€ge 1 Freie Vortra

€ ge Freie Vortra FV1 HDAC inhibitors decreases lymphangiogenesis by inducing apoptosis and cell cycle arrest via p53/p21-dependent pathways I. Hrgovic; M. Doll; A. Pinter; R. Kaufmann; M. Meissner € t, Klinik fu€ r Dermatologie, Johann Wolfgang Goethe-Universita Venerologie und Allergologie, Frankfurt a. M., Deutschland Question: Lymphangiogenesis is a crucial step in the progression of cancer. Formation of new lymphatic vessels provides an additional route for tumor cells to metastasize. Therefore, inhibiting lymphangiogenesis represents an interesting target in cancer therapy. Recent evidence suggests that histone deacetylase inhibitors (HDACi) may mediate part of their antitumor effects by interfering with angiogenesis. We therefore examined the potential impact of three different HDACi, trichostatin A (TSA), sodium butyrate (NaB) and valproic acid (VPA) on cell proliferation in primary human lymphatic endothelial cells (LEC). Methods: We hypothesized that HDACi might have anti-lymphangiogenic qualities. To prove this assumption, we performed cytotoxicity-, ELISA-, lymphangiogenesis- and cell cycle FACS-assays as well as Western blot and mRNA analysis with primary human lymphendothelial cells (LEC) during the treatment with HDACi and siRNA against p21 and p53. Results: HDACi inhibited cell proliferation in a concentration-dependent manner. We found that TSA induced G0/G1 arrest in LEC. Cell cycle arrest was accompanied by up-regulation of p53 and p21. Moreover, we found that p21 mRNA was significantly up-regulated by TSA, while the protein and mRNA half-life remains largely unaffected. The promoter activity of p21 was enhanced by TSA indicating a transcriptional mechanism. Subsequent EMSA analyses showed increased constitutive Sp1/3-dependent DNA binding in response to HDAC inhibition. We demonstrated that p53 was required for TSA induced p21 expression. Interestingly, siRNA-mediated p21 depletion reduced the antiproliferative effects of TSA in LEC. In addition, TSA induced apoptosis by cytochrome c release, activating Caspase-9/-7 and down-regulating the anti-apoptotic proteins cIAP-1/-2. In further analysis, we could demonstrate an inhibition of the formation of capillary like structures by TSA treatment. Conclusion: In conclusion, we demonstrate that HDACi have distinct anti-lymphangiogenic effects by activating the intrinsic apoptotic pathway and cell cycle arrest via p53/p21-dependent pathways.

FV2 GARP promotes regulatory immune cells in the tumor microenvironment

€cher1; D. Schuppan2; H. Jonuleit1; S. Hahn1; M. Weilba 1 € ttenberg A. Tu 1 University Medical Center Mainz, Dermatology, Mainz, Deutschland and; 2University Medical Center Mainz, Institute of Translational Immunology, Mainz, Deutschland

The tumor microenvironment includes immune inhibitory cell populations such as regulatory T cells (Treg), myeloid-derived suppressor cells (MDSC), M2 macrophages and tolerogenic dendritic cells (tolDC). In addition, inhibitory factors of the cancer cells themselves play a major role for tumor immune escape. A better understanding of molecules and pathways regulating melanoma initiation and progression that could be used as therapeutic targets or biomarkers is needed. In the past, several studies have reported expression of Treg markers such as FoxP3 in different tumor entities including

melanoma. Surprisingly, we also observed GARP (glycoprotein A repetitions predominant) on melanoma cell surface, an activation marker of Treg that binds TGF-b and is involved in the mediation of immunosuppression. In the present study we analyzed the functional relevance of GARP on different effector cells in the tumor micromilieu, using a soluble GARP protein (sGARP). Beside its direct regulatory function on CD4+ T cells resulting in the differentiation into peripheral Treg, sGARP suppressed the proliferation and Granzyme B expression of CD8+ T cells. Furthermore, DC cultured in the presence of sGARP showed reduced T-cell stimulatory capacity. We also investigated the effect of GARP on macrophage polarization which can be divided into a classically (M1) or alternatively activated (M2) phenotype depending on the cytokine environment. While M1 macrophages are associated with the induction of immune responses, M2 macrophages suppress immunity and promote tumor progression. Interestingly, macrophages cultured in the presence of sGARP differentiated into an M2-like phenotype. In conclusion, the presence of GARP in the tumor micromilieu either on Treg or on tumor cells may represent a functional relevant immunosuppressive molecule contributing to tumor immune escape by preventing effector cell responses while promoting regulatory cell populations in the tumor microenvironment.

FV3 Sozio-demographische Faktoren als Versorgungsmerkmale des malignen Melanoms in Deutschland

€fer1; M. Reusch2; M. Augustin1 I. Scha 1 € tsklinikum Hamburg-Eppendorf, Institut fu€ r Universita Versorgungsforschung in der Dermatologie und bei Pflegeberufen (IVDP), Hamburg, Deutschland and; 2 Dermatologisches Zentrum Tibarg, Hamburg, Deutschland Hintergrund: Zur Versorgung des malignen Melanoms (MM) liegen in Deutschland nur wenige bev€ olkerungsbezogene Daten vor. Zielsetzung: Analyse des Zusammenhangs von sozio-demographischen und regionalen Faktoren, Krankenversicherung (KV) und klinischen Merkmalen des MM. Methoden: Im Rahmen einer dermatohistopathologischen versorgungswissenschaftlichen Prim€ardatenstudie wurde alle Exzisate der Jahre 2009-2013 aus einem bundesweit t€atigen dermatohistopathologischen Einsendelabor hinsichtlich tumorspezifischer und sozio-€ okonomischer Merkmale von MM erfasst. Ergebnisse: N = 4.840 histologisch verifizierte MM von n = 4.583 Patienten (51.9% m€annlich, Altersdurchschnitt 63 Jahre.) wurden analysiert. Bei n = 2.537 (52.4%) aller MM handelte es sich um invasive Tumoren, deren mittlere vertikale Eindringtiefe als klinisch relevanter Marker der Versorgung herangezogen wurde. Diese lag im Mittel bei 1.09 mm. Ab einem Alter von 20 Jahren stieg die Eindringtiefe kontinuierlich mit dem Alter an; von 1.00 mm in der unteren bis zu 1.56 mm bin der h€ ochsten Altersgruppe (p < 0.001). Kontrolliert f€ ur den Einfluss von Alter, Geschlecht und Wohnortmerkmal wiesen MM bei Versicherten der Landwirtschaftlichen Krankenkasse (LKK) und der AOK mit 1.67 bzw. 1.20 mm signifikant erh€ ohte mittlere Eindringtiefen auf. Die (nicht signifikanten) niedrigsten Eindringtiefen zeigten MM bei Versicherten privater (0.99 mm) und Ersatzkassen (z.B. Barmer GEK 0.93 mm. Bei Zugrundlegung einer standardisierten 4-stufigen Kategorisierung des Wohnortes zeigte sich, dass die mittlere Eindringtiefe umso h€ oher lag, je l€andlicher der Charakter des Wohnortes ausgepr€agt war (von 1.05 mm in Kernst€adten bis zu 1.22 mm im l€andlichen Raum, nicht signifikant).

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JDDG | Supplement 3 2014 (Band 12) 

€ge 2 Freie Vortra Die Verteilung der Lokalisationen variierte signifikant nach soziodemographischen Merkmalen: Den gr€ oßten Anteil an MM im Kopf-/ Halsbereich wiesen Versicherten der LKK (52.3%) und der AOK (30.2%) auf, bei Ersatzkassenversicherten und Beamten lag dieser bei 18.5% bzw. 17.6%. Rumpf und untere Extremit€aten dagegen waren vergleichsweise h€aufiger bei privat, BKK und ErsatzkassenVersicherten betroffen. Schlussfolgerung: Krankenversicherungsstatus, Alter und Geschlecht sind relevante Determinanten der Versorgung maligner Melanome in Deutschland. Dies sollte im Rahmen von Pr€aventionsprogrammen sowie krankenkassenspezifischen Maßnahmen zur Fr€ uherkennung ber€ ucksichtigt werden.

Ansprechdauer und verl€angertem PFS, bei einem insgesamt g€ unstigerem Nutzen-/Risiko-Verh€altnis f€ ur die 200 mg Dosis. Anhang 1.

