~ fait concordant avec les chiffres obtenus par analyse s6parfe des Orythrocytes adultes (98 % de cellules nOgatives) et de sang de cordon (50 % de cellules positives) et nous p e r m e t de consid6rer cette technique de cytomdtrie en flux indirecte c o m m e une m6thode fiable et quantitative p o u r l'analyse des chim0res h6matopo'/6tiques maternelles (sang de la more contaminO par les hdmaties fcetales) et des syndromes my61oprolif6ratifs (expression anormale de l'antig0ne i). L'analyse des 6rythrocytes H e m p a s indique que 42 % des cellules sont r6actives avec l'anticorps
(tabI. IV, fig. 1). Des r6sultats tout/~ fait analogues ont 6t6 obtenus avec l'anticorps monoclonal NaM61-7G8 (r6sultats non mol~t~6s). VALIDATION DE L'ANTICORPS NaM46-4A8 L'anticorps a 6t6 test6 vis-g-vis d ' u n h o m b r e restreint d'fchantillons dans la technique en tube utilisant des h6maties papa2/n6es g 4 °C (tabI. V). Les 6rythrocytes de donneurs et des femmes test6s ne sont pas ou sont faiblement agglutin6s dans les conditions du test. Par contre, les 6rythrocytes fcetanx et de sang de c o r d o n sont fortement agglutin6s ( + + + + dans t o u s l e s cas), de m 6 m e que les h6maties Hempas. Les 6rythrocytes de rex-nines venant d ' a c c o u c h e r expriment plus ou moins l'antig0ne sp6cifiquement r e c o n n u par cet anticorps, c o m m e l'attestent les r6sultats (tabI. V) puisque 4 6chantfllons sur 9 m o n t r e n t une agglutination de + + + . Remarquons que cet antigone n'est pas pr6sent sur les hdmaties Bombay papain6es. L'anticorps de nature IgG n'est pas utilisable dans la technique en gel et n ' a pas 6t6 test6 en c y t o m f t r i e en flux indirecte du fait de la n6cessit6 d'utiliser des cellules trait6es par la papaine.
Tableau V
Rdactivitd de l'anticorps monoclonal NaM46-4A8 (1). Technique tube (2) Erythrocytes A D U L T E S
Donneurs Femmes accouchees Hempas Bombay
Nouveau-n6s (sang de cordon) Foetus (21-25 semmnes)
N
6 9 1 l
-
2 1
±
1 1
+
++
+++
++++
2 3
1
6
6
10
10
(1) UtiIisation d'h6maties papain6s ; utilisation de l'anticorps pur ; incubation 15 min ~ 4 °C (2) L'anticorps n'est pas utilisable en technique en gel NaC1
MONOCLONA UX ANTI-I ET I-LIKE
251
DISCUSSION
En utilisant des spl6nocytes de deux souris immunis6es par injection mtrap6riton6ale d'6rythrocytes foetaux papain6s nous avons obtenu plusieurs d6nes cellulaires s&cr6tant des anticorps monoclonaux dirig6s contre des structures antig6niques fortement exprim6es sur les 6rythrocytes de sang de cordon et de foetus. Les cl6nes NaM46-4A8 d'une part et NaM61-1A2 et NaM61-7G8 d'autre part sont repr6sentatifs des diff,rents cl6nes r6sultant des fusions 46 et 61, respectivement. Les anticorps 61-1 A2 et 61-7 G8, de type IgM, ont la mSme sp6cificit6 pour un antig6ne exprim6/~ la surface des 6rythrocytes non trait6s de foetus et de nouveau-nds~...L'_~.tigbne..est 6galement pr6sent sur les h6maties papain6es d'adulte et est d6truit par clivage des cha~nes oligosaccharidiques ~ l'aide de l'endo-~-galactosidase de B a c t e r o i d e s [ragilis, capable de lib6rer le disaccharide Gall31-4GlcNAc des unit6s r6p6titives (Gall31-4GlcNAc)n [ 18]. Ces caract6ristiques indiquent que les anticorps reconnaissent sp6cifiquement l'antigbne de groupe sanguin i dont la structure minimum, correspondant 5 une chaine lin6aire form6e de deux unit6s r6p6titives Gal~ 1-4GlcNAc, est le lacto-N-norhexaosylceramide : Gal[31-4GlcNAc[~I-3Gal~I-4GlcNAc[31-3Gal-R. Les anticorps 61-1A2 et 61-7G8 se comportent de fagon analogue/t un anti-i polyclonal humain vis-g-vis des 6rythrocytes trait6s par les enzymes prot~olytiques. L'expression de l'antigbne i est augment6e de fagon analogue apr6s traitement par la trypsine, la papaine, la ficine, la brom61ine et la neuraminidase de Vibro cholerae. Ce r6sultat est en accord avec le hombre de sites i expos6s sur des 6rythrocytes de sang de cordon ou d'adultes Oi natifs (30/t 65 000 sites) ou trait6s par la neuraminidase (200 000 sites) [4, 5]. Les anticorps monoclonaux ne sont pas, contrairement/t l'anti-i polyclonal, des anticorps ,, froids ,, et sont actifs /t temp6rature ambiante ou /~ 37 °C. Rappelons cependant que leur activit6 est plus importante g 4 °C, temp6rature ~ laquelle les 6rythrocytes adultes, qui expriment faiblement l'antig6ne i, sont agglutin6s. Les chalnes oligosaccharidiques lin6aires correspondant a l'antig6ne i sont port6es par des composants glycolipidiques et glycoprot6iques de la membrane 6rythrocytaire [2, 6-9, 11, 17]. Les anticorps 61-1A2 et 61-7G8 se fixent sur la bande 3 et le complexe prot6ique correspondant la bande 4.5 transf6r6s sur membrane de nitrocellulose (r6sultats non montr6s). Cependant les anticorps reconnaissent ~galement la prot6ine 4.5, et tr6s faiblement la bande 3, d'6rythrocytes d'adultes. Ces r6sultats pr61iminaires montrent que l'antig6ne i est associ6 aux composants prot6ielues de la membrane d'6rythrocytes de sang de cordons et d'adultes, et sugg6rent que la r6activitfi forte des 6rythrocytes de cordon est en majorit6 due (du moins en ce qui concerne les glycoprot6ines),/t la bande 3. L'analyse des composants glycolipidiques, glycolipides neutres et
252
B L A N C H A R D D. et coll.
