Biologie au quotidien Ann Biol Clin 2014 ; 72 (1) : 124-8
La bilirubine interfère-t-elle sur l’électrophorèse capillaire des protéines sériques ?
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Downloaded by an anonymous user on 01/01/2017.
Does bilirubin interfere with capillary electrophoresis of serum proteins? Ilhem Hellara Ons Fekih Sonia Triki Ahlem Elmay Fadoua Neffati Mohamed Fadhel Najjar Laboratoire de biochimie-toxicologie, CHU Fattouma Bourguiba, Monastir, Tunisie
Résumé. L’électrophorèse capillaire des protéines sériques est une technique rapide, fiable et simple, mais sujette à plusieurs interférences. L’objectif de notre travail est d’étudier l’interférence de la bilirubine sur cette technique ; 70 sérums ictériques ont été analysés sur l’automate Capillarys TM (Sebia). Une deuxième électrophorèse a été réalisée sur 40 échantillons après photodégradation de la bilirubine. Le dosage de la bilirubine et des protides a été fait, respectivement, par la méthode de Jendrassik et Grof et la méthode au biuret sur l’automate Konélab 20i TM (Thermo Electron Corporation). Nous avons constaté un étalement anormal de la fraction de l’albumine du côté anodique constituant parfois une fraction distincte dans la zone de migration habituelle de la pré-albumine. Cette fraction varie de 2,0 ± 2,0 % (0,0 à 7,3 %) soit de 0,98 ± 1,53 g/L (0 à 5,3 g/L) et elle semble être en relation avec la bilirubine directe, puisque suite à la surcharge des sérums par une solution de bilirubine, aucune fraction supplémentaire n’a été retrouvée. Une diminution moyenne de la bilirubine après photodégradation de 58 ± 17 % (26 à 89 %) est suivie d’une diminution du même ordre 64 ± 38 % (10 à 100 %) de la fraction supplémentaire. L’électrophorèse sur acétate de cellulose des mêmes échantillons n’a montré aucune variation. Les fortes concentrations de bilirubine semblent modifier légèrement le tracé électrophorétique. Toutefois, l’impact de ces interférences sur l’interprétation des profils électrophorétiques reste limité. Mots clés : électrophorèse capillaire, protéines, bilirubine, interférence
ˆ 2013, Article rec¸u le 14 aout ˆ 2013 accepte´ le 30 aout
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Key words: capillary electrophoresis, proteins, bilirubin, interference
Pour citer cet article : Hellara I, Fekih O, Triki S, Elmay A, Neffati F, Najjar MF. La bilirubine interfère-t-elle sur l’électrophorèse capillaire des protéines sériques ? Ann Biol Clin 2014 ; 72(1) : 124-8 doi:10.1684/abc.2013.0926
doi:10.1684/abc.2013.0926
Abstract. Capillary electrophoresis of serum proteins is a fast, reliable and simple technique, but many interference exist. The objective of our work is to study the interference of bilirubin on this technique; 70 icteric sera were analysed on Capillarys TM (Sebia). A second electrophoresis was performed on 40 samples after bilirubin photodegradation. The bilirubin and serum proteins were determinated respectively by Jendrassik and Grof and biuret methods on Konélab 20i TM (Thermo Electron Corporation). We found abnormal spreading of the albumin fraction of the anode side wich constitute sometimes an isolated fraction in the traditional area of pre-albumin migration. This fraction varies from 2.0 ± 2.0% (0.0 to 7.3%) or 0.98 ± 1.53 g/L (0 to 5.3 g/L) and it seems to be related to the direct bilirubin since, following overloading sera with a solution of bilirubin, no further fraction was recovered. An average decrease of bilirubin after photodegradation of 58 ± 17% (26-89%) is followed by a decrease in the same order 64 ± 38% (10-100%) of the additional fraction. Acetate cellulose electrophoresis of the same samples showed no variation. The high bilirubin levels seem modify slightly the electrophoretic profile. However the impact of the interference on the interpretation of electrophoretic trace is negligible.