FV4 BOLT – eine randomisierte, doppelblinde Studie mit Sonidegib (LDE225) bei Patienten mit lokal fortgeschrittenem oder metastasiertem Basalzellkarzinom R. Gutzmer1; M. Migden2; A. Guminski3; L. Dirix4; K. Lewis5; P. Combemale6; R. Herd7; S. Gogov8; T. Yi9; M. Mone9; R. Kudchadkar10; U. Trefzer11; J. Lear12; D. Sellami9; R. Dummer13 1 Medizinische Hochschule Hannover, Klinik fu€ r Dermatologie, Allergologie und Venerologie, Hannover, Deutschland; 2The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, USA; 3Royal North Shore Hospital, St. Leonards, Australien; 4 Sint-Augustinus Ziekenhuis, Antwerp, Belgien; 5University of Colorado Cancer Center, Aurora, USA; 6Centre Leon Be rard, Lyon, Frankreich; 7Glasgow Royal Infirmary, Glasgow, Vereinigtes Ko€ nigreich; 8Novartis Pharma AG, Basel, Schweiz; 9 Novartis Pharmaceuticals Corporation, East Hanover, USA; 10 H. Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Tampa, USA; 11Dermatologikum Berlin, Berlin, Deutschland; 12 Manchester Royal Infirmary, Manchester, Vereinigtes Ko¨nigreich and; 13Universita¨tsspital Zu¨rich, Skin Cancer Center University Hospital, Zu¨rich, Schweiz Hintergrund: Patienten mit fortgeschrittenem Basalcellcarcinom (BCC) haben begrenzte Behandlungsoptionen. Der Hedgehog-Signal€berexprimiert ist, wird durch selektive weg, der in ≥ 95% der BCCs u Hemmung des Smoothened - Proteins mit Sonidegib blockiert. Methoden: In der Phase-2 Studie BOLT (NCT01327053) wurden Patienten mit lokal fortgeschrittenem BCC (LaBCC), f€ ur die eine kurative Operation oder Bestrahlung nicht angemessen oder m€ oglich war, und Patienten mit metastasiertem BCC (mBCC) im Verh€altnis 1:2 auf die Behandlung mit 200 mg oder 800 mg Sonidegib oral einmal t€ aglich randomisiert. Der Prim€are Endpunkt, die objektive Ansprechrate (ORR - histopathologisch best€atigtes komplettes Ansprechen (CR) + teilweises Ansprechen (PR); erreicht bei Punktsch€ atzung ≥ 30% und unterer Grenze des 95%-Konfidenzintervalls ≥ 20%) sowie die Sekund€aren Endpunkte (Dauer des Ansprechens (DoR), CR Rate, Zeit bis zum Ansprechen (TTR) und progressions€ freies Uberleben (PFS)) wurden entsprechend eines modifizierten RECIST (mRECIST, f€ ur LaBCC) bzw. nach RECIST 1.1 (mBCC) durch zentrale Auswertung ermittelt. Ein statistischer Vergleich der beiden Dosis-Arme war nicht geplant. Die Sicherheit wurde bis 30 Tage nach Einnahme der letzten Dosis untersucht. Ergebnisse: Von Juli 2011 bis Januar 2013 wurden 194 LaBCC und 36 mBCC Patienten eingeschlossen. Der Prim€are Endpunkt wurde in beiden Armen erreicht, bei einem medianen Follow-Up von 13.9 Monaten (Tabelle). Die mediane Exposition lag bei 8.9 (200 mg) bzw. 6.5 (800 mg) Monaten. Die H€aufigkeit von Nebenwirkungen war bei Dosierung von 200 mg niedriger. Die Nebenwirkungen, die zum Abbruch f€ uhrten, waren Muskelkr€ampfe (3.8%/8.7%), Geschmacksst€ orung (2.5%/4.7%), Gewichtsabnahme (2.5%/4.7%) und € Ubelkeit (2.5%/4.0%, Angaben jeweils f€ ur 200 mg/800 mg Arm). Fazit: Beide Dosen von Sonidegib erreichten das vorgegebene Tumoransprechen und eine bedeutende Tumorkontrolle mit nachhaltiger JDDG | Supplement 3 2014 (Band 12) 

FV5 €berlebens nach Therapie mit Evaluation des Langzeitu Ipilimumab bzw. Vemurafenib bei Patienten mit metastasiertem malignem Melanom B. M. Rudolph; A. Groffik; D. Faidt; S. Grabbe; C. Loquai € tsmedizin Mainz, Hautklinik, Mainz, Deutschland Universita Fragestellung: Mit der Zulassung von CTLA4-Antik€ orpern (Ipilimumab) sowie BRAF-Inhibitoren (Vemurafenib) konnte das Gesamt€ uberleben von Patienten mit metastasiertem Melanom in den vergangenen Jahren signifikant verl€angert werden. Unter beiden Therapien zeigen sich bei kleineren Patientenkollektiven auch l€angerfristige Ansprechraten. Ziel unserer Erhebung war es daher, das Langzeit€ uberleben nach Therapie mit Ipilimumab bzw. Vemurafenib in unserem Hautkrebszentrum zu evaluieren. Methoden: Es erfolgte eine retrospektive Datenerhebung von allen Patienten, die von Mai 2010 bis Februar 2014 aufgrund eines nichtresektablen metastasierten kutanen Melanoms in unserer Klinik mit Ipilimumab oder Vemurafenib behandelt wurden. Patienten, die wir im Verlauf ihrer Erkrankung mit beiden Therapien behandelten, wurden nicht eingeschlossen. Bei der Auswertung ber€ ucksichtigten wir das Gesamt€ uberleben, das finale Ansprechen sowie die Therapiedauer. Als Langzeit€ uberlebende wurden Patienten mit mindestens € 18-monatigem Uberleben nach Behandlungsbeginn definiert. Ergebnisse: Es wurden insgesamt 83 Patienten analysiert. 41 Patienten erhielten eine Therapie mit Ipilimumab, 42 Patienten mit Vemurafenib. Das durchschnittliche Gesamt€ uberleben lag bei 11.5 Monaten (0–42 Monate) im Ipilimumab-Kollektiv, sowie 9.8 Monaten (1–43 Monate) unter Vemurafenib-Therapie. Ein Langzeit€ uberleben konnte in der Ipilimumab-Gruppe bei neun Patienten (22.0%) erreicht werden. In der Vemurafenib-Gruppe erreichten dies sechs Patienten (14.3%). Von den mit Ipilimumab behandelten Langzeitansprechern bekamen 33.3% eine Reinduktionstherapie. Bei den Langzeitansprechern unter Vemurafenib erhalten aktuell noch 66.6% die orale Medikation. Unter den Langzeit€ uberlebenden erreichten vier Patienten der Ipilimumab-Gruppe sowie f€ unf Patienten der Vemurafenib-Gruppe eine Komplettremission.

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€ge 3 Freie Vortra Schlussfolgerung: Sowohl Ipilimumab als auch Vemurafenib k€ onnen beim fortgeschrittenen Melanom Langzeitansprechraten erzielen. In unserem Zentrum konnten wir bei 22.0% der behandelten Patienten mit Ipilimumab sowie bei 14.3% der mit Vemurafenib behandelten € Patienten ein Uberleben von mindestens 18 Monaten beobachten. Subgruppenanalysen an gr€ oßeren Kollektiven sind notwendig, um potentielle Langzeitansprecher m€ oglichst schon pr€atherapeutisch zu identifizieren und der f€ ur sie geeigneteren Therapie zuzuordnen.

FV6 Association of leukocyte counts and adverse events in BRAF inhibitor-treated patients 1,2

1,2

1,2

I. Cosgarea ; W. Sondermann ; E. Livingstone ; K. Griewank1,2; B. Weide3,2; C. Loquai4,2; J. Hassel5,2; €hler6; J. Utikal7,2,8; P. Al Ghazal9; R. Gutzmer9; K. C. Ka S. M. Goldinger10; D. Schadendorf1,2; L. Zimmer1,2; B. Schilling1,2 1 University Duisburg-Essen, University Hospital, Department of Dermatology, Venerology and Allergology, Essen, Germany; 2 German Consortium for Translational Cancer Research Heidelberg (DKFZ), Heidelberg, Germany; 3University of Tu€ bingen, University Medical Center, Tu€ bingen, Germany; 4 University of Mainz, Department of Dermatology, Mainz, Germany; 5Heidelberg University Hospital, Department of Dermatology, Heidelberg, Germany; 6University of SchleswigHolstein Hospital, Department of Dermatology, Venerology and Allergology, Kiel, Germany; 7University Medical Centre Mannheim, Department of Dermatology, Venereology and Allergology, Mannheim, Germany; 8German Consortium for Translational Cancer Research (DKFZ), Clinical Cooperation Unit Dermato-Oncology, Heidelberg, Germany; 9Hannover Medical School, Department of Dermatology and Allergy, Hannover, Germany and; 10University Hospital Zu€ rich, Department of Dermatology, Zu€ rich, Schweiz Introduction: Selective BRAF inhibitors (BRAFi) such as dabrafenib and vemurafenib prolong survival of patients with advanced melanoma but can cause severe adverse events (AE). Risk factors for the development of AE are unknown. To investigate if the distinct immunomodulatory effects of selective BRAFi might contribute to the occurrence of AE, we performed a retrospective analysis of BRAFi-treated patients to define immunological biomarkers predicting BRAFi-induced AE. Materials and Methods: Clinical data of 121 vemurafenib-treated and 30 dabrafenib-treated patients were collected in skin cancer units in Germany and Switzerland. Whole blood counts (WBC) were determined by automated hematological analyses devices within 4 weeks prior to starting BRAFi treatment. Treatment-related AE occurring within the first 12 weeks of therapy were categorized and assessed according to CTC AE criteria (4.0). Statistical analyses were performed using SPSS. Results: Treatment-related cutaneous, hepatic (liver function test (LFT)), gastrointestinal (GI), musculoskeletal and AE affecting the general condition were noted in 80.1% (97/121), 43% (52/121), 43% (52/121), 43.8% (53/121) and 52.1% (63/121) of vemurafenibtreated patients, respectively. AE rate was lower in dabrafenib-treated patients (cutaneous: 36.7% (11/30), LFT: 10% (3/30), GI: 16.7% (5/30), musculoskeletal: 6.7% (2/30), general condition: 53.3% (16/30)). Higher pre-treatment eosinophil counts correlated with the number of cutaneous AE in vemurafenib-treated patients (r = 0.21, p < 0.05). Further, patients with eosinophil counts higher than 0.08/nl had an increased risk for developing more than one cutaneous AE (odds ratio (OR) 2.4, p < 0.05). In contrast, peripheral monocytes showed an inverse correlation with both cutaneous (r = -0.2, p < 0.05) and musculoskeletal (r = -0.31, p < 0.001) AE. Patients with a peripheral monocyte count below 0.57/nl prior to treatment were prone to develop cutaneous (OR 3.6, p < 0.05) and musculoskeletal toxicity (OR 3.7, p < 0.01) as compared to patients