gangliosides, est en cours et p e r m e t t r a de d6montrer la sp6cificit6 mol6culaire des anticorps monoclonaux_ L'expression des antig6nes I et i n'est pas restreinte aux 6rythrocytes, les antig6nes 6tant pr6sents /t la surface de nombreuses cellules de l'organisme et dans les liquides biologiques [17]. En accord avec les travaux rapport6s dans l'ouvrage de Salmon et coll. [17], une activit6 i comparable a 6t6 raise en 6vidence, par test d'inhibition de l'agglutination induite par les anti-i monoclonaux, dans les plasmas d'adultes ou de nouveau-n6s (r6sultats non montrds). Par contre, aucune activit6 n ' a 6t6 dfcel6e dans des salives d'adultes sdcr6teurs ou non s6cr6teurs. Les anticorps rnonoclonaux 61-1A2 et 61-7G8, de sp6cificit6 i, sont utilisables dans les techniques d'agglutination en gel et cytom6trie en flux. L'analyse de l'expression de l'antig~ne i dans divers 6tats leuc6miques, pr6-1euc6miques ou lors de syndromes my61oprolif6ratifs ou de dys6rythropo-f6se (telle que celle de type Hempas) se trouve facilit6e par l'utilisation de ces anticorps_ En particulier, la cytom6trie en flux p e r m e t la quantification des doubles populations 6rythrocytaires I e t i e t donc l'6valuation du transfert des 6rythrocytes du foetus/t la m6re lors de la vie embryonnaire et/~ l'accouchement. L'anticorps 46-4A8, de classe IgG, reconna~t une structure antig6nique fortement exprim6e sur les 6rythrocytes, trait6s/t la papaine, la ficine ou la brom61ine, de foetus ou de nouveau-n6s. L'antigbne n'est pas exprim6 sur les 6rythrocytes foetaux non traitds ou trait6s par la trypsine ou la neuraminidase et devient accessible par traitement g l'endo-[3galactosidase. Ces r6sultats m o n t r e n t que l'anticorps 46-4A8 reconnait une structure diff6rente de l'antigbne i dont une des caract6risfiques essentielle est la sensibilit6 ~ l'endo-13-galactosidase. L'antig6ne r e c o n n u est 6galement faiblement exprim6 sur les 6rythrocytes papa'/nfs d'adultes_ I1 pourrait correspondre h une structure glycolipidique accessible apr6s clivage enzymatique des prot6ines et glycoprot6ines majeures. Alternativement, il pourrait correspondre a u n antig6ne cryptique, d6masqu6 par traitement enzymatique. L'analyse biochimique des diff6rents composants membranaires obtenus des m e m b r a n e s trait6es/~ la papaine et/~ l'endo-i3-galactosidase p e r m e t t r a de d6terminer si l'6pitope est port6 par un c o m p o s a n t glycolipidique, glycoprot6ique, ou les deux c o m m e cela est le cas p o u r l'antig6ne i.
CONCLUSION Les anticorps m o n o c l o n a u x dirig6s contre les diff6rents antig6nes de la m e m b r a n e ~rythrocytaire constituent d'excellents r6actifs utilis~s p o u r le groupage sanguin et tendent h supplanter les anticorps polyclonaux pour des raisons de qualit6, de sfcurit6 et d'6thique. Les anticorps m o n o c l o n a u x murins reconnus lors de cette 6rude r e c o n n a i s s e n t des structures antig6niques fortement exprim6s sur les 6rythrocytes foetaux et de nouveau-n6s. L'un de ces antig6nes a 6t6 identifi6/~ l'antig6ne de
MONOCLONA UX ANTI-I ET I-LIKE
253
g r o u p e s a n g u i n i qui est m a r q u e u r d e l ' o n t o g 6 n 6 s e d e l ' o n c o g 6 n 6 s e c h e z l ' h o m m e . Ces a n t i c o r p s r e p r 6 s e n t e n t d o n c d e s outils p o u r le d i a g n o s t i c d e d i v e r s s y n d r o m e s h 6 m a t o l o g i q u e s et p o u r la r a i s e e n 6 v i d e n c e d e s 6 r y t h r o c y t e s f0etaux darts le s a n g m a t e r n e l .
BIBLIOGRAPHIE [1] CAMPBELLA.M. - Monoclonal antibody technology. In : Burdon R.H., van Knippenberg P.H. (eds). Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Amsterdam Elsevier, 1984. [2] CHILDS R.A., FEIZI T., TONEGANAY. - Multiplicity of molecules carrying blood group I antigen on erythrocyte membranes. Biochem. J., 1979, 181, 533-538. [3] DAHRW., MULLERT., MOULDSJ., BAUMESTEIRG., ISSlTT P.D., WILKINSONS., GARRATTY G . - High-frequency antigens of h u m a n erythrocyte membrane sialoglycoproteins. I. En" receptors in the glycosylated domain of the MN sialoglycoprotein. Biol. Chem. Hoppe-SeyIer, 1985, 366, 1033-1045. [4] DOINEL C., ROPARS C., SALMON G. -- Effects of proteolytic enzymes and neuraminidase on the I and i erythrocyte antigen sites. Quantitative and thermodynamic studies. Immunology, 1978, 34, 653-662. [5] DOINEL C., ROPARS C., SALMON C_ - Quantitative and thermodynamic measurements on I and i antigens of h u m a n red blood cells. Immunology, 1976, 30, 289-297. [6] FUKUDA M., FUKUDA M.N., HAKOMORt S.I. - Development change and genetic defect in the carbohydrate structure of band 3 glycoprotein of human erythrocyte membrane. J. Biol. Chem_, 1979, 254, 3700-3703. [7] FUKUDAM.N., FUKUDAM., HAKOMORI S.I. - Cell surface modification by endo-J3-galactosidase. J. Biol. Chem., 1979, 248, 5458-5465. [8] FEIZI T., CHILDS R.A., HAKOMORIS.I., POWELLM.E. - Blood group Ii active gangliosides of h u m a n erythrocyte membrane. Biochem. J., 1978, 193, 245-254. [9] GARDASA., KOSClELAKJ. - I active antigen of h u m a n erythrocyte membrane. Vox Sang., 1974, 26, 227-237. [10] HIROHASHIS., CLAUSEN H., NUDELMAN E., INDUE H., SHIMOSATOY., HAKOMORI S. - A h u m a n monoclonal antibody directed to blood group i antigen ; heterohybridoma between h u m a n lymphocytes from regional lymph nodes of a lung cance patient and mouse myeloma. J. Immunol., 1986, i36, 4163-4168. [11] KOSCIELAK J., ZDEBSKA E., WILCZYNSKA Z., MILLER-PODRASA H., KZIERSKOWA-BORODEJ W. -- Immunochemistry of Ii active glycosphinglolipids of erythrocytes. Eur. J. Biochem., 1979, 96, 331-337. [.12] LATRONF., BLANCHARDD., CARTRONJ.P. - Immunochemical characterization of the h u m a n blood cell membrane glycoprotein recognized by the monoclonal antibody 12E7. Biochem. J., 1987, 247, 757-764. [13] MALLISSONG., MARTINP.G., ANSTEED.J., TANNERM.J.A., MERRYA.H., TILLS D., SONNEBORN G.H. - Identification and partial characterization of the h u m a n erythrocyte membrane component (s) that express the antigens of the LW blood-group system. Biochem. J., 1986, 234, 649-652. [14] MARSH W.L. -- Scoring of hemagglutination reactions. Transfusion, 1972, 12, 352-353. [15] MIYAKE M., KOHNO N., N[UDELMAN E.D., HAKOMORI S.I. - H u m a n IgG3 monoclonal antibody directed to an unbranched repeating type 2 chain (Gal[31-4GlcNAc[31-3Gal~1-4GlcNAc[31-3 Gal~ l-R) which is higly expressed in colonic and hepatocellular carcinoma. Cancer Res., 1989, 49, 5689-5695.
BLANCHARD D. et coll.