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Bilirubine et électrophorèse capillaire des protéines
Le principe de l’électrophorèse des protéines sériques est connu depuis les années 1930, il met en jeu le déplacement des protéines ionisées lorsqu’elles sont soumises à un champ électrique et dans des conditions définies de force ionique, de pH, de durée et d’intensité de courant électrique appliqué. Il a été adapté en biologie clinique dans les années 1940 par des méthodes manuelles utilisant comme support l’acétate de cellulose, puis par l’utilisation de gel d’agarose, de gel de polyacrylamide, et ultérieurement par l’automatisation de l’électrophorèse sur ce dernier gel [1-3]. L’évolution vers l’électrophorèse capillaire, apparue en 1994, a permis un rendu plus rapide des résultats avec une meilleure reproductibilité, simplicité, performance, standardisation et trac¸abilité [4]. Cependant, certaines interférences peuvent apparaître, causées par des substances qui absorbent à 200 nm comme le fibrinogène ou certains antibiotiques ou certains médicaments tels que l’ioméprol [5]. D’autres substances modifient le profil électrophorétique par leur capacité de fixation sur l’albumine, telles que la bilirubine. L’objectif de notre travail est d’étudier l’interférence de la bilirubine sur l’électrophorèse capillaire des protéines sériques, afin de repérer éventuellement le niveau de migration de cette substance et d’évaluer l’impact des sérums ictériques sur le profil électrophorétique.
Matériels et méthodes Matériels Soixante-dix sérums ictériques ont été collectés à partir des échantillons adressés au laboratoire de biochimietoxicologie du CHU de Monastir. Tous les sérums, obtenus après centrifugation de 15 min à 2000 g, ont été conservés à + 4 ◦ C et à l’obscurité. Les échantillons ont été analysés dans la même série. Simultanément, une détermination des concentrations des bilirubines totale et directe par méthode de Jendrassik et Grof et des protidémies par méthode au biuret sont réalisées sur Konélab 20i (Thermo Electron Corporation). Une électrophorèse sur acétate de cellulose est effectuée sur les mêmes échantillons avant le traitement de dégradation de la bilirubine. Parmi les 70 échantillons, 40 ont subi l’un des deux procédés de photodégradation de la bilirubine. Une deuxième électrophorèse capillaire a été pratiquée sur les sérums traités, ainsi qu’un dosage des bilirubines totales et directes réalisé le même jour que l’électrophorèse. Une surcharge en bilirubine (Bilirubine Fluka® Réf : 14370) jusqu’à une concentration de 400 mol/L d’un sérum de contrôle a été réalisée. Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 1, janvier-février 2014
Méthodes L’électrophorèse capillaire des protéines sériques a été réalisée sur automate CapillarysTM (Sebia), multitâches et muni de huit capillaires permettant d’effectuer huit séparations électrophorétiques simultanées sans manipulation et à une cadence élevée. Le CapillarysTM est équipé d’un système de lecture code à barres des tubes de prélèvements permettant l’identification des échantillons, leur dilution s’effectue dans des barrettes de dilution à usage unique. Il réalise le lavage des capillaires par nettoyage circulaire à forte pression par différentes solutions présentes dans le compartiment réactifs. L’injection des échantillons dans les capillaires s’effectue par la mise en contact d’une extrémité des capillaires avec les échantillons dilués, puis aspiration à l’intérieur de chaque capillaire d’un très faible volume d’échantillon dilué. La migration s’effectue à température constante à l’aide d’un système à effet Peltier. La détection des fractions séparées se fait par spectrophotométrie d’absorption moléculaire et à l’aide d’un système de détection en UV. Le logiciel « Phoresis TM » incorporé dans le CapillarysTM permet le traitement des résultats, l’affichage de l’état de fonctionnement de l’automate et les résultats des analyses en cours. L’électrophorèse des protéines sériques sur acétate de cellulose comporte une migration en fonction de leur charge électrique de la cathode vers l’anode dans un milieu alcalin (tampon Tris, pH = 8,6) et sur acétate de cellulose. Les protéines ainsi séparées sont ensuite colorées par le rouge ponceau S, puis une déshydratation par le méthanol et enfin une transparisation par une solution d’éclaircissement (diacétone alcool) ont été réalisées. Le traitement des échantillons pour diminuer les concentrations de bilirubine a été réalisé par deux protocoles : - exposition des échantillons pendant une à deux heures quotidiennement et durant une semaine à la lumière du jour ; - exposition des échantillons deux heures à la lumière UV. L’analyse statistique a été faite par le logiciel Excel 2007. Le test t de Student a été utilisé pour la comparaison des moyennes, un seuil de signification (p < 0,05) a été retenu.
Résultats Les sérums collectés dans notre étude couvraient un intervalle large de bilirubine directe et totale, allant respectivement de 6 à 398 mol/L et de 21 à 438 mol/L. Les différents profils électrophorétiques des sérums ictériques n’ont pas montré d’anomalies évidentes telles que le dédoublement de l’albumine ou des différentes globulines, l’apparition d’une fraction supplémentaire ou la disparition d’une fraction normale. 125
Biologie au quotidien
A/G
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Fractions Albumine Alpha 1 Alpha 2 Beta 1 Beta 2 Gamma
%
0,80
Protides :
Normales %
44,4 6,3 11,7 7,9 7,6 22,1
< >
55,8-66,1 2,9-4,9 7,1-11,8 4,7-7,2 3,2-6,5 11,1-18,8
> > >
g/L
Normales g/L 40,2-47,6 2,1-3,5 5,1-8,5 3,4-5,2 2,3-4,7 8,0-13,5
Figure 1. Étalement de la fraction albumine pour une bilirubinémie de 218,2 mol/L.