with higher monocyte counts. None of these associations were found in dabrafenib-treated patients. Pre-treatment lymphocyte counts were not associated with any of the AE assessed. Conclusion: Pre-therapeutic monocyte counts showed an inverse correlation with musculoskeletal and cutaneous AE, while eosinophil counts were associated with the occurrence of cutaneous AE in vemurafenib-treated patients. No correlations were found in dabrafenibtreated patients, possibly due to the small sample size. Our preliminary data indicate that hematological parameters could be valuable in terms of predicting and managing vemurafenib-related AE.

FV7 Systemtherapie des metastasierten Uveamelanoms: Literatur-Review und Analyse klinischer Endpunkte

€der2; G. Gelbrich3; K. Buder1,2; A. Gesierich1; U. Ma 1 1 € E.-B. Brocker ; M. Goebeler 1 € tsklinikum Wu€ rzburg, Klinik und Poliklinik fu€ r Universita Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Wu€ rzburg, Deutschland; 2Comprehensive Cancer Center Mainfranken, €t Wu€ rzburg, Deutschland and; 3Julius-Maximilians-Universita Wu€ rzburg, Institut fu€ r Klinische Epidemiologie und Biometrie, Wu€ rzburg, Deutschland Hintergrund: Die Prognose von Patienten mit metastasiertem Uvea€ melanom (mUM) ist mit einer medianen Uberlebensrate von 6-10 Monaten sehr schlecht. Die therapeutischen Optionen sind limitiert und deren Ansprechraten sehr gering. Neue molekulare Erkenntnisse haben zu innovativen Therapieans€atzen gef€ uhrt (z. B. MEK-Inhibition bei GNAQ/GNA11 Mutation mit Aktivierung des MAP-KinaseSignalwegs), die aktuell im Rahmen klinischer Studien untersucht werden. € Methoden: Therapie-Ansprechraten, progressionsfreies Uberleben (PFS) und Gesamt€ uberleben (OS) beim mUM wurden analysiert und bewertet: (1) auf der Basis eines Literatur-Reviews zur Systemtherapie des mUM (PubMed, Web of Knowledge, ASCO website, Zeitraum 1980-2013, Buder et al., Cancer Med, 2013) und (2) basierend auf der Zentrumsdatenanalyse f€ ur Patienten mit mUM, die am Universit€atsklinikum W€ urzburg zwischen 2000-2013 eine Erstlinien-Systemtherapie erhielten. (3) Desweiteren wurden die unter ClinicalTrials.gov registrierten, derzeit noch nicht publizierten bzw. aktuell rekrutierenden klinischen Studien mit Systemtherapien beim mUM untersucht und diskutiert. Ergebnisse: (1) In 40 analysierten Studien mit insgesamt 841 auswertbaren Patienten zeigte sich eine mediane Ansprechrate von nur 4.6% (95%CI 3.3-6.3%) f€ ur Systemtherapien (Chemotherapie, Immuntherapie, targeted therapy) beim mUM (Buder et al., Cancer Med, 2013). Das mediane PFS lag bei 1.8 bis 7.2 Monaten, das mediane OS zwischen 5.2 und 19.0 Monaten. (2) In der Zentrumsdatenanalyse von 81 Patienten zeigten nur 1.2% ein objektivierbares Ansprechen. Das mediane PFS lag mit 6.5 Wochen im unteren Bereich der publizierten Studiendaten, das mediane OS lag bei 13 Monaten. (3) Die Ansprechraten neuer Therapieans€atze wie z. B. €ber 15%, zeigen MEK-Inhibitoren liegen voraussichtlich nicht u jedoch ein l€angeres PFS (16 versus 7 Wochen unter Chemotherapie) bei bislang nicht nachgewiesen OS-Verl€angerung (Carvajal et al., ASCO 2013). Fazit: Alle Systemtherapien zeigen niedrige Ansprechraten, daher scheint die Ansprechrate als Endpunkt weniger geeignet als das OS oder das PFS. Das PFS wird unseres Erachtens in der Literatur, wahrscheinlich aufgrund langer Staging-Intervalle, zu hoch eingesch€atzt, was bei der Planung neuer Studien ber€ ucksichtigt werden muss. Referenzen: Buder K., Gesierich A., Gelbrich G., Goebeler M. Systemic treatment of metastatic uveal melanoma: review of literature and future perspectives. Cancer Medicine, 2013, 2(5):674-686. Carvajal, R. D., J. A. Sosman, F. Quevedo, M. M. Milhem, A. M. Joshua, R. R. Kudchadkar, et al. Phase II study of selumetinib versus temozolomide in gnaq/Gna11 mutant uveal melanoma. J Clin Oncol 2013, 31:Abstract CRA9003.

ª 2014 The Authors.  JDDG ª 2014 Blackwell Verlag GmbH, Berlin  JDDG  12 (Suppl. 3), 1–10

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€ge 4 Freie Vortra FV8 Independent validation of a predictive gene-signature based risk score in FFPE primary melanomas difficult to classify by conventional staging G. Brunner1; A. Heinecke2; L. Suter1; J. Atzpodien3 1 € nster, Fachklinik Hornheide, Tumorforschung, Mu € lische Wilhelms-Universita € t, Biometrie Deutschland; 2Westfa € nster, Deutschland and; 3Nielsund Klinische Forschung, Mu € matologie, Stensen-Kliniken, Internistische Onkologie und Ha Osnabru€ ck, Deutschland Current staging of melanoma, as defined by the American Joint Committee on Cancer (AJCC), is based mainly on histopathological criteria but is limited in its ability to predict clinical outcome. Complementary molecular markers are not available for routine prognostic assessment. We have previously identified and validated a prognostic nine-gene signature expressed in fresh-frozen primary cutaneous melanomas (training cohort n = 91, validation cohort n = 44). A signature-based risk score predicts patient overall survival independently of AJCC staging (multivariate regression analysis p = 0.0004; hazard ratio 3.83). In order to translate the risk score into clinical application, the gene signature was recently adapted to formalin-fixed, paraffinembedded (FFPE) melanomas (training cohort n = 125). On the basis of the resulting eight-gene signature, a predictive FFPE melanoma risk score was established (multivariate analysis p = 0.0003; hazard ratio 1.85). The misclassification rates were 20% overall, 13.8% for low-risk gene scores, and 5.7% for double low-risk scores (combined with AJCC staging). Thus, the signature-based risk score complements conventional AJCC staging. Here, we report the validation of the FFPE risk score in an independent cohort of 211 melanomas (across AJCC stages IA/B, IIA/B/C, IIIA/B/C). In order to stringently evaluate the predictive performance of the risk score, a melanoma cohort was selected which was particularly difficult to classify by AJCC staging (misclassification rate 40.8%). In this cohort, predictive performance of the risk score exceeded that of AJCC staging, as demonstrated by multivariate analysis (gene risk score p = 0.0005, hazard ratio 1.41; AJCC staging not significant). Similarly, the misclassification rate of the gene score was slightly lower (39.2%) than that of AJCC staging. Concordance probability estimate (> 0.74) as well as ROC analysis (AUC = 0.91, in combination with AJCC staging) confirmed technical and clinical performance and reliability of the risk score. Thus, we have established and validated a prognostic FFPE melanoma risk score that is complementary to AJCC staging in predicting outcome. The risk score identifies: (i) high-risk patients in AJCC stages IA/B who are currently not treated but are in need of adjuvant therapy (ii) low-risk patients in AJCC stages IIA/B/C and IIIA/B, who are currently treated but could be spared from adjuvant therapy This demonstrates clinical applicability by refining, in combination with AJCC staging, prospective risk assessment.