254
[16] PILLERF., CARTRONJ.P., MARANDULAA., VEYRIERESA., LEROYY., FOURNETB. - Biosynthesis of blood group I antigens. J. Biol. Chem., 1984, 259, 13385-13390. [17] SALMONC., CARTRONJ_P., ROUGERP. - Les antigbnes I e t i. In : Les groupes sanguins chez l'homme. Masson, Paris, 1991, pp. 196-211. [18] SCCI)DERP., LAWSONA.M., HOUNSELLE.F., CARRUTHERSR.A., CmLDS R.A., FEIZI T. - Characterization of oligosaccharides released from human-bloodgroup O erythrocyte glycopeptides by the endo-[3-galactosidase of Bacteroides [ragilis. Eur. J. Biochem., 1987, 168, 585-593. [19] TANNERM.J-A., ANSTEED.J., MAWBYW. A new h u m a n erythrocyte variant (Ph) containing an abnormal sialoglycoprotein. Biochem. J., 1980, 187, 493-497. [20] TsuJi Y., CLAUSENH., NUDELMANE., KAIZUT., HAKOMORIS., ISOJIMAS. -H u m a n sperm carbohydrate antigens defined by an antisperm h u m a n monoclonal antibody derived from an infertile w o m a n antisperrn antibodies in her serum. J. Exp. Med., 1988, 168, 342-356. -
239
MEMOIRE ORIGINAL
Caract6risation d'anticorps monoclonaux murins dirig6s contre les 6rythrocytes feetaux p a r D . B l a n c h a r d , D. B e r n a r d , M . J . L o i r a t , Y. F r i o u x , J. G u i m b r e t i 6 r e , L. G u i m b r e t i 6 r e CRTS Nantes
RESUME Des souris Balb/c ont dtd immunisdes par injection intra-pdritondale d'drythrocytes fa~taux traitds dz la papafne et leurs spldnocytes ont dt~ utilisds pour la production d'anticorps monoclonaux. Diff~rents hybrides cellulaires sdcrdtant des anticorps dirigds contre des antig~nes [ortement exprimds sur les drythrocytes fcetaux et de sang de cordon ont dtd sdlectionn~s et clon~s. Les clones NaM61-1A2 NaM61-768 synthdtisent des anticorps de type IgM reconnaissant une structure sensible d l'endo-~galactosidase de Bacteroides fragilis et identifide d I'antig~ne i. Ces anticorps constituent d'excellents rdactifs de groupe sanguin utilisables dans les techniques d'agglutination en tube, en gel et de cytomdtrie en flux. Le cldne NaM46-4A8 sdcr~te un anticorps de cIasse IgG qui reconna~t une structure antigdnique accessible apr~s traitement des drythrocytes de fa~tus et de nouveau-ntis par la papa~ne, la ficine, Ia bromdline et l'endo-~Jgalactosidase. La structure antigOnique correspondante n'a pas dtd Olucidde.
Tirds d part : D. Blanchard, Centre R6gional de Transfusion Sanguine, 34, boulevard Jean-Monet, BP 349, 44011 Nantes Cedex 01.
240
BLANCHARD D. et coll. SUMMARY
Characterization of murine monoclonal antibodies directed against fetal red cells Balb/c mice were immunized against papain-treated fetal erythrocytes and splenocytes were fused with Sp2/O-Ag-14 myeloma cells. Several hybrids secreting antibodies directed against antigenic determinants predominantly exposed on fetal and cord cells were selected and cloned twice. Antibodies NaM61-1A2 and NaM61-768 (IgM class) were shown to be specific for an endo-~galactosidase sensitive oligosaccharidic chain. The antigen, strongly expressed on fetal and cord cells, was identified as the i blood group antigen. The antibodies represent powerful blood group reagents to be use in conventional agglutination techniques as well as in the gel typing system and in indirect flow cytometry. The antibody NaM46-4A8 (IgG class) is specific for an antigenic structure express on fetal cells and accessible only after papain, ficin, bromelin and endo-~galactosidase treatment. The antigen was not identified.
INTRODUCTION L'antig6ne i repr6sente un des marqueurs les plus pr6coces de la membrane 6rythrocytaire f0etale puisqu'il est exprim6 ~ la surface des h6moblastes des ernbryons de 20 jours, son expression est forte sur les 6rythrocytes du nouveau-n6 et diminue au cours de la premi6re ann6e [17]. Parall61ement, l'antig6ne I apparait pour 6tre /~ son expression maximale vers deux arts. Les antigbnes I e t i sont port6s par diff6rents composants de la membrane 6rythrocytaire : glycolipides (glycolipides neutres, gangliosides et polyglycosylc6ramides) et glycoprot6ines (bande 3 et bande 4.5) [2, 6-9, 11, 17]. Les structures antig4niques correspondent/~ des chaines oligosaccharidiques lin6aires (i) et branch6es (I) de type 2, i apparaissant c o m m e le substrat de I dont la biosynth6se rdsulte de l'action de glycosyltransf4rases sp6cifiques [16]. Les antig6nes, largement distribu6s dans les tissus et les liquides biologiques, sont d6finis par des auto-anticorps froids de type IgM, g6n6ralement d6velopp6s lors de diff6rentes h6mopathies malignes. Certains anti-i de nature IgG sont d4velopp6s au cours de mononucl6oses infectieuses et repr6sentent des r6actifs rares. Quelques anticorps monoclonaux de sp6cificit6 i (ou i-like), dirig6s contre une structure glucidique non branch6e faite d'unit6s rdp6titives Gall31-4GlcNAC, ont 6t6 obtenus par transformation de lymphocytes humains par le virus d'Epstein-Barr [ 10, 15, 20]. Nous rapportons darts ce travail la production d'anticorps monoclonaux murins dirig4s contre des structures antig6niques fortement repr6sent6es sur les 6rythrocytes fcetaux et faiblement exprim6es sur les 6rythrocytes d'adultes. Ces anticorps repr6sentent des outils de choix pour l'analyse de
MONOCLONAUX ANTI-I ET 1-LIKE
241
l'expression des antig6nes, marqueurs de l'ontogen~se et de l'oncogen&se, dans les syndromes my61oprolif6ratifs et autres associ6s / t u n e augmentation de l'expression de l'antigbne i, ou pour la raise en 6vidence d'h6maties fcetales dans le sang de la m6re, pendant la grossesse ou apr6s l'accouchement.
MATERIELS ET METHODES Erythrocytes Les 6rythrocytes d'adultes sains ont 6t6 obtenus de pr61~vements de donneurs de sang du CRTS de Nantes. Les 6rythrocytes de foetus (21 h 25 semaines), de nouveau-ntis (sang de cordon) et de femmes venant d'accoucher ont 6t6 collect6s au CHR de Nantes. Le traitement des cellules par la trypsine (Serva, 55 U/rag), la ficine (Serva, solution h 1%), la bromeline (Sigma, solution ~ 750 U/l), la neuraminidase de Vibrio cholerae (NVC: Behring Werke, 1 U/ml) et l'endo-[3-galactosidase (Bcehringer, 0,1 U/ml) ont 6t6 effectu6s selon les m6thodes d6crites dans la litt6rature [3, 12, 13, 18]. Les cellules ont 6t6 trait6es par la papaine (Diagast) selon la m6thode pr6conis6e par le fabricant.
