Planta (Berl.) 76, 326--334 (1967)

Unterschiedliche Zusammensetzung von Stiel- und Hutzellwand bei Acetabularia mediterranea K . Z;ETSC~IE Max-1)lanck-Institut ffir Meeresbiologie, Abt. H~immerling, Wilhelmshaven Eingegangen am 6. Juli 1967

Di]/erences in the Composition o/the Cell Wall o/Stalk and Cap by Aeetabularia mediterranea Summary. The main constituents of the cell wall of the unicellular green alge Acetabularia mediterranea are mannose ,glucose, galactose and rhamnose. There are, however, striking differences in the composition of the cell wall of the stMk and the cap. The glucose and galactose content of the cap wall is much higher than that of the stalk wall. Rhamnose is found in the cap wall only. The different composition of stalk and cap wall is also manifest in cells which were enucleated prior to cap formation. Therefore, regulation of the enzymatic processes which are responsible for the different composition of stalk and cap wall take place in enucleated cells also. Bei der Morphogenese d e r einzelligen u n d einkernigen Grfinalge

Acetabularia mediterranea folgt zeitlich u n d r~umlich auf die B i l d u n g eines zylindrischen Stieles m i t verg~nglichen H a a r w i r t e l n die Ausdifferenzier u n g eines Gametangienst/~nders, d e r racist kurz H u t g e n a n n t wird. Es ste]lte sich die F r a g e , ob die Zellwand dieser beiden morphologisch verschieden g e s t a l t e t e n Teile der Zelle auch eine unterschiedliche Z u s a m m e n setzung aufweist. D a dies, wie unsere U n t e r s u c h u n g e n zeigen, d e r F a l l ist, h a b e n wir d a m i t ein S y s t e m in der H a n d , in d e m wir sehr g u t die S t e u e r u n g y o n intracellul/~ren Differenzierungsvorggngen auf molekularein N i v e a u verfolgen kSnnen. N a e h MIWA et al. (1961) u n d WE•z (1963) e n t h ~ l t die Z e l l w a n d der A c e t a b u l a r i e n als t I a u p t b e s t a n d t e i l e Mannose u n d Galaktose, wobei die Anteile dieser beiden Zucker a n s c h e i n e n d in Stiel- u n d H u t z e l l w a n d verschieden sind. D a d a r i i b e r a b e r keine q u a n t i t a t i v e n A n g a b e n vorlagen, h a b e n wit die Zellwand y o n Acetabularia mediterranea etwas g e n a u e r a n a l y s i e r t .

Material und Methoden Verwendet wurden verschiedene Nachzuchten yon Acetabularia mediterranea aus dem hiesigen Institut. Die Pflanzen wurden in iiblicher Weise in ErdschreiberLSsung bei 2500 Lux in einem 12:12 h Licht-Dunkelwechsel kultiviert (Lit. in tIXM~V.nLI~G, 1963, K•CK, 1964). Kernlose Pflanzen wurden durch Abschneiden des kernhaltigen l%hizoids erhalten.