FV9 Ipilimumab therapy seems to induce CD28 antibodies with inhibitory effect on T cells of melanoma patients: results from a monocenter study including 19 patients

€ hler1; K.-D. Preuss2; E. Janssen1; N. Fadle2; C. Pfo € ller1; M. Pfreundschuh2; T. Vogt1 V. Steiner1; C. S. L. Mu 1 € tsklinikum des Saarlandes, Klinik fu€ r Dermatologie, Universita Venerologie und Allergologie, Homburg, Deutschland and; 2 € tsklinikum des Saarlandes, Jose -Carreras-Zentrum Universita € r Immun- und Gentherapie, Homburg, Deutschland fu

Background: CD28 antibodies (abs) may have immunostimulatory effects by acting as superagonists on the CD28 receptor of T cells followed by induction of T effector cells. On the other hand they may have immunosuppressive effects by activating regulatory T cells or by blocking of the CD28 receptor in its proper function. CD28 abs with inhibitory effects on Jurkat cells in vitro had been found in a previous study in 42/230 (18.3%) of melanoma patients. Therapy with interferons seemed to abet the production of CD28 abs. Only 2/140 (1.4%) healthy blood donors showed CD28 abs. None of the patients in the former study had received ipilimumab. Methods: In a prospective monocenter study we investigated the incidence and prevalence of CD28 abs in 19 melanoma patients with unresectable stage III or IV disease that received ipilimumab in a second-line setting after failure of a prior (chemo-)therapy. Results: We found that 9/19 (47.4%) patients showed CD28 abs. One of 19 patients had CD28 abs at baseline (first ipilimumab application), all others were negative. Eight of 18 (44.45%) initially negative patients showed a seroconversion in the course of time. Two-thirds of patients in stage III showed a seroconversion. Seven of 16 (43.75%) of patients in stage IV showed a seroconversion. Seroconversion was observed in 4/8 patients after the second, in 3/8 patients after the third, and in 1/8 patients after the fourth ipilimumab application. In the majority of patients showing a seroconversion, CD28 abs first increased during ipilimumab therapy and later on declined after finishing ipilimumab application. Purified CD28 abs showed inhibitory effects of Jurkat T cells in vitro. This effect was titer-dependent. Conclusion: Further T cells assays are required to investigate the impact of CD28 abs on T cells of melanoma patients. The results of this study should be reviewed in a prospective multicenter setting including a larger cohort of patients. Potentially, CD28 abs could serve as a relevant biomarker during immunotherapies with e.g. ipilimumab or anti-PD1 antibodies

FV10 MC1R variants increase melanoma risk independent from previous ultraviolet radiation

€ hlbacher1; J. Wendt1; S. Rauscher1; S. Burgstaller-Mu 2 2 1 I. Fae ; G. Fischer ; H. Pehamberger ; I. Okamoto1 1 € t Wien, Universita € tsklinik fu€ r Medizinische Universita Dermatologie, Abteilung fu€ r allgemeine Dermatologie, Wien, € € t Wien, Osterreich and; 2Medizinische Universita € Universita tsklinik fu€ r Transfusionsmedizin, Abteilung fu€ r € Blutgruppenserologie, Wien, Osterreich

Only recently, an ultraviolet-radiation independent mechanism of melanoma development was identified in red-coated mice with decreased MC1R signaling ability, indicating an ultraviolet-radiation independent mechanism in melanoma development. To test this hypothesis in a clinical setting, we evaluated the role of MC1R and melanoma risk independently from actinic skin damage and sunburns. 1791 participants from our M3-Study were included in the analyses. MC1R variant carriers had a 1.76 fold increased risk for melanoma compared to wildtype, and risk was increased with the number of MC1R variants (OR 2.15 for ≥ 2 variants and OR 1.29 for carriers

JDDG | Supplement 3 2014 (Band 12) 

ª 2014 The Authors.  JDDG ª 2014 Blackwell Verlag GmbH, Berlin  JDDG  12 (Suppl. 3), 1–10

€ge 5 Freie Vortra of one variant compared to wildtype). When we adjusted these results for sex, age, sunburns in the past and signs of actinic skin damage, the associations remained significant (OR for R/R 1.64, OR for R/r 2.63, OR for R/0 1.84 and OR for r/r 1.55 when adjusted for facial actinic skin damage, OR for R/r 2.35 and OR for R/0 1.46 when adjusted for dorsal actinic skin damage and OR for R/r 2.54, OR for R/0 1.75 and OR for r/r 1.54 when adjusted for actinic skin damage on the hands) We conclude that risk of melanoma in MC1R variant carriers is determined by other factors than ultraviolet radiation and that further studies are required to elucidate the cause of melanoma development in these high risk individuals.

FV11 TERT promoter mutation status is an independent prognostic factor in cutaneous melanoma K. Griewank1; R. Murali2; J. Puig-Butille3; B. Schilling1; E. Livingstone1; M. Potrony3; C. Carrera3; € ller1; M. Schwamborn1; A. Sucker1; T. Schimming1; I. Mo 1 U. Hillen ; C. Badenas3; J. Malvehy3; L. Zimmer1; A. Scherag4; S. Puig3; D. Schadendorf1 1 € tsklinikum Essen, Hautklinik, Essen, Deutschland; Universita 2 Memorial Sloan Kettering, Pathology, New York, USA; 3 €t University of Barcelona, Barcelona, Spanien and; 4Universita Jena, Jena, Deutschland Background: Recently TERT promoter mutations were identified at high frequencies in cutaneous melanoma samples and cell lines. The mutations were found to have a UV-signature and led to increased TERT gene expression. We analyzed a large cohort of melanoma patients for the presence and distribution of TERT promoter mutations and their association with clinico-pathological characteristics. Methods: 410 melanoma samples were analyzed by Sanger sequencing for the presence of TERT promoter mutations. Analyses of associations between mutation status and various clinical and pathologic variables were performed. Results: TERT promoter mutations were identified in 154 (43%) of 362 successfully sequenced melanomas. Mutations were most frequent in melanomas arising in non-acral skin (48%) and melanoma with occult primary (50%), and less frequent in mucosal (23%) and acral (19%) melanoma. Mutations carried a UV-signature (C>T or CC>TT). The presence of TERT promoter mutations was associated with factors such as BRAF or NRAS mutation (p < 0.001), histologic type (p = 0.002) and Breslow thickness (p < 0.001). TERT promoter mutation was independently associated with poorer overall survival in patients with non-acral cutaneous melanomas (median survival 80 months vs 291 months for wild-type; hazard ratio corrected for other covariates 2.47; 95% CI 1.29–4.74; p = 0.006). Conclusions: UV-induced TERT promoter mutations are one of the most frequent genetic alterations present in melanoma, with frequencies varying according to melanoma subtype. In non-acral cutaneous melanomas, presence of TERT promoter mutations is an independent marker of poor prognosis.

FV12 Allele frequencies of BRAFV600E mutations are not correlated with treatment outcome in 76 metastatic melanoma patients I. Satzger1; B. Timmermann2; C. Berking3; R. A. Herbst4; A. Kapp1; R. Gutzmer1 1 Medizinische Hochschule Hannover, Dermatologie, Hannover, Deutschland; 2Max-Planck-Institut Berlin, Berlin, Deutschland; 3 € t Mu€ nchen, Mu€ nchen, Ludwig-Maximilians-Universita Deutschland and; 4Helios Kliniken, Erfurt, Deutschland Background: The detection of BRAFV600 mutations is of high therapeutic relevance in metastatic melanoma. However, the clinical

relevance of the allele frequencies of BRAFV600 mutations in melanoma tissue remains unclear. Patients and Methods: Patients with metastatic melanoma harbouring a BRAFV600E mutation and undergoing therapy with a BRAF inhibitor were included. Allele frequencies of BRAFV600E mutations were analyzed by ultra deep next generation sequencing (NGS) in formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens obtained prior to therapy. Seventy-six metastatic melanoma patients treated with vemurafenib (n = 67) or dabrafenib (n = 9) were analyzed. The clinical response and survival outcome were assessed retrospectively and correlated with allele frequencies. Mean follow-up was 11.4 months. Results: Allele frequencies in pretreatment melanoma tissues were ≤5% in 2 patients, >5-10% in 4 patients, >10-15% in 3 patients, >15-20% in 11 patients, >20-25% in 6 patients, >25-50% in 33 patients, and >50% in 7 patients. Kaplan Meier analysis with different cut-off levels (≤15%, ≤18%, ≤20%, and ≤25%) showed no correlation between allele frequencies and progression-free survival nor overall survival. There was also no correlation with clinical response. Conclusions: Allele frequencies of BRAFV600E mutations in melanoma tissues do not predict therapeutic outcome of BRAF inhibitors.