A/G
Fractions
%
Albumine Alpha 1 Alpha 2 Beta 1 Beta 2 Gamma
47,1 4,6 5,9 4,7 21,6 16,1
0,89
Protides :
Normales % < < >
55,8-66,1 2,9-4,9 7,1-11,8 4,7-7,2 3,2-6,5 11,1-18,8
g/L
Normales g/L 40,2-47,6 2,1-3,5 5,1-8,5 3,4-5,2 2,3-4,7 8,0-13,5
Figure 2. Fraction à séparation plus tardive que l’albumine pour bilirubinémie supérieure à 400 mol/L.
Nous avons constaté l’étalement anormal de la fraction de l’albumine du côté anodique (figure 1) constituant parfois une fraction distincte dans la zone de migration habituelle sur gel de la pré-albumine (figure 2). Cette fraction varie de 2 ± 2 % (0 à 7,3 %) soit de 0,98 ± 1,53 g/L (0 à 5,3 g/L). La bilirubine étant un pigment photosensible, nous avons essayé de diminuer sa concentration dans les sérums étudiés par exposition à la lumière du jour ou à la lumière ultraviolette. Toutes les concentrations de bilirubine ont baissé. Cette diminution était suivie également par une baisse de la fraction supplémentaire et pour certains échantillons, la disparition complète de cette fraction a été notée. Une diminution moyenne de la bilirubine totale de 58 ± 17 % (26 à 89 %) est suivie d’une diminution du même ordre, 64 ± 38 % (10 à 100 %) de la fraction supplémentaire (fraction X). La corrélation bivariée entre les bilirubinémies et les fractions supplémentaires n’était pas informative. L’étude de 126
la corrélation entre les deux paramètres par intervalle de bilirubine s’est montrée bonne avec un r = 0,97 pour la bilirubine totale (figure 3) et r = 0,98 pour la bilirubine directe (figure 4). La figure 3 montre que pour une concentration de bilirubine de 100 mol/L, l’albumine n’est majorée que de 2 % (Y = [0,018 × 100] + 0,22 = 2,03 %). Cette fraction supplémentaire semble être en relation avec la bilirubine directe puisque suite à la surcharge des sérums par une solution de bilirubine jusqu’à 400 mol/L, aucune fraction supplémentaire n’a été retrouvée. La réalisation d’une électrophorèse sur acétate de cellulose des mêmes échantillons n’a pas montré de variations, ni sur le gel, ni sur le profil après lecture densitométrique.
Discussion L’électrophorèse capillaire des protéines sériques est une technique d’application récente. Elle est en train de gagner du terrain par rapport aux techniques sur gel, de par sa meilleure reproductibilité, sa rapidité et sa simplicité d’utilisation. Les automates basés sur le principe de l’électrophorèse capillaire semblent bien répondre aux attentes des biologistes, qui souhaitent avoir des résultats fiables et reproductibles et manipuler des automates simples, et conviviaux. Ils répondent aussi aux attentes des cliniciens qui souhaitent avoir un résultat rapide et accompagné d’une interprétation fiable. Le domaine des interférences est en partie étudié par le fabricant qui signale les interférences possibles de l’aspect du sérum, des médicaments. . . Mais, d’autres interférences ne sont pas bien documentées telles que l’interférence de la bilirubine, dont la fraction libre ou liée à l’albumine absorbe à 280 nm [6]. Une étude réalisée par Crivellente et al. [7] sur des sérums de rats a montré que l’électrophorèse capillaire constitue même une bonne alternative de dosage de la bilirubine. Les échantillons utilisés ont été sélectionnés de fac¸on à couvrir un intervalle assez large de bilirubinémie de 21 à 438 mol/L. Aucun sérum analysé sur CapillarysTM n’a montré d’anomalies électrophorétiques évidentes comme le dédoublement dans l’une des zones, l’apparition d’une zone supplémentaire. . . L’analyse plus fine des tracés électrophorétiques a mis en évidence l’étalement anormal de la zone d’albumine du côté anodique, voire l’apparition d’une fraction supplémentaire dans la zone de migration habituelle de la pré-albumine. L’étude statistique a montré que cette fraction peut varier de 0 à 7,3 % soit de 0 à 5,1 g/L avec une moyenne de 0,98 ± 1,3 g/L. Ces résultats sont en concordance partielle avec une étude expérimentale faite sur des sérums de chiens [8] montrant que la surcharge des sérums par la bilirubine entraîne Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 1, janvier-février 2014
Moyenne de la fraction X (%)
Bilirubine et électrophorèse capillaire des protéines
Y = 0,018 X + 0,22 r = 0,97 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0,0
100,0
200,0
300,0
400,0
Figure 3. Corrélation par intervalle de bilirubine entre les concentrations moyennes des bilirubines totales et la moyenne des pourcentages de la fraction X.