Zellwandzusammensetzungbei Acetabularia

327

Bei der Gewinnung der Zellwand wurde im wesentlichen nach WEaZ (1963) verfahren. Die Pflanzen wurden in Methanol fixiert und damit bis zur Farblosigkeit extrahiert. AnschlieBend wurden noch mehrere Extraktionen mit Aceton vorgenommen. Nach Trocknung wurden die Pflanzen in w~grigem 0,1 m Na-Desoxycholat homogenisiert (Porter-Elvehjem-Glashomogenisatoren).Das Homogenisat wurde abzentrifugierg, der l)berstand verworfen und die Zellwandteile noch zweima] der .g.leichen Prozedur unterworfen. Durch mehrmaliges Waschen mit Aqua dest. und Athanol wurde das Desoxycholat aus den Zellwandteilen entfernt. Schlieglich wurden die Zellwandteile fiber Phosphorpentoxyd getrocknet. Die Hydrolyse der Zellwandteile wurde in abgesehmolzenen Glasampullen mit 1 ml 0,1 n H2SO~pro 10 mg Membran 24 h bei 120~ C durchgefiihrt, In Vorversuchen hgtten sieh diese Hydrolysebedingungen ~ls die geeignetsten erwiesen. Naeh der Hydrolyse wurde das Hydrolysat mit BaCOs neutralisiert und das ausgefallene BaS04 abzentrifugiert. Der Rfickstand wurde noch zweimal mit Aqua dest. gewaschen. Die vereinigten tlberst~nde wurden unter Vakuum fiber Phosphorpentoxyd eingeengt oder gefriergetrocknet. Chromatographiert wurde auf Schleieher und Schfill-Papier 2043b mgl. Die folgenden Laufmittel wurden verwendet: I Pyridin/Athylacetet/H20 5:10:6, II Butanol/Aeeton/HaO 4:5:1, III Butanol/Essigs~ure/H20 4:1:5, IV Butanol/ ~thanol/H20 5:1:4. Eine einwandfreie Auitrennung yon Glucose und Galaktose konnte nur mit dem Laufmittel I erzielt werden. Zur qnantitativen Bestimmung der Zucker wurden die mit Laufmitte] I entwickelten Chromatogrammc nach dem Trocknen durch Anilin-Phthalat-Reagenz gezogen und 15 min auf l l 5 ~ C erhitzt. Die entstehenden braunen Farbflecke wurden ausgeschnitten und fiber Nacht mit 3,5 ml 0,7 n HC1 in 80%igem Jkthanol extrahiert. Die Extrakte wurden bei 400 m~x gegen entsprechende Papierleerwerte gemessen. Auf jedem Chromatogramm wurden uul~erdem yon jedem Zucker mindestens drei Vergleichskonzentrationenaufgetragen. An Hand der Extinktionen dieser Standardkonzentrationen wurde die Konzentration der Zucker ira Hydrolysat berechnet. Die Rfiekgewinnung betrug 97--101% der eingesetzten Menge. Die enzymatisehe Bestimmung der Glucose wurde mit der Testkombination yon BOEgRI~G~ (Glucose-UV-Test) im aufgearbeiteten Hydrolysat durehgeffihrt. Der N~chweis yon Galaktose mit Ga]aktoseoxydase (Worthington Galaktostat) konnte erst nach Auftrermung des ttydrolysats erfolgreich vorgenommen werden. Der nicht in Trichloressigsgure 15s]iche Stickstoff wurde mit der Mikro-KjedahlMethode bestimmt. Bei den quantitativen Bestimmungen ist jeder angegebene Wert in der Regel der Mittelwert yon drei unabh~ngigen Bestimmungen. Jeder Versuch wurde in der Regel mindestens dreima] mit verschiedenen Naehzuchten wiederholt.

Ergebnisse Identi/izierung der in der Zellwand vorhandenen Zucker. Die papierchromatograph~sche A u f t r e n n u n g der Zel]wandhydro]ysate ergab das V o r h a n d e n s e i n mehrerer Zucker (Abb. 1). I m H y d r o l y s a t der Stielwand k o n n t e n drei, i n dem der H u t w a n d vier Monosaccharide in grSBeren Mengen nachgewiesen werden. Dazu k o m m e n einige Zucker, die n u r i n Spuren a u f t r e t e n u n d die d~her nicht n~her identifiziert wurden. E i n e r dieser Zucker, d e r n u r im H y d r o l y s a t der H u t w a n d zu finden war, verhielt sich papierchromatographisch wie Xylose. Bei einer in der Iq~he der L S s u n g s m i t t e l f r o n t laufenden Substanz, die Benzidin bereits in der K/~lte 23*

328

K. ZEr

reduziert, handelt es sich sehr wahrscheinlich um ein oder mehrere Zuckerabbauprodukte (Reductone), wie sie bei jeder S~urehydrolyse entstehen. Diese Abbauprodukte treten im Hydro]ysat der Hutwand st/~rker in Erscheinung als in dem der Stielwand. Start ,