FV13 Die Photooptoakustische Tomographie zur nicht invasiven und nicht radioaktiven Bestimmung des €chterlymphknotenstatus bei Schildwa Melanompatienten I. Stoffels; M. Gunzer; J. Leyh; U. Hillen; I. Helfrich; D. Schadendorf; J. Klode € tsklinikum Essen, Klinik fu€ r Dermatologie, Essen, Universita Deutschland Fragestellung: Der Status des Schildw€achterlymphknotens (SLN) ist der wichtigste Prognosefaktor f€ ur das Gesamt€ uberleben von Melanompatienten. Die SLN-Exstirpation (SLNE) erfolgt nach radioaktiver Markierung, die wegen Strahlenbelastung und weltweitem Mangel an 99mTc ein Problem ist. Auch ist es eine teure Operation mit hoher Morbidit€at und hoher Falsch-negativ-Rate. Die Photoakustische Tomographie (PAT) hat das Potential, den SLN mit dem Fluoreszenzfarbstoff Indocyaningr€ un (ICG) nicht radioaktiv zu detektieren und nicht-invasiv den SLN-Status zu bestimmen. Methode: Schildw€achterlymphknoten wurden ex vivo nach konventioneller SLNE in toto durch die PAT tomographiert und histologisch aufgearbeitet. Die Ergebnisse von PAT und Histologie wurden verglichen und digitalisiert, um in einem Mustererkennungsprozess Merkmale zu klassifizieren, die zwischen einer Metastase und einem unbefallenen SLN differenzieren. Anschließend wurden die Ergebnisse der ex vivo Tomographien translational in einer prospektiven Observationsstudie bei Melanompatienten in vivo angewandt (DRKS-ID: DRKS00005447): In dieser laufenden prospektiven Studie werden die SLN mittels ICG nicht radioaktiv markiert und durch die PAT detektiert. Anschließend wird der SLN-Status pr€aoperativ in vivo durch die PAT bestimmt. Diese Ergebnisse werden mit der postoperativen Histologie verglichen. Ergebnisse: Melaninintensit€at, Melaninfl€ache und -verteilungsmuster sowie die Organarchitektur des SLN wurden im Rahmen des Mustererkennungsprozess als Merkmale zur Differenzierung zwischen einer Metastase und einem unbefallenen SLN klassifiziert. 149 SLN wurden ex vivo durch die PAT tomographiert. Unter Anwendung der ermittelten klassifizierten Merkmale weist die PAT im Vergleich zur Histologie eine Sensitivit€at von 100%, eine Spezifit€at von 89.3% und eine falsch negative Rate von 0% auf. Diese ex vivo Ergebnisse konnten bisher im Rahmen der prospektiven Observationsstudie (bis dato n = 25 Patienten) in vivo best€atigt werden. Schlussfolgerung: Die hier dargestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass mit der PAT erstmalig eine nicht invasive und nicht radioaktive Methode zur Diagnostik des Schildw€achterlymphknotenstatus bei Melanompatienten zur Verf€ ugung stehen k€ onnte, die einem

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€ge 6 Freie Vortra Großteil der Patienten die SLNE als teure und invasive Operation ersparen w€ urde.

FV14 €chter-Lymphknoten-Exstirpation im KopfSchildwa Hals-Bereich bei kutanen Malignomen – prospektiv randomisierte Studie zur Evaluierung eines HybridTracers (Technetium und Indocyanin-Markierung) versus Technetium-Markierung I. Stoffels; J. Leyh; D. Schadendorf; J. Klode € tsklinikum Essen, Klinik fu€ r Dermatologie, Essen, Universita Deutschland Hintergrund: Die Sentinel-Lymphknoten-Exstirpation (SLNE) ist immer wieder Gegenstand kontroverser Diskussionen. Hierbei werden vor allem im Bereich der Kopf-Hals-Lymphknoten die hohe falsch-negativ Rate, eine potentiell h€ oherer Morbidit€at und die entstehenden Zusatzkosten angef€ uhrt. Der aktuelle Goldstandard zur Darstellung und gezielten Exstirpation des Sentinel-Lymophknotens (SLN) ist die pr€ aoperative Lymphabstromszintigraphie, die mittels des radioaktiven Tracers 99mTechnetium erfolgt. Erste Daten deuten darauf hin, dass durch Indocyaningr€ un (ICG)-Fluoreszenz m€ oglicherweise zus€ atzliche intraoperative Informationen bei der SLN Detektion gewonnen werden k€ onnen. Ein Hybrid-Tracer w€ urde die Vorteile der pr€ aoperativen Lymphabstromszintigraphie und SPECT/ CT mit einer intraoperativen Fluoreszenzbildgebung kombinieren. Patienten und Methodik: In dieser prospektiv randomisierten 2-armigen Studie wurde untersucht, welchen Einfluss die Markierungsform (99mTechnetium + Indocyaningr€ un vs. 99mTechnetium) auf die Detektionsrate der Sentinel-Lymphknoten im Kopf-Hals-Bereich und die Rate falsch negativer Sentinel-Lymphknoten hat. Hierf€ ur wurden 40 Patienten mit kutanen Malignomen, in die Studie eingeschlossen und in die beiden Arme randomisiert. Ergebnisse: Insgesamt 84 SLN wurden in 40 operativen Eingriffen entfernt. In der Hybrid-Tracer Kohorte konnte intraoperativ bei 100% (n = 20) der Patienten ein Sentinel-Lymphknoten identifiziert werden. Pr€ aoperativ konnte durch die Lymphabstromszintigraphie nur in 16 F€ allen (80%) ein SLN markiert werden. In der Kontrollkohorte konnte pr€ aoperativ in 18 F€allen (90%) ein SLN detektiert werden. In den 4 F€ allen (25%) der Hybrid-Tracer Kohorte wurden insgesamt 11 additive SLN nur durch den Einsatz der Fluoreszenzmarkierung exstirpiert. Ein metastatischer Lymphknotenbefall konnte in 5 von 20 Patienten (25%) nachgewiesen werden. Von den 11 additiven SLN waren 18% (n = 2) positiv. Diskussion: Die Ergebnisse zeigen, dass eine ICG-Fluoreszenzgef€ uhrte SLNE eine innovative bildgebende Technik in der chirurgischen Onkologie sein kann, die zuverl€assige zus€atzliche Informationen bei der Erkennung von SLN liefern kann. Daher k€ onnte eine SLNE mit einem Hybrid-Tracer eine attraktive Option sein. Durch die Kombination von pr€ aoperativer Bildgebung mittels SPECT/CT und intraoperativer Echtzeit-Lymphoszintigraphie kann die Detektionsrate von SLN bei kutanen Malignomen im Kopf-Hals-Bereich verbessert werden und die falsch-negative Rate gesenkt werden.

FV15 Targeted activation of RIG-I enhances melanoma immunogenicity and increases its T cell sensitivity independent of autocrine type I interferon signaling L. Spaan1; F. Zhao1; A. Sucker1; C. Coch2; G. Hartmann2; D. Schadendorf1; M. Trilling3; A. Paschen1 1 University Hospital Essen, Dermatology, Essen, Germany; 2 University of Bonn, Institute of Clinical Chemistry and Clinical Pharmacology, Bonn, Germany and; 3University Hospital Essen, Virology, Essen, Germany Metastatic melanoma is a highly aggressive and therapy-resistant tumor. Disease progression occurs in the presence of tumor-reactive

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cytotoxic T cells that recognize tumor cells by binding of their T cell receptor to specific major histocompatibility complex (MHC) class Iantigen surface complexes. The inefficiency of anti-tumor T cell responses can in part be explained by downregulation of MHC class I surface expression. Therefore therapies enhancing tumour immunogenicity are rational treatment strategies. One appealing strategy that recently emerged is the mimicry of viral infection. Viral nucleic acids are sensed by ubiquitously expressed pattern recognition receptors, including the RIG-I-like helicases (RLHs) RIG-I and MDA-5. Activation of these receptors by synthetic viral RNA mimetica has shown anticancer effects in different mouse tumor models. Peritumoral injection of RNA mimetica induced a cytotoxic inflammatory response in the tumor microenvironment and impaired tumor growth. In this study we show that transfection of melanoma cells with RIGI agonist 3pRNA directly affects melanoma immunogenicity. Besides production of type I IFN and induction of proinflammatory cytokines, we observed that 3pRNA treated melanoma cells upregulated expression of different components of the antigen processing and presenting machinery (APM). This led to an enhanced expression of HLA class I molecules on the tumor cells that in turn increased their recognition by autologous CD8+ T cells. Notably, APM upregulation was observed also in the absence of autocrine type I IFN signalling in JAK1- and STAT1-deficient melanoma cells. Our findings demonstrate that synthetic viral RNA mimetics effectively enhance melanoma immunogenicity, supporting their strong therapeutic potential.