Pr6paration des anticorps monoclonaux Les spl4nocytes utilis6s pour la fusion 46 ont 6t6 obtenus d'une souris Balb/c immunis6e par injection intrap6riton6ale/t J0 de 5 x 108 h6maties foetales (groupe A) et ~ J44 de la m~me quantit6 d'h6maties foetales papain6es. La souris Balb/c utilis6e pour la fusion 61 a 4t6 immunis6e de la m6me fa~on/t J0 et J44 e t a subi une nouvelle injection de 5 x 100 6rythrocytes f0etaux papain4s 5 mois apr6s la pr6c6dente immunisation. Les souris ont 6t6 sacrifi6es 4 jours apr6s la dernihre injection. Les spl4nocytes ont 6t4 fusionn6s avec des cellules my61omateuses de souris SP2/0-Agl4 et les hybrides ont 6t6 s61ectionn6s sur milieu RPMI/HAT selon la m6thode d6crite par Campbell [1]. Les hybrides s6crdteurs ont 6t6 identifi6s par l'activit6 agglutinante des surnageants de culture et clon6s deux lois successivement par la m6thode de dilution limite en milieu liquide. Plusieurs cl6nes cellulaires ont 6t6 s61ectionn6s pour leur capacit6 de s6cr6tion d'anticorps agglutinant les hdmafies fcetales non trait6es ou papain6es : un cl6ne originaire de la fusion 46 (NaM46-4A8) et deux cl6nes originaires de la fusion 61 (NaM61-1A2 et NaM61-7G8). Les caract6ristiques des surnageants correspondants, d6nomm6s pour simplifier 46-4A8, 61-1A2 et 61-7G8 sort rapport6s dans les tableaux I d I K
242
B L A N C H A R D D. et coll.
Tests d'agglutination Les tests d'agglutination lors du - screening ,, des hybrides s4cr6teurs ont 6t6 effectu6s en plaques de rnicrotitration en U (Greiner) en utilisant 25 gl des suspensions 4rythrocytaires a 2 % en PBS, pH 7,4 et 25 gl des surnageants de culture, avec une incubation d ' u n e h e u r e ~ 4 °C. La technique en tube de Kahn a 6t6 effectu6e en incubant 15 min ou 1 h, /t 4, 22 ou 37 °C, 50 ktl de suspension 6rythrocytaire ~ 4 % et 50 gl de surnageant de culture. Les agglutinats ont 6t6 observ6s aprhs centrifugation 1 min/~ 400 g e t les scores ont 6t6 calcul6s selon la rn6thode de cotation des r4actions [ 14]. Pour le test de Coornbs indirect, une anti-IgG humaine (Coornbs IgG sp6cifique, CRTS de Nantes) ou un anticorps de lapin anti-IgG de souris (Bioatlantic, Nantes ; 0,08 rng/rnl, concentration finale) ont 4t6 utilis4s. La technique d'agglutination en gel a 6t6 effectu6e selon les recommandations du fabricant (Diarned) en utilisant les plaques p o u r test NaC1, enzymatique et agglutinines froides (produit Diarned - ID, Rdf. 5011). Pour les tests d'absorption, un volume de surnageant de culture a 6t4 incub4 avec 1 vol. de culot globulaire lav6 trois fois en PBS, pH 7,4, pendant 18 h ~ 4 °C. Les surnageants obtenus par centrifugation (4 rnin x 1 500 g) ont 6t4 analys6s par la technique d'agglutination en tube. Cytom6trie en flux Les 4rythrocytes (40 gl d ' u n e suspension/~ 10 % soit environ 40 x 106 cellules) ont 6t6 sensibilis6s par incubation avec 200 gl de surnageant de culture pendant 1 h / t 4 °C puis lav6s trois lois en PBS, pH 7,4, contenant 1 % d'albumine bovine (PBS-BSA). Les cellules ont 4t4 incub4es pendant 30 min ~ 4 °Cavec 200 gl d'anticorps de ch6vre anti-IgG de souris purifi6 par affinit4 et rnarqu6 FITC (GAM-FITC, Bioatlantic, Nantes, dilu6 au 1/40) puis lav4es trois lois en PBS-BSA et analys6es au cytomhtre en flux (Ortho Spectrurn III).
RESULTATS Spdcificit6 des anticorps monoclonaux Trois cl6nes cellulaires d6nomrn6s NaM61-1A2, NaM61-7G8 et NaM46-4A8 ont bt6 s61ectionn6s par agglutination d'6rythrocytes provenant de sang de cordons, de foetus ou d'adultes (tabl. I). Les anticorps 61-1A2 et 61-7G8 agglutinent fortement les 6rythrocytes foetaux ou de sang de c o r d o n ind6pendarnrnent de leur groupe sanguin dans le syst6rne ABO. Les 6rythrocytes d'adultes sont faiblernent agglutinfs /~ + 4 °C ; cependant ces agglutinats sont rapidernent dissoci6s /~ ternp6rature ambiante, ce qui n'est pas le cas avec les 4rythrocytes foetaux (ou de cordon).
MONOCLONA UX ANTI-I ET I-LIKE
243
Tableau I
Spdcificitg des anticorps monoclonaux dirig~s contre les ~rythrocytes [oztaux (1). Anticorps (surnageants de culture) Erythrocytes
Groupe
61-1 A2
61-7G8
46-4A8 (2)
Faetus Cordon Cordon Cordon Adulte Adulte
A B O B O
64 64 64 32 2 2
32 32 32 32 2 2
16 16 16 16 0 0
Cordon
O
61-1A2/DTT (3) 0
61-7G8/DTT (3) 0
46-4A8/DTr (3) 16
(]) Les r6sultats sont exprim6s en titre agglutinant ; technique microplaque, incubation 1 h fi 4 °C (2) Les 6rythrocytes ont 6t6 pr6alablement trait6s fi la papaine pour les tests d'agglutination effectu6s avec l'anticorps 46-4A8 (3) Les surnageants de culture ont 6t6 dilu6s au 1/2 en PBS, pH 7,0, contenant 10 mM de DTT avant incubation avec la suspension 6rythrocytaJre.
L'anticorps 46-4A8 poss6de 6galement la propri6t6 d'agglutiner les 6rythrocytess de sang de foetus ou de c o r d o n ~t condition qu'ils aient 6t6 prhalablement trait6s par la papaine. Aucune agglutination n ' a 6t6 observde avec des 6rythrocytes non traitds en utilisant une antiglobulme polyvalente humaine ou un anticorps secondaire anti-IgG de souris. Les cellules de sang d'adultes, papa/n6es, ne sont pas reconnues. L'activit6 agglutinante des anticorps 61-1A2 et 61-7G8 est ddtruite par traitement des surnageants de culture au DTT (tabl. I), montrant que les immunoglobulines monoclonales sont de nature IgM. Par contre, l'anticorps 46-4A8 n'dtant pas althr6 par traitement A l'agent r6ducteur, est de classe IgG. Ces premiers r4sultats m o n t r e n t que les anticorps monoclonaux, obtenus par immortalisation de spl6nocytes de souris immunis6es contre des 6rythrocytes foetaux reconnaissent un antig6ne fortement exprim6 sur les 6rythrocytes de sang de cordon et de foetus. La caract6risation des anticorps a 6t4 poursuivie en c o m p a r a n t leur activit6 biologique avec celle d ' u n anticorps polyclonal h u m a i n dirig6 contre l'antig6ne i caract6ristique des h6maties foetales.