Moyenne de la fraction X (%)
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Concentration moyenne de la bilirubine totale (µmol/L)
Y = 0,024 X + 0,58 r = 0,98 5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0
50
100
150
200
Concentration moyenne de la bilirubine directe (µmol/L)
Figure 4. Corrélation par intervalle de la bilirubine entre les concentrations moyennes des bilirubines directes et la moyenne des pourcentages de la fraction X.
une majoration de l’albumine et des alpha-1-globulines associée à une diminution des alpha 2-globulines et des bêta-2-globulines. Bienvenu et al. [9] n’ont pas signalé d’interférences. Devant la rareté des données à propos de ce sujet et sur la base de nos résultats préliminaires, nous avons retenu l’hypothèse que l’augmentation de la bilirubinémie entraîne l’apparition d’une fraction supplémentaire, au niveau préalbumine (transthyrétine). Pour valider cette hypothèse, nous avons utilisé la propriété que possède la bilirubine d’être photosensible, pour diminuer les bilirubinémies des échantillons analysés. Si cette fraction supplémentaire est en relation avec la bilirubine, elle doit suivre la même diminution après exposition à la lumière. Nos résultats ont monté une diminution moyenne de la bilirubine totale de 58 % suivie d’une diminution du même ordre (64 %) de la fraction supplémentaire. Cette relation étroite entre la fraction supplémentaire et l’albumine a été confortée par l’étude des corrélations, entre la bilirubine totale et la fraction supplémentaire (r = 0,97) Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 1, janvier-février 2014
et entre la bilirubine directe et la fraction supplémentaire (r = 0,98). En effet, la bilirubine circule dans le sang sous deux formes : forme conjuguée (bilirubine directe) et forme non conjuguée (bilirubine indirecte) ; la fixation de la bilirubine conjuguée sur l’albumine entraîne une modification structurale à l’origine de l’étalement de la fraction supplémentaire. Zhang et al. [10], en analysant le sang de cordon, ont montré qu’environ deux molécules de bilirubine sont fixées par une molécule d’albumine. Yeung et al. [11] ont même étudié par électrophorèse capillaire la capacité de l’albumine à fixer la bilirubine. D’ailleurs, dans notre série d’échantillons, nous avons deux sérums ictériques à bilirubines libres (bilirubines totales : 189 et 67 mol/L et bilirubines libres respectives : 170 et 55 mol/L) qui n’ont pas présenté de modifications du profil électrophorétique. De plus, la surcharge d’un sérum de contrôle par une solution de bilirubine à différentes concentrations (jusqu’à 400 mol/L) n’a pas révélé la présence de la fraction supplémentaire. Bien que l’interférence existe, l’impact des sérums ictériques sur le profil électrophorétique est minime avec une majoration moyenne de 2 ± 2 % (soit 0,85 ± 1,3 g/L). Pour éviter cette interférence de la bilirubine, Nie et al. [12] ont essayé d’optimiser l’électrophorèse capillaire. De même, Fung et al. [6], afin de séparer l’albumine de la bilirubine, ont modifié les conditions opératoires (séparation au niveau de la migration) et ont ajouté de l’aspirine (délassement de la liaison).
Conclusion L’électrophorèse des protéines sériques est un examen riche de renseignements, surtout lorsqu’il est accompagné d’un commentaire prescrit par le biologiste [13]. Son évolution vers l’électrophorèse capillaire a permis une meilleure reproductibilité, simplicité, performance, flexibilité, robustesse, standardisation et trac¸abilité. L’interprétation du tracé électrophorétique diffère peu de celle de la méthode manuelle ou semi-automatique, mais elle demande toutefois au biologiste de connaître quelques spécificités, en particulier en ce qui concerne les interférences analytiques. Les fortes concentrations de bilirubine semblent modifier légèrement le tracé électrophorétique soit par un étirement de la fraction de l’albumine du côté anodique, soit par l’apparition d’une fraction supplémentaire bien individualisée. L’impact de ces interférences sur l’interprétation des profils électrophorétiques reste également limité. Un examen visuel attentif des tracés électrophorétiques est recommandé afin de signaler ces éventuelles interférences. Liens d’intérêts :
aucun. 127
Biologie au quotidien Références 1. Le Carrer D, Bach-Ngohou K. L’électrophorèse capillaire automatisée en biologie clinique. Spectra Biol 2005 ; 146 : 47-52. 2. Kratzer MA, Ivandic B, Fateh-Mogham A. Neuronal network analysis of serum electrophoresis. J Clin Pathol 1992 ; 45 : 612-5. 3. Le Graff-Tavernier M, Masmoudi S, Musset L. Utilisation du logiciel Neurosoft® comme aide à l’interprétation des électrophorèses des protéines sériques. Immuno-Anal Biol Spec 2008 ; 23 : 153-8.