FV16 Biglycan deposition in the melanoma microenvironment promotes invasiveness via increased, stiffness induced integrin-1b expression H. Andrlova1; J. Mastroianni1; J. Madl2; J. Kern3; K. Technau3; T. Brummer4; F. Meiß3; J. Duyster1; € mer2; R. Zeiser1 W. Ro 1 € matologie, Onkologie und Uniklinikum Freiburg, Ha Stammzelltransplantation, Freiburg, Deutschland; 2Bioss Centre for Biological Signalling Studies, Freiburg i. Br., Deutschland; 3Uniklinikum Freiburg, Dermatologie und €r Venerologie, Freiburg i. Br., Deutschland and; 4Institut fu Molekulare Medizin und Zellforschung, Freiburg i. Br., Deutschland Introduction: Metastatic malignant melanoma has a dismal prognosis despite novel molecular and immunotherapeutic approaches. A better understanding of the biology of melanoma microenvironment may help to develop new therapeutic strategies. The extracellular matrix molecule Biglycan (Bgn) expression has been linked to a poor prognosis in several cancer types but its functional role in the tumor micronenvironment remains unclear. Methods: To study the role of Bgn in melanoma, Bgn-/- and Bgn+/+ mice were injected with luciferase transgenic B16 melanoma cells. Tumor dissemination was monitored by bioluminescence imaging (BLI). To evaluate whether or not the reduced tumor growth observed in vivo was related to altered mechanical properties of the tumor microenvironment, contraction of collagen by fibroblasts derived from Bgn+/+ or Bgn-/- mice was quantified. Analysis of the matrix stiffness was performed by atomic force microscopy (AFM). Results: Melanoma growth and distant metastasis formation were reduced in Bgn-/- mice and these mice had a significantly improved survival compared to Bgn+/+ mice. An absence of biglycan in the collagen matrix led to delayed contraction, suggesting impaired fibroblast-mediated collagen cross-linking. AFM revealed a reduced stiffness of Bgn-/- fibroblast matrices compared to Bgn+/+ matrices. Furthermore, invasion of melanoma cells into the matrices contrived from Bgn-/- fibroblasts in an organotypic invasion assay was reduced compared to cells in the biglycan competent environment. Isolation of melanoma cells and fibroblasts from the stiffer Bgn+/+matrices revealed an increase in integrin-1b expression compared to the more elastic Bgn-/- fibroblast matrices.

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€ge 7 Freie Vortra Consistent with the studies in the mouse model, a high expression of Bgn was found in human melanoma tissue, but not in normal skin tissue. Bgn was expressed by tumor cells, as well as different stromal cells including fibroblasts, endothelial and immune cells. On a signalling level, Bgn stimulation induced ERK activation in melanoma cells, which is one of the most commonly activated pathways in cancer, contributing to cell motility and invasion regulation. Microarray analysis of melanoma cells after Bgn stimulation revealed upregulation of genes responsible for the tumor cell-extracellular matrix contact and invasiveness. Conclusion: This study describes a novel role for biglycan related to tissue stiffness and pathogenesis of melanoma progression in both mouse and human.

FV17 BRAF-, NRAS- und TERT-Mutationsstatus bei Patienten mit multiplen Melanomen

€ ger2; J. Haag2; F. Egberts1; A.-S. Bohne1; S. Kru € cken2; A. Hauschild1 J. Hedderich3; R. Rompel4; C. Ro 1 € tsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel, Klinik Universita € tsklinikum € r Dermatologie, Kiel, Deutschland; 2Universita fu Schleswig-Holstein, Campus Kiel, Institut fu€ r Pathologie, Kiel, € tsklinikum Schleswig-Holstein, Deutschland; 3Universita Campus Kiel, Institut fu€ r Medizinische Statistik und Informatik, Kiel, Deutschland and; 4Klinikum Kassel, Klinik fu€ r Dermatologie, Kassel, Deutschland Fragestellung: Zum jetzigen Zeitpunkt ist die Ursache f€ ur das Entstehen von mehreren kutanen malignen Melanomen (MM) bei einem Patienten nicht vollst€ andig gekl€art. Bis zu 7.4% der Patienten mit einem MM entwickeln ein metachrones Zweitmelanom, oder haben bereits bei Diagnosestellung zwei MM. In vorhergehenden Untersuchungen an kutanen Melanomen konnten distinkte pathogenetisch relevante Mutationen u.a. im BRAF-, NRAS- und/oder TERT-Gen identifiziert werden. Ziel dieser Untersuchung war es, den Mutationsstatus bei Patienten mit multiplen MM n€aher zu charakterisieren, um weitere R€ uckschl€ usse auf die Pathogenese zu ziehen und ggf. eine Risikoabsch€ atzung abzugeben. Methoden: Es wurden insgesamt 237 kutane MM von 96 Patienten mittels Pyrosequenzierung auf BRAF-, NRAS- und TERT-Mutationen untersucht. Ergebnisse: Bei 62% der Patienten wurden zwei MM untersucht, bei 21% drei MM und bei 27% ³4 MM. 25.4% der MM waren Melanoma in situ, 47.9% hatten eine Tumordicke von 4 mm. 44.7% der MM waren an den Extremit€ aten lokalisiert, 38.4% am Rumpf und 16.9% an Kopf/Hals. BRAF-Mutationen wurden in 35.4% aller MM gefunden, NRASMutationen in 13.9% und TERT-Mutationen in 47.3%. Das Mutationsmuster von BRAF-, NRAS- und TERT innerhalb der jeweiligen MM eines Patienten war in 24% der F€alle f€ ur alle drei Gene gleich, in 15% teilweise gleich und in 61% jeweils unterschiedlich. Es gab einen signifikanten Zusammenhang zwischen dem BRAF-Mutationsstatus und dem Alter der Patienten sowie der Tumordicke, dem histologischen Typ, dem Ulzerationsstatus und der Lokalisation der Prim€ artumoren, zwischen dem NRAS-Mutationsstatus und dem Alter, der Tumordicke und dem histologischen Typ, zwischen dem TERT-Mutationsstatus und dem Geschlecht sowie dem Alter der Patienten, der Tumordicke und dem Ulzerationsstatus sowie der Lokalisation der Prim€ artumoren. Die mediane Nachbeobachtungszeit betrug 47.6 Monate. Im Beobachtungszeitraum waren 17 Patienten verstorben (17.7%), das mittlere Gesamt€ uberleben betrug 185 Monate 15.2 Monate (155–215). Ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem BRAF-, NRAS- oder TERT-Mutationsstatus und dem € Uberleben wurde nicht gefunden. Schlussfolgerung: Die BRAF-, NRAS- und TERT-Mutationsmuster bei Patienten mit mehreren Melanomen zeigten signifikante Zusammenh€ ange mit klinischen Patienten- und histologischen Prim€artumor-

Charakteristika. Die Mutationen per se stellten jedoch keinen prog€ nostischen Faktor f€ ur das Uberleben dar. Literatur: Horn S et al. TERT promoter mutations in familial and sporadic melanoma. Science 2013;339:959-961. Long GV et al. Prognostic and clinicopathologic associations of oncogenic BRAF in metastatic melanoma. J Clin Oncol 2011;29:1239-1246.

FV18 MSX1 reprograms melanocytes towards a neural crest-like state and promotes the progression of melanoma M. V. Heppt1,2; J. X. Wang2; D. M. Hristova2; Z. Wei3; C. Berking1; R. Besch1; F. J. Rauscher4; D. E. Fisher5; M. Herlyn2; M. Fukunaga-Kalabis2 1 € t Mu€ nchen, Klinik und Poliklinik fu€ r Klinikum der Universita Dermatologie und Allergologie, Mu€ nchen, Deutschland; 2The Wistar Institute, Melanoma Research Center, Philadelphia, USA; 3New Jersey Institute of Technology, Department of Computer Science, Newark, USA; 4The Wistar Institute, Cancer Center, Philadelphia, USA and; 5Massachusetts General Hospital, Cutaneous Biology Research Center, Boston, USA Question: Melanoma is a deadly type of skin cancer that derives from melanocytes. Advanced melanoma often undergoes a dedifferentiation process and acquires a phenotype akin to neural crest-like stem cells. In the present study, we demonstrate the potential of the neural crest homeodomain transcription factor Msh homeobox 1 (MSX1) to dedifferentiate melanocytes towards a stem cell-like population and to promote the progression of melanoma. Materials and Methods: We analyzed expression of MSX1 in primary cells, melanoma cell lines and patient-derived tumor samples. We applied gain-of-function (cDNA overexpression) and loss-offunction (RNAi) experiments to investigate the function of MSX1 in melanocyte and melanoma biology in vitro and in vivo. Results: Ectopic expression of MSX1 in melanocytes increased cell migration, led to a dramatic decrease of pigmentation and shifted the expression of adhesion molecules from E-Cadherin to Neural Cell Adhesion Molecule (NCAM). Strikingly, MSX1-expressing melanocytes expressed the neural crest marker p75 neurotrophin receptor and were able to differentiate into neuronal and mesenchymal lineages. Mechanistically, we provide evidence that MSX1 binds and suppresses the proximal promoter of microphthalmia-associated transcription factor (MITF), the master transcriptional regulator of melanogenesis. In melanoma, MSX1 was broadly expressed in a panel of melanoma cell lines and patient-derived tumor samples and correlated with disease progression. Overexpression of MSX1 increased cell motility whereas depletion of MSX1 inhibited melanoma migration in vitro. Furthermore, the loss of MSX1 strongly decreased the metastatic capacity of melanoma cells in vivo. Conclusions: We identified a novel factor with the potential to reprogram melanocytes to a precursor-like state and show that similar dedifferentiation contributes to progression and metastasis of melanoma.