1

2

3

X

X

X

t

(D i

Abb. 1. Nachgezeiehnetes Chromatogramm der Zellwandhydrolysate. 1 Hych'olys~t der Hutzellwand; 2 Vergleichszucker; 3 tlydrolysat der Stielzellwand. Verwendet wurde Laufmittel I. Gal Galaktose, Gluc Glucose, Man Mannose, _Rham Rhamnose. Der unterbrochen umrandete Fleck ist wahrscheinlich Xylose Auf Grund ihrer Rf-Werte und ihrer Cochromatographie mit Vergleichszuckern in vier verschiedenen Laufmitteln (s. Material u. Methoden) konnten die vier Haupthydrolyseprodukte als Rhamnose, Mannose, Glucose und Galaktose identifiziert werden. Glucose und Galaktose wur-

Zellwandzusammensetzung bei Acetabularia

329

den nar darch das Laufmittel I voneinander getrennt. Auch im Verhalten gegen verschiedene Nachweisreagenzien (wie Benzidin, Anilinphthalat, Harnstoff-ttC1, 1XTaphthoresorcin-Trichloressigs/~ure und Vanillin-Perchlors/~ure) bestand vollst/~ndige Ubereinstimmung zwischen Hydrolysatund entsprechenden Vergleichszuekern. Glucose und Galaktose warden dariiber hinaus auch enzymatisch nachgewiesen. Dazu warden die entspreehenden Zuckerflecke aus dem Chromatogramm ausgeschnittcn und die Zucker mit Wasser eluiert. Glucose wurde im Eluat mit Hexokinase und G-6-P-Dehydrogenase (Glucose-Test-Kombination yon Boehringer) nachgewiesen. Als Leerwerte dienten Eluate aus gleich groBen Papierstficken ohne Zucker. Glucose kann mit der Testkombination auch direkt im neutrahsierten Hydrolysat erfal]t werden. Der Nachweis yon Galaktose erfolgte mit Galaktoseoxydase (Galaktostat yon Worthington). Die auf enzymatischem Wege erhaltenen Werte stimmen gut mit denen/iberein, die mit der AnilinPhthalat-Methode erzielt wnrden (s. unten). Auf Grund der Spezifit/s der angewendeten Enzyme liegen Glucose und Galaktose in der D-Konfiguration vor (Au et al., 1962). Nach MrwA e~ al. (1961) gilt das aueh ffir die Mannose. Uber die Konfiguration der Rhamnose kSnnen zur Zeit noch keine Aussagen gemacht werden. Ebenso ist bisher noch nichts Sicheres fiber die Bindungsverh/~ltnisse der Zucker in der Zellwand bekannt. Bereits die qualitativen Chromatogramme lieBen deutlich erkennen, dab Mannose mengenm/~Big die anderen Zucker bei weitem iibertrifft, und dab die Anteile yon Glucose und Galaktose in der Stiel- und tIutzellwand verschieden sind. Rhamnose konnte nur in der ttutwand nachgewiesen werden. Unterschiede zwisehen den tIydrolysaten yon Stielund Itutwand bestehen aueh hinsiehtlieh der Zucker, die nur in kleinen Mengen auf~reten. Quantitative Bestimmung der Zucker in der Stiel- und Hutzellwand von kernhaltigen und kernlosen P/lanzen. Zun/~chst warden der Stickstoffund Asehegehalt von Stiel- und ttutwand miteinander vergliehen. Dabei konnten kehle wesentlichen Unterschiede festgestellt werden (Tabelle 1). Die Werbe entsprechen denen, die f/ir andere isoliel~e Zellw/~nde angegeben warden (Fg~r-WYssLI~G, 1957). Damit ist sichergestellt, dab wir das Tabelle 1. Asche- und Sticksto/]gehalt von Stiel- und Hutzellwand in Prozent des Zellwandtrockengewichtes