Specificit6 vis-A-vis d'6rythrocytes trait6s par les enzymes ANTICORPS 61-1A2 ET 61-7G8 L'agglntination des 6rythrocytes de sang de cordon (Oi), par les anticorps 61-1A2 et 61-7G8 est facilit6e par traitement /t l'aide des enzymes prot6olytiques (trypsine, papa/he, ficine, et bromeline) ou par la neuraminidase de Vibrio cholerae (tabl. II). Cependant, l'agglutination
244
BLANCHARD D. et coll.
o
~
~
o o
~
©
,
o
~
o
o
g
O0
O0
000
O0
~'~
~.~ ~.~
•"
2
2
~
MONOCLONA UX ANTI-I ET I-LIKE
245
des 6rythrocytes adultes (OI) est 6galement accrue et la difference de titre entre les cellules OI et Oi n'est plus significative, surtout apr~s traitement la bromeline. L'anti-i h u m a i n (s6rum Gau.) agglutine ~galement plus facilement les firythrocytes Oi trait~s par les enzymes prot6olytiques. Les 6rythrocytes adultes deviennent cependant agglutinables apr&s traitement mais la diff6rence de titre observ6e reste significative (tabl. II). Les 6rythrocytes d'adukes et de sang de cordon trait6s par la neuraminidase sont reconnus de fagon comparable par l'anticorps polyclonal. Les mSmes r6sultats ont ~t6 obtenus avec les anticorps 61-1A2 et 61-7G8 montrant que les 6pitopes recolmus par les diff&rents anficorps sont rendus plus accessibles par hydrolyse des acides sialiques. La r6activit6 des anticorps 61-1A2 et 61-7G8 ainsi que celle de l'anti-i humain est compl~tement abolie par traitement des cellules/~ l'endo-~galactosidase (tabI. II), sugg6rant que les anticorps monoclonaux reconnaissent une structure antigfinique identique g celle reconnue par l'anticorps polyclonal. L'hydrolyse par l'endo-[3-galactosidase des chaines oligosaccharidiques lin6aires, correspondant/t l'antig6ne i est sp6cifique [18] et permet de conclure quant /t la reconnaissance sp~cifique de l'antig~ne i par ces anticorps monoclonaux. ANTICORPS 46-4A8 L'anticorps 46-4A8 provoque l'agglutination des 6rythrocytes de cordon trait6s par la papaine, la ficine ou la bromeline (tabl. II) indiquant que l'antigbne correspondant est d6masqu6 apr~s hydrolyse de composants prot6iques de surface. Les 6rythrocytes de sang d'adultes, trait~s de fagon identique, n'6taient pas agglutin6s. Cependant, une agglutination faible, + h ++, a 6t6 observ6e pour environ 50 % des 6rythrocytes d'adultes analys6s (cf. tabl. V). Par contre, la trypsine et la neuraminidase de sp6cificit6 plus restreinte que les enzymes pr6cit6es, ne permettent pas l'accessibilit6 & l'antigbne. De faqon particulibrement int6ressante, le traitement par l'endo-[3galactosidase favorise l'agglutination, contrairement /t ce qui a 6t6 observ~ avec les autres anticorps. L'anticorps 46-4A8 reconnait donc une structure antig6nique non accessible sur les cellules non trait6es, vraisemblablement port6e par des composants lipidiques de la membrane, sp6cifique des 6rythrocytes feetaux ou de sang de cordon, et diff6rente de l'antig6ne i.
Caract6ristiques s6rologiques des anticorps DI~PENDANCEDE LATEMPERATURE Les anticorps monoclonaux pr6sentent c o m m e l'anticorps polyclonal humain de sp6cificit6 i, un optimum t h e r m i q u e / t + 4 °C (tabl. III). A
246
BLANCHARD D. et coll.
T a b l e a u lII Activitd agglutinante des anticot 9s monoclonaux (surnageants de culture ; p H 7,2) ~ 4, 22 et 37 °C (1 Tempfrature Anticorps
GR
4 °C
22 °C
37 °C
OI Oi
0-1 (0-5) 8-32 (37-57)
8-16 (37-45)
0-0(0-0)
0-0 (0-0) 1-2 (8-10)
NaM61-7G8
OI Oi
0-1 (0-5) 32-32 (52-57)
0-0 (0-0) 8-8 (37-39)
0-0 (0-0) 8-8 (33-35)
Na-M46-4A8
OI (2) Oi (2)
0-1 (0-5) 8-16 (37-47)
0-0 (0-0) 2-4 (17-25)
0-0 (0-0) 4-8 (25-39)
Gan.
OI Oi
0-0 (0-0) 128-256 (85-90)
0-0 (0-0) 1-1 (5-5)
0-0 (0-0) 0-0 (0-0)
NaM61-1A2
(1) Les r6sultats obtenus avec deux h6maties (GR) adultes (0I) ou de sang de cordon (Oi) sont exprimes en titre agglutinant et en score (entre parentheses). (2) Erythrocytes traitds ~ la papaine.
cette tempdrature cependant, les h6maties d'adukes sont faiblement agglutin&s par les m o n o c l o n a u x qui ont une spdcificit6 moindre par rapport au polyclonal. Les anticorps 61-1A2 et 61-7G8 qui m o n t r e n t une sp6cificit6 stricte pour les 6rythrocytes Oi et conservent une activit6 suffisante ~ 22 °C (titre 8-16, score 37-45) seront pr6f6rablement utilis6s /~ cette t e m p 6 r a t u r e en technique tube salin. Notons que l'anti-i h u m a i n correspondant a la classe d'anticorps d 6 n o m m 6 s , agglutinines froides ,, est strictement d6pendant de la temp6rature, son activit6 devient ndgligeable/~ t e m p e r a t u r e ambiante. L'anticorps 46-4A8 devient 6galement sp&ifique ~ temp6rature ambiante mais est trop faiblement agglutinant. Un titre et u n score convenable (titre 4-8, score 25-39) sont obtenus par incubation/~ 37 °C sur h6maties papain6es, ce qui n'est pas surprenant puisque l'anticorps est de classe IgG, D E P E N D A N C E DU
pH
Les anticorps m o n o c l o n a u x conservent un titre agglutinant comparable dans la g a m m e de pH .6,5 ~ 8,5. Cependant les scores sont 16g6rem e n t plus devds/~ pH 6,5 par les anticorps 61-1A2 et 61-7G8, et/t pH 7,5 pour l'anticorps 46-4A8 (rdsultats non montr6s). Notons q u ' a u x diff,rents p H utilisds, aucune agglutination d'drythrocytes d'adultes n ' a 6t6 observ6e. ABSORPTION
Les surnageants de culture 61-1A2 et 61-7G8 pr6alablement incub6s avec des 6rythrocytes de c o r d o n (Oi) n'agglutinent pas les 6rythrocytes d'adultes ou de cordons/~ + 4 °C (r6sultats non montrds).