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€ge 8 Freie Vortra FV19 A genetic variant in the gene coding for RAGE independently predicts progression-free survival of melanoma patients N. Wagner1,2; M. Reith1,2; K. Tarnanidis1,2; J. Ridinger1,2; V. Umansky1,2; J. Utikal1,2; C. Gebhardt1,2 1 Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg (DKFZ), Klinische Kooperationseinheit Dermatoonkologie, Heidelberg, € tsmedizin Mannheim der Deutschland and; 2Universita € t Heidelberg, Klinik fu€ r Dermatologie, Mannheim, Universita Deutschland Purpose: The receptor for advanced glycation end-products (RAGE) is a central driver of tumorigenesis by sustaining an inflammatory tumor microenvironment. Single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in the gene coding for RAGE (AGER locus) have been described as a factor amplifying inflammation in susceptible patients. Some of these SNPs have been reported to be implicated with inflammatory diseases like rheumatoid arthritis or Crohn’s disease as well as in cancers such as breast and non-small cell lung cancer. This study investigated whether the SNPs G82S (rs2070600), -374T/A (rs1800624), and -429T/C (rs1800625) are associated with impaired or increased progression-free survival (PFS) of melanoma patients. Patients and methods: The selected SNPs in the RAGE gene were analyzed in 173 stage I-IV melanoma patients. Genomic DNA was harvested from EDTA blood samples and genotyping was performed using RFLP method. Mean follow-up was 11.2  7.2 months. Results: Multivariate Cox regression analysis including the three SNPs, and the stage of disease revealed a significant interaction between the -374T/A and the -429T/C polymorphism. The -374T/A polymorphism was found to be a strong independent predictor of PFS. The T/A or A/A genotype was associated with a three times better PFS (HR 0.31 [95% CI 0.16-0.58], P = 0.0002). The G82S and -429T/C polymorphisms also correlated with increased PFS. Loco-regional metastasis (stage III) and, more pronounced, distant metastasis (stage IV) correlated with diminished PFS. Moreover, the interaction between the -374T/A and the -429T/C polymorphism was significantly associated with impaired survival (HR 5.16 [1.6116.58], P = 0.006). Conclusion: RAGE polymorphism -374T/A could be identified as an independent prognostic factor for progression-free survival in highrisk melanoma patients. Further evaluation of genetic variants in the AGER locus will be required to clarify the role of RAGE and its regulation in malignant melanoma.

FV20 Enhanced MHC class I molecule expression on Merkel cell carcinoma by HDAC inhibitors C. Ritter1; D. Schrama1; R. Houben2; J. C. Becker3 1 Medical University of Graz, Dermatology, Graz, Austria; 2 University Hospital Wu€ rzburg, Dermatology, Wu€ rzburg, Germany and; 3German Consortium for Translational Cancer Research (DKTK), West German Tumor Centre, University Hospital Essen, Germany Einleitung: Merkel cell carcinoma (MCC) is strongly associated with the Merkel cell polyomavirus (MCPyV) in most patients. Despite the expression of MCPyV derived viral antigens, advanced MCC escapes immune responses. Cytotoxic T cells only recognize processed viral antigens in the context of MHC class I molecules. Indeed, loss of MHC class I expression is a common immune escape mechanism of transformed and/or virus infected cells. Methoden: In situ expression of MHC class I and MCPyV large T antigen was evaluated in 57 paraffin embedded MCC tumors of 41 patients by immunohistochemistry. MCPyV DNA was detected by PCR. MHC class I expression of six MCPyV+ MCC cell lines was determined by immunoblot and flow cytometry, either without or after treatment with epigenetic modifiers (vorinostat, mithramycin

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A). Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay was performed to determine histone acetylation at the MHC class I promoter region. A flow cytometry based cytotoxicity assay, with lymphokine activated killer (LAK) cells was performed with or without an MHC class I blocking antibody. Finally, the effect of epigenetic modifiers on MHC class I expression was tested in vivo in a preclinical xenotransplantation model. Ergebnisse: MHC class I molecules were not or only weakly expressed in 75% of MCC tumors and their expression was significantly lower in MCPyV+ compared to MCPyV- MCC tumors (p = 0.003). Similarly, only two out of six MCPyV+ MCC cell lines expressed high levels of MHC class I molecules. Treatment of MCC cell lines with the HDAC inhibitor vorinostat in combination with mithramycin A increased histone acetylation at the MHC class I promoter region, resulting in a significantly increased MHC class I expression (p < 0.05). Vorinostat and mithramycin A displayed synergistic effects. Notably, increased MHC class I expression allowed an increased LAK-cell mediated lysis of MCC cells. This effect was fully blocked with a MHC class I blocking antibody. Treatment of mice bearing xenotransplanted MCC tumors with the combination of vorinostat and mithrmaycin A induced an increased MHC class I expression in vivo. Schlussfolgerungen: MHC class I down-regulation is a common immune escape mechanism in MCC. MCPyV+ tumors express particularly low levels of MHC class I molecules to prevent viral antigen presentation. Here, we report an efficient way to increase MHC class I surface expression on MCPyV+ MCC cells in vitro and in vivo by combinatory treatment with two FDA approved epigenetic modifiers, i.e. vorinostat and mithramycin A. Increasing MHC class I expression and thus viral antigen presentation appears as an attractive strategy to boost immune therapeutic approaches for MCCs, such as checkpoint blocking antibodies.

FV21 Ectopic expression and secretion of miR-375 in MCC: Impact on the tumor microenvironment K. Fan1; C. Ritter1; A. Theiler1; R. Houben2; D. Schrama1; J. C. Becker3 1 Medical University of Graz, Graz, Austria; 2University of Wu€ zburg, Dermatology, Wu€ zburg, Germany and; 3German Consortium for Translational Cancer Research (DKTK), West German Tumor Centre, University Hospital Essen, Germany Background: Merkel cell carcinoma (MCC) is an aggressive neuroendocrine (NE) carcinoma of the skin; despite the recent demonstration of viral association, its cancerogenesis is still only partly understood. miRNAs are small, non-coding RNAs involved in post-transcriptional regulation of gene expression. Here, we scrutinized the role of miRNA in MCCs focusing on miR-375, which was found to be the most abundant mRNA in MCC. ATOH1 belongs to the basic helixloop-helix (BHLH) family of transcription factors and is required for formation of Merkel cells in the skin. Notably, the master regulator of pulmonary NE cell development, the BHLH protein ASH1 induces the expression of miR-375 in lung cancers with NE features. Method: Taqman MicroRNA AssayTM was used to detect miR-375 in MCC cell lines and MCC tissue, snRNA U6 was used as endogenous control. ATOH1 was expressed in MCC13 cells through pcDNA3.1-mCherry plasmids transfection, and anti-mCherry was used to detect ATOH1 protein by western blot. E-box transcriptional activity was determined by luciferase assay. Co-culture experiments were performed either directly or in transwell inserts. mRNA levels of a-SMA, IL-1beta and CXCL2 were measured by qPCR. MCC xenotransplants were generated by intradermal injection of WaGa cells mixed with matrix gel into SCID/NOD mice. Result: High expression of miR-375 was demonstrated in 56 MCC tissue samples and 6 classical MCC cell lines, while in 3 variant MCC cell lines, miR-375 expression was found to be low. A positive correlation between ATOH1 and miR-375 expression was observed. E-box transcriptional activity and expression of miR-375 were

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€ge 9 Freie Vortra induced after ectopic ATOH1 expression in the ATOH1 negative variant MCC cell line MCC13. Notably, miRNA-375 was enriched in tumor-derived exosomes and could be detected in culture medium of classical MCC cells and Coculture experiments revealed that miR-375 was transferred from MCC cells to fibroblasts (MRC-5). Indeed, the morphology of MRC-5 changed after co-culture and cancer associated fibroblasts (CAF) markers, such as a-SMA, IL-1beta and CXCL2, were upregulated. Accordingly, a-SMA was upregulated in the stromal cells of xenotransplanted MCC tumors as compared to normal murine skin. Conclusion: MiR-375 is upregulated in MCC cells via ATOH1. Albeit miR-375 is regarded as tumor suppressor, secreted miR-375 changes the tumor microenvironment towards a tumor promoting state by induction of a CAF phenotype.

FV22 Einfluss der Podoplanin Expression in kutanen Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereiches auf die lymphogene Metastasierung und die Prognose M. Scheer1; U. Drebber2; A. Krakowezki3; C. Mauch4; € ller3; M. Kreppel3 J. E. Zo 1 Johannes-Wesling Klinikum Minden, Klinik fu€ r Mund-, Kiefer€ t zu und Gesichtschirurgie, Minden, Deutschland; 2Universita € t zu Ko€ ln, Institut fu€ r Pathologie, Ko€ ln, Deutschland; 3Universita Ko€ ln, Mund-, Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie, Ko€ ln, € t zu Ko€ ln, Klinik fu€ r Dermatologie, Deutschland and; 4Universita Ko€ ln, Deutschland Einleitung: Plattenepithelkarzinom der Haut im Kopf-Hals-Bereich geh€ oren zu den h€ aufigsten Kreberkrankungen weltweit. Obwohl die meisten Patienten mittels lokaler Behandlung geheilt werden k€ onnen, entwickeln eine Reihe von Patienten region€are Lymphknotenmetastasen. Verschiedene Studien an verschiedenen soliden Tumoren (z. B. Plattenpithelkarzinomen der Mundh€ ohle) konnten nachweisen, dass Podoplanin, ein transmembran€ oses Glykoprotein, mit der lymphogenen Dissemination assoziiert ist. Fragestellung: Das Ziel der vorliegenden, retrospektiven Untersuchung war es, den Einfluss der Expression von Podoplanin im Prim€artumor mit dem Auftreten von zervikalen Lymphknotenmetastasen, lokoregion€ aren Rezidiven und der Prognose der Patienten assoziiert ist. Methoden: In die vorliegende Untersuchung wurden Patienten und Material von 63 prim€aren Plattenepithelkarzinomen des KopfHals-Bereiches eingeschlossen. Die mittels Immunhistochemie bestimmte, semiquantitative Expression von Podoplanin wurde mit klinisch-pathologischen Parametern verglichen, sowie der Einfluss auf das Gesamt€ uberleben (OS) und die lokoregion€are Kontrolle (LRC) in uni- und multivariatere Analyse untersucht. Ergebnisse: Insgesamt konnte eine Podoplanin Expression bei 40 von 63 Patienten (63.5%) in den Prim€artumoren nachgewiesen werden. Mittels des v2 -Test konnte eine positive Assoziation mit der Anzahl der befallenen zervikalen Lymphknoten und dem lokoregion€aren Versagen (p Schlussfolgerungen: Podoplanin l€asst sich h€aufig in Plattenepithelkarzinomen der der Haut nachweisen und hat pr€adiktive Eigenschaften im Hinblick auf eine lymphogene Metastasierung, lokoregion€ are Kontrolle und Gesamt€ uberleben.