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Résumé. L’électrophorèse capillaire des protéines sériques est une technique rapide, fiable et simple, mais sujette à plusieurs interférences. L’objectif de notre travail est d’étudier l’interférence de la bilirubine sur cette technique ; 70 sérums ictériques ont été analysés sur l’automate Capillarys TM (Sebia). Une deuxième électrophorèse a été réalisée sur 40 échantillons après photodégradation de la bilirubine. Le dosage de la bilirubine et des protides a été fait, respectivement, par la méthode de Jendrassik et Grof et la méthode au biuret sur l’automate Konélab 20i TM (Thermo Electron Corporation). Nous avons constaté un étalement anormal de la fraction de l’albumine du côté anodique constituant parfois une fraction distincte dans la zone de migration habituelle de la pré-albumine. Cette fraction varie de 2,0 ± 2,0 % (0,0 à 7,3 %) soit de 0,98 ± 1,53 g/L (0 à 5,3 g/L) et elle semble être en relation avec la bilirubine directe, puisque suite à la surcharge des sérums par une solution de bilirubine, aucune fraction supplémentaire n’a été retrouvée. Une diminution moyenne de la bilirubine après photodégradation de 58 ± 17 % (26 à 89 %) est suivie d’une diminution du même ordre 64 ± 38 % (10 à 100 %) de la fraction supplémentaire. L’électrophorèse sur acétate de cellulose des mêmes échantillons n’a montré aucune variation. Les fortes concentrations de bilirubine semblent modifier légèrement le tracé électrophorétique. Toutefois, l’impact de ces interférences sur l’interprétation des profils électrophorétiques reste limité. Mots clés : électrophorèse capillaire, protéines, bilirubine, interférence
ˆ 2013, Article rec¸u le 14 aout ˆ 2013 accepte´ le 30 aout
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Key words: capillary electrophoresis, proteins, bilirubin, interference
Pour citer cet article : Hellara I, Fekih O, Triki S, Elmay A, Neffati F, Najjar MF. La bilirubine interfère-t-elle sur l’électrophorèse capillaire des protéines sériques ? Ann Biol Clin 2014 ; 72(1) : 124-8 doi:10.1684/abc.2013.0926
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Abstract. Capillary electrophoresis of serum proteins is a fast, reliable and simple technique, but many interference exist. The objective of our work is to study the interference of bilirubin on this technique; 70 icteric sera were analysed on Capillarys TM (Sebia). A second electrophoresis was performed on 40 samples after bilirubin photodegradation. The bilirubin and serum proteins were determinated respectively by Jendrassik and Grof and biuret methods on Konélab 20i TM (Thermo Electron Corporation). We found abnormal spreading of the albumin fraction of the anode side wich constitute sometimes an isolated fraction in the traditional area of pre-albumin migration. This fraction varies from 2.0 ± 2.0% (0.0 to 7.3%) or 0.98 ± 1.53 g/L (0 to 5.3 g/L) and it seems to be related to the direct bilirubin since, following overloading sera with a solution of bilirubin, no further fraction was recovered. An average decrease of bilirubin after photodegradation of 58 ± 17% (26-89%) is followed by a decrease in the same order 64 ± 38% (10-100%) of the additional fraction. Acetate cellulose electrophoresis of the same samples showed no variation. The high bilirubin levels seem modify slightly the electrophoretic profile. However the impact of the interference on the interpretation of electrophoretic trace is negligible.