Stiel Hut 23b Planta (Bet1.), :Bd.76

Aschegehalt in% 4-3m

Sticks~offgehalt in% -V3m

6,0 -4- 0,75 6,5 :t: 2,2

1,5 -4- 0,24 2,5 • 0,54

330

K. Z~TSCRE:

Zellwandtrockengewicht unbedenklich als Bezugssystem ffir unsere Angaben fiber den Zuekergehalt verwenden k6nnen. Schwierigkeiten bei der quantitativen Bestimmung der Zucker der Zellwand bereitet vor allem die Tatsache, dal] sich die Zcllwand nicht vollst/~ndig hydrolysieren l~Bt. Auch mit verl~ngerten Itydrolysezeiten (bis 72 h) oder erh6hter S/~urekonzentration (bis 1 n H2S04) ist keine vollst/~ndige Itydrolyse zu erzielen. Stets bleibt ein noch nieh~ hydrolysierter Rfickstand, der nach einer 24stfindigen Hydrolysezeit bei der Stielwand in der Regel 20--25% und bei der H u t w a n d 15--17% des eingesetzten Zellwandtrockengewichtes ausmacht. Durch eine fraktionicrte Zellwandhydrolyse wurde festgestellt, dab es sieh bei diesem sehwer hydrolysierbaren Antefl haupts/~chlieh u m ein Mannan handelt. Dabei wurde so vorgegangen, dab nach einer ttydrolysedauer yon 24 h der Rfickstand abzentrifugiert, gewaschen und mit frischcr 0,1 n I-I2S04 erneut 24 h hydrolysiert wurde. Die gleiehe Prozedur wurde noch einmal wiederholt. Die jewefligen Itydrolysatfraktionen wurden getrennt analysiert (Tabelle 2). Glucose, Galaktose und Rhamnose Tabelle 2. ~raktionierte Hydrolyse von Stiel- und Hutzellwand. Eingesetzt wurden ]eweils 10 mg Zellwand

HydrolysatFraktion

~zg ~r

Glucose

Galaktose

Rhamnose

Stiel 24 h 48 h 72 h

3030 855 42O

170 0 0

60 0 0

0 0 0

Hut 24 h 48 h 72 h

1780 530 290

520 0 0

165 0 0

170 0 0

sind bereits nach 24stfindiger Itydrolyse vollst~ndig in Freiheit gesetzt. Die weitere Hydrolyse liefert nur noch Mannose. Auch in der 72-StdFraktion ist noch Mannose enthalten. DaB sich Mannane z. T. sehr schlecht hydrolysieren lassen, ist bereits wiederholt festgestellt worden (WHIsTLE~ U. SMUT, 1953). Eine Bestimmung des Mannosegehaltes der Zellwand ist daher nieht m6glich. Dagegen kann der Gehalt an Glucose, Galaktose und Rhamnose nach 24stfindiger Hydrolysedauer ohne groBe Schwierigkeiten ermiStelt werden. Aus den in Abb. 2 dargestellten Ergebnissen geht hervor, dab in der Hutzellwand yon kernhaltigen Pflanzen prozentual sehr viel mehr Glucose und Galaktose enthalten sind als in der Stielwand. Wahrscheinlich

Zellwandzusammensetzung bei Acetabularia

331

ist der Mannosegehalt dementsprechend geringer, l~hamnose konnte nur in der I t u t w a n d nachgewiesen werden. Auch dann konnte in der Stielwand keine l~hamnose festgestellt werden, wenn vom Hydrolysat das dreifache der sonst verwendeten Menge auf dem Chromatogramm aufgetragen wurde. Glucose