FV23 Abheilung von In-Transit-Metastasen eines Merkelzellkarzinoms unter lokaler und systemischer Immuntherapie € bben; R. Wahl A. Ru Uniklinik RWTH Aachen, Hautklinik, Aachen, Deutschland

Die prim€ are Therapie des Merkelzellkarzinoms besteht aus Resektion des Tumors und seiner Metastasen mit fakultativer Bestrahlung. F€ ur

eine Behandlung des nicht mehr operablen bzw. nicht mehr bestrahlbaren Merkelzellkarzinoms und seiner Metastasen liegen jedoch keine evidenzbasierten Empfehlungen vor. Auf Grund der viralen Genese des Merkelzellkarzinoms k€ onnte die Erkrankung prinzipiell einer Immuntherapie zug€anglich sein. Wir m€ ochten u € ber eine bei Erstvorstellung 90-j€ahrige Patientin berichten, die am rechtsseitigen Nasenabhang ein Merkelzellkarzinom entwickelt hatte, das zun€achst nach Teilexzision nur mit Bestrahlung behandelt werden konnte. Nach 5 Monaten entwickelte sie suborbital rechts eine Satellitenmetastase, die operativ entfernt wurde. Nach zwei Jahren traten multiple kutane In-Transitmetastasen an der rechten Gesichtsh€alfte sowie eine kutane Metastase am linken Augenoberlid auf. Bei Vorbestrahlung der Region war eine Strahlentherapie nicht durchf€ uhrbar und eine großfl€achige operative Sanierung konnte auf Grund des Alters und der kardialen Vorerkrankungen nicht erfolgen. Daraufhin wurde eine kombinierte lokale Immuntherapie mit Imiquimod-Creme 3x/Woche und intral€asionalen Injektionen mit Interferon-a2a 1-2 Mio. IE 1/Woche begonnen, worunter eine Verkleinerung der unterspritzten Metastasen, aber keine vollst€andige Abheilung beobachtet wurde. Wir entschieden uns nach zwei Monaten f€ ur die zus€atzliche Gabe von pegyliertem Interferon-a-2b, initial 30 lg s.c.1x/Woche und dann Erh€ ohung der Dosierung auf 50 lg/ Woche. Nach weiteren zwei Monaten Behandlung heilten alle kutanen Metastasen ab. Eine schon vor Behandlungsbeginn darstellbare Lymphknotenmetastase linksseitig submandibul€ar wurde zus€atzlich operativ saniert. Die Patientin ist nunmehr 12 Monate nach Beginn der immunologischen Therapie Metastasen-frei, wobei die systemische Interferongabe auf 20 lg/Woche reduziert wurde und lokal weiterhin Imiquimod Creme angewendet wird. Dieser Fallbericht zeigt, dass das Merkelzellkarzinom auf eine Immuntherapie ansprechen kann, wobei sich bei unserer Patientin eine vollst€andige Remission erst nach 4 Monaten Behandlung darstellte.

FV24 Prognostische Bedeutung der (Lymph-)Angiogenese beim Merkelzellkarzinom F. Nielen1; A. Bob2; J. Krediet2; J. Schmitter2; D. Terhorst2; Y. Gudlowski3; J. Kanitakis2; E. Stockfleth2; W. Sterry2; A. Hauschild1; M. Weichenthal1; F. Egberts1; B. Lange-Asschenfeldt2 1 € tsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel, Klinik Universita € r Dermatologie, Kiel, Deutschland; 2Charite fu € tsmedizin Berlin, Klinik Fu€ r Dermatologie, Berlin, Universita € tsmedizin Berlin, Klinik Deutschland and; 3Charite Universita € r Psychiatrie, Berlin, Deutschland fu Fragestellung: Beim Merkelzell-Karzinom (MCC) handelt es sich um einen aggressiven neuroendokrinen Tumor der Haut mit einem ausgepr€agten infiltrativen Wachstum und einer raschen Metastasierung in die regionalen Lymphknoten und viszerale Organe. Die Inzidenz des MCC zeigte in den letzten Jahren einen starken Anstieg, insbesondere bei Patienten mit immunsuppressiver Therapie. W€ahrend die (Lymph–)Angiogenese im Prim€artumor bei anderen kutanen Tumoren wie dem malignen Melanom einen bekannten Prognoseparameter darstellt, ist deren prognostische Relevanz beim MCC noch unklar. Das Ziel der Untersuchung war es, die Tumorvaskularisierung in MCC im Hinblick auf deren prognostische Signifikanz zu evaluieren. Methoden: Es wurden von insgesamt 46 Patienten mit MCC klinische und histologische sowie die Daten zum Follow-up erhoben. Die Prim€artumoren dieser Patienten wurden histologisch klassifiziert und immunhistochemisch mit einem Lymphgef€aß- (D2-40) sowie einem allgemeinen Gef€aßmarker (CD 31) gef€arbt. Anschließend erfolgte die Auswertung mittels computergest€ utzter morphometrischer Bildanalyse. Die Ergebnisse wurden mit klinischen und histologischen Parametern sowie dem Krankheitsverlauf der Patienten unter Ber€ ucksichtigung anderer prognostischer Variablen korreliert.

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€ge 10 Freie Vortra Ergebnisse: Insgesamt kamen 28 weibliche und 18 m€annliche Patienten zur Auswertung. In der multivariaten Analyse des rezi€ divfreien Uberlebens stellten das Geschlecht (Hazard-Ratio [HR] 8.2; 95%-Konfidenzintervall [CI] 1.6–41.8), Ulzeration des Prim€ artumors (HR 7.0; 95%-CI 1.1–44.5) sowie der Anteil CD31positiver Zellen (HR 6.5; 95%-CI 1.3–32.0) signifikante prognostische Faktoren dar. Schlussfolgerung: Das MCC stellt aufgrund seiner schlechten Prognose nach wie vor eine therapeutische Herausforderung dar. In der vorliegenden Studie konnte ein wesentlicher Parameter f€ ur eine erh€ ohte Angiogeneserate in Prim€artumoren als signifikanter Prog€ nosefaktor f€ ur das progressionsfreie Uberleben bei Patienten mit MCC identifiziert werden. Die m€ oglichen diagnostischen und therapeutischen Implikationen werden diskutiert.

FV25 Routine amplicon sequencing for mutation screens in melanoma S. Horn; M. Stiller; A. Sucker; K. Griewank; D. Schadendorf University Hospital Essen, Department of Dermatology Essen, Deutschland The application of targeted high-throughput sequencing enables us to perform genetic testing on a new scale. Using this technology we can comprehensively evaluate the status of clinically relevant gene

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mutations in melanoma patients and make best suited therapeutic decisions accordingly. Via amplicon sequencing we simultaneously obtain data on numerous genetic loci dispersed over the genome for each individual patient. Amplification and library preparation protocols are routinely performed applying 20 ng of DNA isolated from standard FFPE samples. This technology has enabled us to improve the quality of our genetic testing. In addition to covering more genes, we can reproducibly detect mutations at much lower frequencies than by conventional Sanger sequencing. This is particularly helpful for samples with considerable amounts of normal tissue contamination or heterogeneous samples. Reducing the threshold for mutation detection to a minimum is vital to avoid missing clinically relevant mutations where affected patients could benefit from targeted therapies. Here we report sequencing results from different panels of genes. On the one hand we applied a commercial panel designed to screen the coding regions of 20 genes. On the other hand we developed a custom gene panel to target sets of mutations that are frequent in melanoma, both in coding and non-coding regions. We report data on coverage and mutations detected in more than 50 samples processed for establishing these protocols. Details on data analysis comprising information on commercial software used, open source software and high performance computing are provided. Issues of data storage are discussed as well. In the near future, we aim at establishing a more comprehensive custom amplicon panel to further improve the routine genetic diagnosis in melanoma patient care.

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