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Bilirubine et électrophorèse capillaire des protéines
Le principe de l’électrophorèse des protéines sériques est connu depuis les années 1930, il met en jeu le déplacement des protéines ionisées lorsqu’elles sont soumises à un champ électrique et dans des conditions définies de force ionique, de pH, de durée et d’intensité de courant électrique appliqué. Il a été adapté en biologie clinique dans les années 1940 par des méthodes manuelles utilisant comme support l’acétate de cellulose, puis par l’utilisation de gel d’agarose, de gel de polyacrylamide, et ultérieurement par l’automatisation de l’électrophorèse sur ce dernier gel [1-3]. L’évolution vers l’électrophorèse capillaire, apparue en 1994, a permis un rendu plus rapide des résultats avec une meilleure reproductibilité, simplicité, performance, standardisation et trac¸abilité [4]. Cependant, certaines interférences peuvent apparaître, causées par des substances qui absorbent à 200 nm comme le fibrinogène ou certains antibiotiques ou certains médicaments tels que l’ioméprol [5]. D’autres substances modifient le profil électrophorétique par leur capacité de fixation sur l’albumine, telles que la bilirubine. L’objectif de notre travail est d’étudier l’interférence de la bilirubine sur l’électrophorèse capillaire des protéines sériques, afin de repérer éventuellement le niveau de migration de cette substance et d’évaluer l’impact des sérums ictériques sur le profil électrophorétique.
Matériels et méthodes Matériels Soixante-dix sérums ictériques ont été collectés à partir des échantillons adressés au laboratoire de biochimietoxicologie du CHU de Monastir. Tous les sérums, obtenus après centrifugation de 15 min à 2000 g, ont été conservés à + 4 ◦ C et à l’obscurité. Les échantillons ont été analysés dans la même série. Simultanément, une détermination des concentrations des bilirubines totale et directe par méthode de Jendrassik et Grof et des protidémies par méthode au biuret sont réalisées sur Konélab 20i (Thermo Electron Corporation). Une électrophorèse sur acétate de cellulose est effectuée sur les mêmes échantillons avant le traitement de dégradation de la bilirubine. Parmi les 70 échantillons, 40 ont subi l’un des deux procédés de photodégradation de la bilirubine. Une deuxième électrophorèse capillaire a été pratiquée sur les sérums traités, ainsi qu’un dosage des bilirubines totales et directes réalisé le même jour que l’électrophorèse. Une surcharge en bilirubine (Bilirubine Fluka® Réf : 14370) jusqu’à une concentration de 400 mol/L d’un sérum de contrôle a été réalisée. Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 1, janvier-février 2014
Méthodes L’électrophorèse capillaire des protéines sériques a été réalisée sur automate CapillarysTM (Sebia), multitâches et muni de huit capillaires permettant d’effectuer huit séparations électrophorétiques simultanées sans manipulation et à une cadence élevée. Le CapillarysTM est équipé d’un système de lecture code à barres des tubes de prélèvements permettant l’identification des échantillons, leur dilution s’effectue dans des barrettes de dilution à usage unique. Il réalise le lavage des capillaires par nettoyage circulaire à forte pression par différentes solutions présentes dans le compartiment réactifs. L’injection des échantillons dans les capillaires s’effectue par la mise en contact d’une extrémité des capillaires avec les échantillons dilués, puis aspiration à l’intérieur de chaque capillaire d’un très faible volume d’échantillon dilué. La migration s’effectue à température constante à l’aide d’un système à effet Peltier. La détection des fractions séparées se fait par spectrophotométrie d’absorption moléculaire et à l’aide d’un système de détection en UV. Le logiciel « Phoresis TM » incorporé dans le CapillarysTM permet le traitement des résultats, l’affichage de l’état de fonctionnement de l’automate et les résultats des analyses en cours. L’électrophorèse des protéines sériques sur acétate de cellulose comporte une migration en fonction de leur charge électrique de la cathode vers l’anode dans un milieu alcalin (tampon Tris, pH = 8,6) et sur acétate de cellulose. Les protéines ainsi séparées sont ensuite colorées par le rouge ponceau S, puis une déshydratation par le méthanol et enfin une transparisation par une solution d’éclaircissement (diacétone alcool) ont été réalisées. Le traitement des échantillons pour diminuer les concentrations de bilirubine a été réalisé par deux protocoles : - exposition des échantillons pendant une à deux heures quotidiennement et durant une semaine à la lumière du jour ; - exposition des échantillons deux heures à la lumière UV. L’analyse statistique a été faite par le logiciel Excel 2007. Le test t de Student a été utilisé pour la comparaison des moyennes, un seuil de signification (p < 0,05) a été retenu.
Résultats Les sérums collectés dans notre étude couvraient un intervalle large de bilirubine directe et totale, allant respectivement de 6 à 398 mol/L et de 21 à 438 mol/L. Les différents profils électrophorétiques des sérums ictériques n’ont pas montré d’anomalies évidentes telles que le dédoublement de l’albumine ou des différentes globulines, l’apparition d’une fraction supplémentaire ou la disparition d’une fraction normale. 125
Biologie au quotidien
A/G
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Fractions Albumine Alpha 1 Alpha 2 Beta 1 Beta 2 Gamma
%
0,80
Protides :
Normales %
44,4 6,3 11,7 7,9 7,6 22,1
< >
55,8-66,1 2,9-4,9 7,1-11,8 4,7-7,2 3,2-6,5 11,1-18,8
> > >
g/L
Normales g/L 40,2-47,6 2,1-3,5 5,1-8,5 3,4-5,2 2,3-4,7 8,0-13,5
Figure 1. Étalement de la fraction albumine pour une bilirubinémie de 218,2 mol/L.