MONOCLONA UX ANTI-I ET I-LIKE
247
Notons que les anticorps sont totalement absorb6s par incubation avec les 6rythrocytes de c o r d o n alors que dans les m 6 m e s conditions, ils ne le sont que partiellement p a r les 6rythrocytes d'adultes. Globalement, ces r6sultats d' absorption d 6 m o n t r e n t que les anticorps 61-1A2 et 61-7G8 reconnaissent un antighne c o m m u n aux 6rythrocytes d'adultes et foetaux (et de sang de cordon) mais plus faiblement exprim6 sur les 6rythrocytes de sang d'adultes. L ' a n t i c o r p s 4A8 n ' e s t pas absorb6 p a r les 6rythrocytes non traitds de cordon. En c o n c o r d a n c e avec les tests d'agglutination, ce r6sultat d 6 m o n t r e que l'anticorps reconnait un antig6ne masqu6 et non accessible de la m e m b r a n e 6rythrocytaire foetale. VALIDATIONET UTILISATIONDES ANTICORPSNaM61-1A2 ET NaM61-7G8 La rdactivit6 de l'anticorps 61-1A2 a 6t6 test4e vis-a-vis de 106 4chantillons de sang en technique tube en milieu salin ~ t e m p d r a t u r e a m b i a n t e (tabl. IV). Aucune agglutination n ' a fit4 not6e avec les 4rythrocytes de 61 des 62 donneurs de sang analys6s alors q u ' u n e faible r6activit6 (agglutination +) a 4t6 observ6e avec un 6chantillon (soit 1,6 % des cas). La frbquence de r6actions faiblement positives est significativem e n t a u g m e n t 6 e p o u r les f e m m e s venant d ' a c c o u c h e r (33,3 % des cas). Les 6rythrocytes de t o u s l e s 4chantillons de sang de cordon ou de foetus ainsi que les 4rythrocytes H e m p a s , e x p r i m a n t de fa~on a n o r m a l e l'antig6ne i, ont 6t6 f o r t e m e n t agglutin6s. Des r6sultats c o m p a r a b l e s ont 6t6 obtenus dans la technique d'agglutination en gel en utilisant les plaques c o m m e r c i a l e s Diamed p o u r test NaC1. Des petits agglutinats ont fit6 observ6s avec 2 6chantillons de sang d'adultes sur 17 et avec un 6chantillon de sang de f e m m e s venant d ' a c c o u c h e r sur 9. Notons que cette technique qui a donn6 d'excellents r6sultats, facile d'interpr6tation, semble 16ghrement moins sensible par c o m p a r a i s o n / : la technique classique en tube puisque la fr6quence de cas positifs p a r m i les f e m m e s venant d' a c c o u c h e r est plus faible. Par contre, l'agglutination des 6rythrocytes de sang de cordon et de foetus a 6t6 franche dans tous les cas. L' anticorps a de m 6 m e 6t4 utilis4 en cytom6trie en flux indirecte (tabl. IV). Une faible p r o p o r t i o n des 4rythrocytes de sang de dormeurs est r e c o n n u e p a r l'anticorps, et ceci darts tous les cas analys6s, avec une m o y e n n e de 2,2 % de cellules positives (fig. I). En accord avec les tests d'agglutination effectu6s par la technique tube, une p r o p o r t i o n plus i m p o r t a n t e (soit environ 5 %) des 6rythrocytes des f e m m e s venant d ' a c c o u c h e r est r e c o n n u e p a r l'anticorps. Environ 50 % et prbs de 80 % des 6rythrocytes de sang de cordons ou de foetus, respectivement, sont fluorescents dans les conditions du test. La m o y e n n e de fluorescence des 6rythrocytes foetaux (112,7) est sup6rieure celle des 6rythrocytes de sang de c o r d o n (102,2) dans l'exemple pr6sent6 (fig. I), repr6sentatif des diff6rents profils obtenus. Notons que, dans un m61ange artificiel de 50 % d'h6maties de cordon et d'h6maties adultes, 28 % des cellules sont fluorescentes et s6par6es de la population n6gative avec une i m a g e de double population (fig_ I). Ce r6sultat est tout
248
BLANCHARD D. et coll.
OgOA~
~ N
~
~
g
+ +
+
us
03
.~
÷ + 00~-
o
~ ~
=~ ~
"~.~
MONOCLONA UX ANTI-I E T I-LIKE
249 ~00
200
~0
200
~0
200
+{, ,}©
d
i
gi!t .
[:.!!]?:iY;~
-
~
-
~..~
E~.x. L._-__~ •
I
= ¢;,'-,',.~76.:--~@:~i}~
40
80
120
1 6 0 "~.~00
i?OO
,tO
O~e')
l ~0
1 ~,(:~ ~ 0 0
POO #ii~~='i~i,
e
160
200
~
FIG. 1 - Utilisation de l'anticorps m o n o c l o n a l NaM61-1A2 en cytom~trie en flux. Les 6rythrocytes ont 6t6 analys+s selon le protocole d6crit dans ,, Mat&tel et M6thodes ,,. Erythrocytes : a) Adultes, b) Nouveau-n6s, c) Foetus (21 semaines), d) H e m p a s (Dub.), e) et f) M61ange 50 % aduhes et 50 % nouveau-n~s. Pour les exp6riences a, b, c, d, f, les cellules ont 6t6 incub6es avec l'anticurps monoclonal dilu6 au 1/16 puis avec le r6actif secondaire m a r q u 6 au FITC. Pour l'exp6rience e, les cellules ont 6t6 settlement ineub6es avec le r6acfif secondaire. Les cellules darts les zones de fluorescence 4 (exp6riences a, b, c et d) et 2 (experiences e et t) c o r r e s p o n d e n t aux cellules positives ayant r6agi avec l'anticorps. En ordonn6e est indiqu6e la florescente relative des cellules et en abscisse le n o m b r e relatif de cellules analys+es.
BLANCHARD
250
D. et coll.
/~ fait concordant avec les chiffres obtenus par analyse s6parfe des Orythrocytes adultes (98 % de cellules nOgatives) et de sang de cordon (50 % de cellules positives) et nous p e r m e t de consid6rer cette technique de cytomdtrie en flux indirecte c o m m e une m6thode fiable et quantitative p o u r l'analyse des chim0res h6matopo'/6tiques maternelles (sang de la more contaminO par les hdmaties fcetales) et des syndromes my61oprolif6ratifs (expression anormale de l'antig0ne i). L'analyse des 6rythrocytes H e m p a s indique que 42 % des cellules sont r6actives avec l'anticorps
(tabI. IV, fig. 1). Des r6sultats tout/~ fait analogues ont 6t6 obtenus avec l'anticorps monoclonal NaM61-7G8 (r6sultats non mol~t~6s). VALIDATION DE L'ANTICORPS NaM46-4A8 L'anticorps a 6t6 test6 vis-g-vis d ' u n h o m b r e restreint d'fchantillons dans la technique en tube utilisant des h6maties papa2/n6es g 4 °C (tabI. V). Les 6rythrocytes de donneurs et des femmes test6s ne sont pas ou sont faiblement agglutin6s dans les conditions du test. Par contre, les 6rythrocytes fcetanx et de sang de c o r d o n sont fortement agglutin6s ( + + + + dans t o u s l e s cas), de m 6 m e que les h6maties Hempas. Les 6rythrocytes de rex-nines venant d ' a c c o u c h e r expriment plus ou moins l'antig0ne sp6cifiquement r e c o n n u par cet anticorps, c o m m e l'attestent les r6sultats (tabI. V) puisque 4 6chantfllons sur 9 m o n t r e n t une agglutination de + + + . Remarquons que cet antigone n'est pas pr6sent sur les hdmaties Bombay papain6es. L'anticorps de nature IgG n'est pas utilisable dans la technique en gel et n ' a pas 6t6 test6 en c y t o m f t r i e en flux indirecte du fait de la n6cessit6 d'utiliser des cellules trait6es par la papaine.