Ga[actose

Rhamnose

% 6~

Hut

m 5-

Stie[ a

4Stiet b

3-

Hut St.a St.b

Hut St.a St.b

Hut St.a St.b

Abb. 2. Quantitative Zusammensetzung der Stie]- und Hutzellwand yon kernhMtigen Zellen. Ordinate: Zucker in Prozent des Zellwandtroekengewichtes U m auszuschliel~en, dab die Anteile yon Glucose und GMaktose bereits im Stiel yon der Basis zur Spitze hin zunehmen, wurde der Stiel in eine vordere und hintere It~lfte zerlegt und die Zellw/~nde dieser H/~lften getrennt untersucht. Die Zusammensetzung der beiden Iti~lften weist keine Unterschiede auf. Das Verh~ltnis zwischen dem Glucosegehalt der Stiel- und ttutzellwand ist bei den einzelnen Nachzuchten etwas verschieden. Das gilt auch ffir die GMaktose. Mit vier verschiedenen Nachzuchten betr~gt der Durchschnittswert fiir Glucose 1:3,8 und ffir Galaktose 1:2,5. Zu den gleichen Ergebnissen fiihrten Versuche, bei denen Glucose enzymatisch direkt im neutralisierten Hydrolysat bestimmt wurde (Tabelle 3). Die unterschiedliche Zusammensetzung yon Stiel- und ttutzellwand finder sich auch in Zellen, denen vor dem Beginn der I-Iutbildung die kernhaltigen Rhizoide abgeschnitten worden waren. Der prozentuale

332

K. ZETSCH~:

Tabelle 3. Enzymatische Bestimmung des Glucosegehaltes der Stiel- und Hutzellwand von kernhaltigen Pflanzen. Angaben in Prozent des Zellwa~trockengewichtes. Stiel a und b 8iehe Abb. 2

Hu~ S~iel ~ Stiel b

Glueosegehalt in % • 3 m

Verh~Itnis von Glucose Stiel:Hut

6,4 :j: 0,51 1,6 4- 0,0 1,55 • 0,15

1:4,0 1:4,1

GIucos e

Gatactos

e

Rham

nose

7

$tieL

Hut

St.

I

Hut

St.

I

i Hut

St.

Abb. 3. Quantitative Zusammensetzung der Stiel- und Hutzellwand yon kernlosen Zellen. Ordinate: Zucker in Prozent des Zellwand~roekengewichtes Anteil yon Glucose, Galaktose und l%h~mnose in der Hutwund ist bei den kernlosen Pflanzen sogar gr6Bcr als bei den kernhaltigen (Abb. 3). Aus den Ergebnissen der oben geschilderten Vcrsuche geht somit eindeutig horror, dab die Zellwand yon Stiel und Hu~ eine unterschiedliche Zusammensetzung aufweist. Die l%egelmechanismen, welche die unterschiedliche Zusammensetzung der Wand dieser beiden I)ifferenzierungen der Zelle steucrn, sind auch in kernlosen Zellen noch funktionsfiihig.

Zellwandzusammensetzung bei Acetabularia

333

Diskussion Bei der Morphogenese der Acetabularia-Zelle spielen wie bei jeder Pflanzenzelle Wachstum und Ausgcstaltung der Zellwand eine wesentliche t~olle. Das tritt besonders beim ~bergang v o n d e r Stiel- zur Hutbfldung zutage. Wie unsere Untersuchungen zeigen, wb'd die Wand dieser beiden Zelldifferenzierungen aueh durch eine untersehiedliche Zusammensetzung eharakterisiert. Inwieweit diese ,chemischen Untersehiede" eine golle bei der raumlichen AusgestalCung der Zellwand und damit der Formbildung der ganzen Zelle spielen, kann zur Zeit noch nicht gesagt werden. Dazu sind bisher unsere Kenntnisse fiber die chemischen und physikalischen Eigensehaften der Zellwandpolysaccharide noch zu gering. Mehr l~,Bt sich zu der Frage ausffihren, wie die unterschiedliche Zusammensetzung yon Stiel- und Itutzellwand zustande kommt. Prinzipiell gibt es daffir drei MSglichkeiten : 1. Zum Zeitpunkt der ttutbfldung werden Menge oder Aktivit/~t der Enzyme erhSht, die Glucose mid Galakrose in die Zellwand einbauen. 2. Die Synthese von Glucose mid Galaktose stellt den begrenzenden Faktor dar mid mi~ dem Beginn der Hutbildung werden Menge oder Aktivit/it der Enzyme erh6ht, die an der Synthese dieser beiden Zucker beteiligt sind. 3. Sehlieglieh k6nnte aueh ein koordiniertes Zusammenwirken yon den unter 1. und 2. genannten MSglichkeiten erforderlich sein, um die ver/~ndelCe Zusammensetzung der Itutwand zu bewirken. Zu Punkt 2 ist zu sagen, dab bei der Synthese komplexer Kohlenhydrate bekanntlich Nueleotidzucker als Donatoren yon Zuckerresten eine entscheidende t~olle spielen. Dementsprechend konnten Mr aueh naehweisen, dab s/~mtliehe Enzyme, die f/Jr die Synthese von UDP-Glueose und UDP-Galaktose aus Fructose-6-phosphat erforderlich sind, in A. mediterranea vorhanden sind (Z]~TSCH]~, 1965, 1966a). Bisher haben Mr yon zwei dieser Enzyme - - der UPDG-Pyrophosphorylase und der UDPGal-4-Epimerase - - den Aktivit/itsverlauf w/~hrend der Stiel- und ttutbildung n/iher untersucht. Die Aktivit/~t beider Enzyme steigt mit dem Beginn der Hutbildung stark an. Alles spricht daf/ir, dab dieser Anstieg durch eine versts de novo Synthese der Enzyme erfolgt, die auch in kernlosen Zellen stattfindet und daher auf cytoplasmatisehem Niveau geregelg wird (Z~Tscg~, 1966b und 1967). Diese Befunde deuten darauf bin, dag die Erh6hung des Glueoseund Galaktosegehaltes der Hutzellwand eine erhShte Synthese der entsprechenden Nueleotidzueker voraussetzt. Weitere Untersuchungen werden kl/iren m/issen, ob die Aktivit/~t sgmtlicher Enzyme des UDPGund UDPGal-Syntheseweges im Zusammenhang mit der YIutbildung ansteigt und ob auch die Aktivitat der Transferasen zunimmt, die Glucose