A/G
Fractions
%
Albumine Alpha 1 Alpha 2 Beta 1 Beta 2 Gamma
47,1 4,6 5,9 4,7 21,6 16,1
0,89
Protides :
Normales % < < >
55,8-66,1 2,9-4,9 7,1-11,8 4,7-7,2 3,2-6,5 11,1-18,8
g/L
Normales g/L 40,2-47,6 2,1-3,5 5,1-8,5 3,4-5,2 2,3-4,7 8,0-13,5
Figure 2. Fraction à séparation plus tardive que l’albumine pour bilirubinémie supérieure à 400 mol/L.
Nous avons constaté l’étalement anormal de la fraction de l’albumine du côté anodique (figure 1) constituant parfois une fraction distincte dans la zone de migration habituelle sur gel de la pré-albumine (figure 2). Cette fraction varie de 2 ± 2 % (0 à 7,3 %) soit de 0,98 ± 1,53 g/L (0 à 5,3 g/L). La bilirubine étant un pigment photosensible, nous avons essayé de diminuer sa concentration dans les sérums étudiés par exposition à la lumière du jour ou à la lumière ultraviolette. Toutes les concentrations de bilirubine ont baissé. Cette diminution était suivie également par une baisse de la fraction supplémentaire et pour certains échantillons, la disparition complète de cette fraction a été notée. Une diminution moyenne de la bilirubine totale de 58 ± 17 % (26 à 89 %) est suivie d’une diminution du même ordre, 64 ± 38 % (10 à 100 %) de la fraction supplémentaire (fraction X). La corrélation bivariée entre les bilirubinémies et les fractions supplémentaires n’était pas informative. L’étude de 126
la corrélation entre les deux paramètres par intervalle de bilirubine s’est montrée bonne avec un r = 0,97 pour la bilirubine totale (figure 3) et r = 0,98 pour la bilirubine directe (figure 4). La figure 3 montre que pour une concentration de bilirubine de 100 mol/L, l’albumine n’est majorée que de 2 % (Y = [0,018 × 100] + 0,22 = 2,03 %). Cette fraction supplémentaire semble être en relation avec la bilirubine directe puisque suite à la surcharge des sérums par une solution de bilirubine jusqu’à 400 mol/L, aucune fraction supplémentaire n’a été retrouvée. La réalisation d’une électrophorèse sur acétate de cellulose des mêmes échantillons n’a pas montré de variations, ni sur le gel, ni sur le profil après lecture densitométrique.
Discussion L’électrophorèse capillaire des protéines sériques est une technique d’application récente. Elle est en train de gagner du terrain par rapport aux techniques sur gel, de par sa meilleure reproductibilité, sa rapidité et sa simplicité d’utilisation. Les automates basés sur le principe de l’électrophorèse capillaire semblent bien répondre aux attentes des biologistes, qui souhaitent avoir des résultats fiables et reproductibles et manipuler des automates simples, et conviviaux. Ils répondent aussi aux attentes des cliniciens qui souhaitent avoir un résultat rapide et accompagné d’une interprétation fiable. Le domaine des interférences est en partie étudié par le fabricant qui signale les interférences possibles de l’aspect du sérum, des médicaments. . . Mais, d’autres interférences ne sont pas bien documentées telles que l’interférence de la bilirubine, dont la fraction libre ou liée à l’albumine absorbe à 280 nm [6]. Une étude réalisée par Crivellente et al. [7] sur des sérums de rats a montré que l’électrophorèse capillaire constitue même une bonne alternative de dosage de la bilirubine. Les échantillons utilisés ont été sélectionnés de fac¸on à couvrir un intervalle assez large de bilirubinémie de 21 à 438 mol/L. Aucun sérum analysé sur CapillarysTM n’a montré d’anomalies électrophorétiques évidentes comme le dédoublement dans l’une des zones, l’apparition d’une zone supplémentaire. . . L’analyse plus fine des tracés électrophorétiques a mis en évidence l’étalement anormal de la zone d’albumine du côté anodique, voire l’apparition d’une fraction supplémentaire dans la zone de migration habituelle de la pré-albumine. L’étude statistique a montré que cette fraction peut varier de 0 à 7,3 % soit de 0 à 5,1 g/L avec une moyenne de 0,98 ± 1,3 g/L. Ces résultats sont en concordance partielle avec une étude expérimentale faite sur des sérums de chiens [8] montrant que la surcharge des sérums par la bilirubine entraîne Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 1, janvier-février 2014
Moyenne de la fraction X (%)
Bilirubine et électrophorèse capillaire des protéines
Y = 0,018 X + 0,22 r = 0,97 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0,0
100,0
200,0
300,0
400,0
Figure 3. Corrélation par intervalle de bilirubine entre les concentrations moyennes des bilirubines totales et la moyenne des pourcentages de la fraction X.