Tableau V
Rdactivitd de l'anticorps monoclonal NaM46-4A8 (1). Technique tube (2) Erythrocytes A D U L T E S
Donneurs Femmes accouchees Hempas Bombay
Nouveau-n6s (sang de cordon) Foetus (21-25 semmnes)
N
6 9 1 l
-
2 1
±
1 1
+
++
+++
++++
2 3
1
6
6
10
10
(1) UtiIisation d'h6maties papain6s ; utilisation de l'anticorps pur ; incubation 15 min ~ 4 °C (2) L'anticorps n'est pas utilisable en technique en gel NaC1
MONOCLONA UX ANTI-I ET I-LIKE
251
DISCUSSION
En utilisant des spl6nocytes de deux souris immunis6es par injection mtrap6riton6ale d'6rythrocytes foetaux papain6s nous avons obtenu plusieurs d6nes cellulaires s&cr6tant des anticorps monoclonaux dirig6s contre des structures antig6niques fortement exprim6es sur les 6rythrocytes de sang de cordon et de foetus. Les cl6nes NaM46-4A8 d'une part et NaM61-1A2 et NaM61-7G8 d'autre part sont repr6sentatifs des diff,rents cl6nes r6sultant des fusions 46 et 61, respectivement. Les anticorps 61-1 A2 et 61-7 G8, de type IgM, ont la mSme sp6cificit6 pour un antig6ne exprim6/~ la surface des 6rythrocytes non trait6s de foetus et de nouveau-nds~...L'_~.tigbne..est 6galement pr6sent sur les h6maties papain6es d'adulte et est d6truit par clivage des cha~nes oligosaccharidiques ~ l'aide de l'endo-~-galactosidase de B a c t e r o i d e s [ragilis, capable de lib6rer le disaccharide Gall31-4GlcNAc des unit6s r6p6titives (Gall31-4GlcNAc)n [ 18]. Ces caract6ristiques indiquent que les anticorps reconnaissent sp6cifiquement l'antigbne de groupe sanguin i dont la structure minimum, correspondant 5 une chaine lin6aire form6e de deux unit6s r6p6titives Gal~ 1-4GlcNAc, est le lacto-N-norhexaosylceramide : Gal[31-4GlcNAc[~I-3Gal~I-4GlcNAc[31-3Gal-R. Les anticorps 61-1A2 et 61-7G8 se comportent de fagon analogue/t un anti-i polyclonal humain vis-g-vis des 6rythrocytes trait6s par les enzymes prot~olytiques. L'expression de l'antigbne i est augment6e de fagon analogue apr6s traitement par la trypsine, la papaine, la ficine, la brom61ine et la neuraminidase de Vibro cholerae. Ce r6sultat est en accord avec le hombre de sites i expos6s sur des 6rythrocytes de sang de cordon ou d'adultes Oi natifs (30/t 65 000 sites) ou trait6s par la neuraminidase (200 000 sites) [4, 5]. Les anticorps monoclonaux ne sont pas, contrairement/t l'anti-i polyclonal, des anticorps ,, froids ,, et sont actifs /t temp6rature ambiante ou /~ 37 °C. Rappelons cependant que leur activit6 est plus importante g 4 °C, temp6rature ~ laquelle les 6rythrocytes adultes, qui expriment faiblement l'antig6ne i, sont agglutin6s. Les chalnes oligosaccharidiques lin6aires correspondant a l'antig6ne i sont port6es par des composants glycolipidiques et glycoprot6iques de la membrane 6rythrocytaire [2, 6-9, 11, 17]. Les anticorps 61-1A2 et 61-7G8 se fixent sur la bande 3 et le complexe prot6ique correspondant la bande 4.5 transf6r6s sur membrane de nitrocellulose (r6sultats non montr6s). Cependant les anticorps reconnaissent ~galement la prot6ine 4.5, et tr6s faiblement la bande 3, d'6rythrocytes d'adultes. Ces r6sultats pr61iminaires montrent que l'antig6ne i est associ6 aux composants prot6ielues de la membrane d'6rythrocytes de sang de cordons et d'adultes, et sugg6rent que la r6activitfi forte des 6rythrocytes de cordon est en majorit6 due (du moins en ce qui concerne les glycoprot6ines),/t la bande 3. L'analyse des composants glycolipidiques, glycolipides neutres et
252
B L A N C H A R D D. et coll.
gangliosides, est en cours et p e r m e t t r a de d6montrer la sp6cificit6 mol6culaire des anticorps monoclonaux_ L'expression des antig6nes I et i n'est pas restreinte aux 6rythrocytes, les antig6nes 6tant pr6sents /t la surface de nombreuses cellules de l'organisme et dans les liquides biologiques [17]. En accord avec les travaux rapport6s dans l'ouvrage de Salmon et coll. [17], une activit6 i comparable a 6t6 raise en 6vidence, par test d'inhibition de l'agglutination induite par les anti-i monoclonaux, dans les plasmas d'adultes ou de nouveau-n6s (r6sultats non montrds). Par contre, aucune activit6 n ' a 6t6 dfcel6e dans des salives d'adultes sdcr6teurs ou non s6cr6teurs. Les anticorps rnonoclonaux 61-1A2 et 61-7G8, de sp6cificit6 i, sont utilisables dans les techniques d'agglutination en gel et cytom6trie en flux. L'analyse de l'expression de l'antig~ne i dans divers 6tats leuc6miques, pr6-1euc6miques ou lors de syndromes my61oprolif6ratifs ou de dys6rythropo-f6se (telle que celle de type Hempas) se trouve facilit6e par l'utilisation de ces anticorps_ En particulier, la cytom6trie en flux p e r m e t la quantification des doubles populations 6rythrocytaires I e t i e t donc l'6valuation du transfert des 6rythrocytes du foetus/t la m6re lors de la vie embryonnaire et/~ l'accouchement. L'anticorps 46-4A8, de classe IgG, reconna~t une structure antig6nique fortement exprim6e sur les 6rythrocytes, trait6s/t la papaine, la ficine ou la brom61ine, de foetus ou de nouveau-n6s. L'antigbne n'est pas exprim6 sur les 6rythrocytes foetaux non traitds ou trait6s par la trypsine ou la neuraminidase et devient accessible par traitement g l'endo-[3galactosidase. Ces r6sultats m o n t r e n t que l'anticorps 46-4A8 reconnait une structure diff6rente de l'antigbne i dont une des caract6risfiques essentielle est la sensibilit6 ~ l'endo-13-galactosidase. L'antig6ne r e c o n n u est 6galement faiblement exprim6 sur les 6rythrocytes papa'/nfs d'adultes_ I1 pourrait correspondre h une structure glycolipidique accessible apr6s clivage enzymatique des prot6ines et glycoprot6ines majeures. Alternativement, il pourrait correspondre a u n antig6ne cryptique, d6masqu6 par traitement enzymatique. L'analyse biochimique des diff6rents composants membranaires obtenus des m e m b r a n e s trait6es/~ la papaine et/~ l'endo-i3-galactosidase p e r m e t t r a de d6terminer si l'6pitope est port6 par un c o m p o s a n t glycolipidique, glycoprot6ique, ou les deux c o m m e cela est le cas p o u r l'antig6ne i.