334

K. Z~rsc~r : Zellwandzusammensetzungbei Acetabularia

u n d Galaktose i n die Zellwand e i n b a u e n . Das V e r h a l t e n der a m R h a m nosestoffwechsel betefligten E n z y m e ist bisher noch n i c h t u n t e r s u e h t worden. F r a u A. ttXgTr~L d a n k e ich fiir ihre sorgfs

Mitarbeit.

Literatur AVIOAD, G., D. AMARAL, C. ASENSIO, and B. HOREOKER: The D-galactoseoxidase of Polyporus circinatus. J. biol. Chem. 287, 2736--43 (1962). FREu I~G, A.: Die pflanzliche Zellwand. Berlin-GSttingen-Heidelberg: Springer 1959. ttX~ERLI~G, J. : Nueleo-cytoplasmie interactions in Acetabularia and other cells. Ann. l~ev. Plant Physiol. 14, 65--92 (1963). KEcx, K. : Culturing and experimental manipulation of Acetabularia. In: Methods in cell physiology, vol. I, 10. 189--213. New York and London: Academic Press 1964. MIwA, T., Y. IRrKL and T. SUZVKI:Mannan and xylan as essentiell cell wall constituents of some siphonous green alga. Chimie et physieochimie des principes immediates tires des algues. Coll. int. Centre nat. Rech. sci. 103, 135--143 (1961). W ~ z , G.: Vergleiehende Membrananalysen bei versehiedenen Dasycladaceen. Planta (Berl.) 60, 322--330 (1963). WmS~L~, H. L., and C. L. S~A~T: Polysaecharid chemistry. New York: Academic Press 1953. Z~TSO~E, K. : Nachweis yon Guanosindiphosphat-mannose- und Uridindiphosphatglucose Pyrophosphorylase in Acetabularia. Planta (Berl.) 64, 129--137 (1965). - - Nachweis yon Enzymen des Galaetosestoffwechscls in der Grfinalge Acetabularia mediterranea. Planta (Berl.) 68, 240--246 (1966a). - - Regulation der UDPG-4-Epimerase-Synthese in kernhaltigen und kernlosen Acetabularien. Biochim. biophys. Acta (Amst.) 124, 332--338 (1966b). - - Regulation der UDPG-Pyrophosphorylaseaktivit~t in Aeetabularia. Z. Iqaturforsch, im Druck (1967). Dr. K. Z~TSCHV, Botanisches Institut der Universitgt 74 Tfibingen, Wflhelmstr. 5