Moyenne de la fraction X (%)
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Concentration moyenne de la bilirubine totale (µmol/L)
Y = 0,024 X + 0,58 r = 0,98 5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0
50
100
150
200
Concentration moyenne de la bilirubine directe (µmol/L)
Figure 4. Corrélation par intervalle de la bilirubine entre les concentrations moyennes des bilirubines directes et la moyenne des pourcentages de la fraction X.
une majoration de l’albumine et des alpha-1-globulines associée à une diminution des alpha 2-globulines et des bêta-2-globulines. Bienvenu et al. [9] n’ont pas signalé d’interférences. Devant la rareté des données à propos de ce sujet et sur la base de nos résultats préliminaires, nous avons retenu l’hypothèse que l’augmentation de la bilirubinémie entraîne l’apparition d’une fraction supplémentaire, au niveau préalbumine (transthyrétine). Pour valider cette hypothèse, nous avons utilisé la propriété que possède la bilirubine d’être photosensible, pour diminuer les bilirubinémies des échantillons analysés. Si cette fraction supplémentaire est en relation avec la bilirubine, elle doit suivre la même diminution après exposition à la lumière. Nos résultats ont monté une diminution moyenne de la bilirubine totale de 58 % suivie d’une diminution du même ordre (64 %) de la fraction supplémentaire. Cette relation étroite entre la fraction supplémentaire et l’albumine a été confortée par l’étude des corrélations, entre la bilirubine totale et la fraction supplémentaire (r = 0,97) Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 1, janvier-février 2014
et entre la bilirubine directe et la fraction supplémentaire (r = 0,98). En effet, la bilirubine circule dans le sang sous deux formes : forme conjuguée (bilirubine directe) et forme non conjuguée (bilirubine indirecte) ; la fixation de la bilirubine conjuguée sur l’albumine entraîne une modification structurale à l’origine de l’étalement de la fraction supplémentaire. Zhang et al. [10], en analysant le sang de cordon, ont montré qu’environ deux molécules de bilirubine sont fixées par une molécule d’albumine. Yeung et al. [11] ont même étudié par électrophorèse capillaire la capacité de l’albumine à fixer la bilirubine. D’ailleurs, dans notre série d’échantillons, nous avons deux sérums ictériques à bilirubines libres (bilirubines totales : 189 et 67 mol/L et bilirubines libres respectives : 170 et 55 mol/L) qui n’ont pas présenté de modifications du profil électrophorétique. De plus, la surcharge d’un sérum de contrôle par une solution de bilirubine à différentes concentrations (jusqu’à 400 mol/L) n’a pas révélé la présence de la fraction supplémentaire. Bien que l’interférence existe, l’impact des sérums ictériques sur le profil électrophorétique est minime avec une majoration moyenne de 2 ± 2 % (soit 0,85 ± 1,3 g/L). Pour éviter cette interférence de la bilirubine, Nie et al. [12] ont essayé d’optimiser l’électrophorèse capillaire. De même, Fung et al. [6], afin de séparer l’albumine de la bilirubine, ont modifié les conditions opératoires (séparation au niveau de la migration) et ont ajouté de l’aspirine (délassement de la liaison).
Conclusion L’électrophorèse des protéines sériques est un examen riche de renseignements, surtout lorsqu’il est accompagné d’un commentaire prescrit par le biologiste [13]. Son évolution vers l’électrophorèse capillaire a permis une meilleure reproductibilité, simplicité, performance, flexibilité, robustesse, standardisation et trac¸abilité. L’interprétation du tracé électrophorétique diffère peu de celle de la méthode manuelle ou semi-automatique, mais elle demande toutefois au biologiste de connaître quelques spécificités, en particulier en ce qui concerne les interférences analytiques. Les fortes concentrations de bilirubine semblent modifier légèrement le tracé électrophorétique soit par un étirement de la fraction de l’albumine du côté anodique, soit par l’apparition d’une fraction supplémentaire bien individualisée. L’impact de ces interférences sur l’interprétation des profils électrophorétiques reste également limité. Un examen visuel attentif des tracés électrophorétiques est recommandé afin de signaler ces éventuelles interférences. Liens d’intérêts :
aucun. 127
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