CONCLUSION Les anticorps m o n o c l o n a u x dirig6s contre les diff6rents antig6nes de la m e m b r a n e ~rythrocytaire constituent d'excellents r6actifs utilis~s p o u r le groupage sanguin et tendent h supplanter les anticorps polyclonaux pour des raisons de qualit6, de sfcurit6 et d'6thique. Les anticorps m o n o c l o n a u x murins reconnus lors de cette 6rude r e c o n n a i s s e n t des structures antig6niques fortement exprim6s sur les 6rythrocytes foetaux et de nouveau-n6s. L'un de ces antig6nes a 6t6 identifi6/~ l'antig6ne de
MONOCLONA UX ANTI-I ET I-LIKE
253
g r o u p e s a n g u i n i qui est m a r q u e u r d e l ' o n t o g 6 n 6 s e d e l ' o n c o g 6 n 6 s e c h e z l ' h o m m e . Ces a n t i c o r p s r e p r 6 s e n t e n t d o n c d e s outils p o u r le d i a g n o s t i c d e d i v e r s s y n d r o m e s h 6 m a t o l o g i q u e s et p o u r la r a i s e e n 6 v i d e n c e d e s 6 r y t h r o c y t e s f0etaux darts le s a n g m a t e r n e l .
BIBLIOGRAPHIE [1] CAMPBELLA.M. - Monoclonal antibody technology. In : Burdon R.H., van Knippenberg P.H. (eds). Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Amsterdam Elsevier, 1984. [2] CHILDS R.A., FEIZI T., TONEGANAY. - Multiplicity of molecules carrying blood group I antigen on erythrocyte membranes. Biochem. J., 1979, 181, 533-538. [3] DAHRW., MULLERT., MOULDSJ., BAUMESTEIRG., ISSlTT P.D., WILKINSONS., GARRATTY G . - High-frequency antigens of h u m a n erythrocyte membrane sialoglycoproteins. I. En" receptors in the glycosylated domain of the MN sialoglycoprotein. Biol. Chem. Hoppe-SeyIer, 1985, 366, 1033-1045. [4] DOINEL C., ROPARS C., SALMON G. -- Effects of proteolytic enzymes and neuraminidase on the I and i erythrocyte antigen sites. Quantitative and thermodynamic studies. Immunology, 1978, 34, 653-662. [5] DOINEL C., ROPARS C., SALMON C_ - Quantitative and thermodynamic measurements on I and i antigens of h u m a n red blood cells. Immunology, 1976, 30, 289-297. [6] FUKUDA M., FUKUDA M.N., HAKOMORt S.I. - Development change and genetic defect in the carbohydrate structure of band 3 glycoprotein of human erythrocyte membrane. J. Biol. Chem_, 1979, 254, 3700-3703. [7] FUKUDAM.N., FUKUDAM., HAKOMORI S.I. - Cell surface modification by endo-J3-galactosidase. J. Biol. Chem., 1979, 248, 5458-5465. [8] FEIZI T., CHILDS R.A., HAKOMORIS.I., POWELLM.E. - Blood group Ii active gangliosides of h u m a n erythrocyte membrane. Biochem. J., 1978, 193, 245-254. [9] GARDASA., KOSClELAKJ. - I active antigen of h u m a n erythrocyte membrane. Vox Sang., 1974, 26, 227-237. [10] HIROHASHIS., CLAUSEN H., NUDELMAN E., INDUE H., SHIMOSATOY., HAKOMORI S. - A h u m a n monoclonal antibody directed to blood group i antigen ; heterohybridoma between h u m a n lymphocytes from regional lymph nodes of a lung cance patient and mouse myeloma. J. Immunol., 1986, i36, 4163-4168. [11] KOSCIELAK J., ZDEBSKA E., WILCZYNSKA Z., MILLER-PODRASA H., KZIERSKOWA-BORODEJ W. -- Immunochemistry of Ii active glycosphinglolipids of erythrocytes. Eur. J. Biochem., 1979, 96, 331-337. [.12] LATRONF., BLANCHARDD., CARTRONJ.P. - Immunochemical characterization of the h u m a n blood cell membrane glycoprotein recognized by the monoclonal antibody 12E7. Biochem. J., 1987, 247, 757-764. [13] MALLISSONG., MARTINP.G., ANSTEED.J., TANNERM.J.A., MERRYA.H., TILLS D., SONNEBORN G.H. - Identification and partial characterization of the h u m a n erythrocyte membrane component (s) that express the antigens of the LW blood-group system. Biochem. J., 1986, 234, 649-652. [14] MARSH W.L. -- Scoring of hemagglutination reactions. Transfusion, 1972, 12, 352-353. [15] MIYAKE M., KOHNO N., N[UDELMAN E.D., HAKOMORI S.I. - H u m a n IgG3 monoclonal antibody directed to an unbranched repeating type 2 chain (Gal[31-4GlcNAc[31-3Gal~1-4GlcNAc[31-3 Gal~ l-R) which is higly expressed in colonic and hepatocellular carcinoma. Cancer Res., 1989, 49, 5689-5695.
BLANCHARD D. et coll.
254
[16] PILLERF., CARTRONJ.P., MARANDULAA., VEYRIERESA., LEROYY., FOURNETB. - Biosynthesis of blood group I antigens. J. Biol. Chem., 1984, 259, 13385-13390. [17] SALMONC., CARTRONJ_P., ROUGERP. - Les antigbnes I e t i. In : Les groupes sanguins chez l'homme. Masson, Paris, 1991, pp. 196-211. [18] SCCI)DERP., LAWSONA.M., HOUNSELLE.F., CARRUTHERSR.A., CmLDS R.A., FEIZI T. - Characterization of oligosaccharides released from human-bloodgroup O erythrocyte glycopeptides by the endo-[3-galactosidase of Bacteroides [ragilis. Eur. J. Biochem., 1987, 168, 585-593. [19] TANNERM.J-A., ANSTEED.J., MAWBYW. A new h u m a n erythrocyte variant (Ph) containing an abnormal sialoglycoprotein. Biochem. J., 1980, 187, 493-497. [20] TsuJi Y., CLAUSENH., NUDELMANE., KAIZUT., HAKOMORIS., ISOJIMAS. -H u m a n sperm carbohydrate antigens defined by an antisperm h u m a n monoclonal antibody derived from an infertile w o m a n antisperrn antibodies in her serum. J. Exp. Med., 1988, 168, 342-356. -
