1383
PCR法
を用 い た肥 育 牛 か らのVero毒
素 産 生性 大 腸菌 の検 出
徳 島県保健環境セ ソター 多田
博
小
伊丹 幸子 山本 大阪府立公衆衛生研究所
林
一
寛
田
口
真
保男 澄
家畜衛生試験場九州支場 中
澤
宗
生
(平成4年5月27日 受付) (平成4年6月26日 受理)
Key
words:
Vero-cytotoxin,
要 健 康 牛 糞 便(1週
齢 ∼23ヵ 月 牛);222検
下 痢 便28検 体 か ら分 離 したEcoli;68株 (PCR)法
を 用 い て 調 べ た.そ
か ら7株 のVT産 てVTECで
の 結 果,健
生 性Escherichiaooli(VTEC)と
のVero毒
生 性 をpolymerasechainreaction
あ っ た.検 出 し たVTECの0血
れ らの 蜻
素(VT)産
康 牛 糞 便52検 体(23.4%)か
生 菌 を 検 出 した.検 出 したVT産
占 め,こ
旨
体 か らのVerotoxin産
ら101株,牛
下 痢 便3検
生 菌 は 生 化 学 的 性 状 検 査,Vero細
清 型 は14の 型 と0型
24の 血 清 型 に 型 別 さ れ,026,0145,0111,0157の 体 の60%を
Verotoxin
型 は人 の散 発事例 か ら轍
の4血
体(10.7%)
胞 試験 の結 果す べ
別 不 能 に 分 類 され,H型
順 に 多 く検 出 した.こ
仔牛
別 結果 を含 め
清 型 がVTEC検
多 く報 告 さ れ て お り,ま た026以
出検
外 は,わ
が
国 で 集 団 発 生 の あ っ た 血 清 型 で あ る こ と か ら,人 へ の 感 染 源 と し て 牛 が 関 与 し て い る こ とが 示 唆 さ れ た. 検 索 方 法 で はBGLB増 BGLB-PCRと
菌 液 中 のVT遺
伝 子 の撫
をPCR法
同 程 度 の 検 出 率 を 得 る に は,DHL-PCRで
か ら,増 菌 培 地 か ら直 接 ス ク リー ニ ン グ す るBGLB-PCRが
序 Vero毒
効 率 的,簡
便,迅
速 で あ る と考 え られ た.
り4)∼6),近年 注 目 され て い る 下 痢 原 因 菌 の 一 つ で
文
あ る.こ れ らの 数 多 くの事 例 に お け る感 染 源 は疫
素 産 生 性 大 腸 菌(Verotoxinproducing
Ecoli;VTEC)は
で 検 査 し,陽 性 検 体 だ け を 菌 検 索 す る
は20個 の 集 落 を 検 査 し な け れ ぽ な ら な い こ と
出 血 性 大 腸 炎 の 原 因 菌 と して
学 調 査 に よ って 明 らか に され た も の は 少 な い が,
よ く知 られ,下 痢 症 に 続 い て起 こ る溶 血 性 尿 毒 症
家 畜 の関 連 が 示 唆 さ れ て い る7)8).外国 に お い て は
症 候 群(HUS)の
食 肉,家 畜 の 糞 便,牛 乳 等 のVTECの
併 発 が 死 に 至 る こ と もあ る危 険
な 病 原 菌 で あ る.1982年
ア メ リ カ合 衆 国 で ハ ソ
ノミー ガ ーを 原 因 とす るVTECに 毒 事 例 が 報告1)さ れ て 以 来,特
汚染調査 が
み られ,人 の 感 染 源 と して そ の重 要 性 が指 摘 され
の食 中
て い る9)∼11).わが 国 で の 家 畜 の 調 査 報 告 は 一
に北 米 で の 発 生 が
部12)13)には あ るが,汚 染 状 況 は ほ とん ど 明 らか に
よ る2例
多 く見 られ て い る2).わ が 国 で も1990年 浦 和 市 の
され て い な い の が 現 状 で あ る.今 回,私 達 は本 菌
幼 稚 園 に お い て,本
の 分 布 状 況 を 把 握 す るた め に,徳 島 県 内 に肥 育 の
菌 に汚 染 され た 飲 料 水 を 原 因
とす る集 団 発 生 が あ り2名
の園 児 が死 亡 した事
例3)がみ られ る.散 発 事 例 も数 多 く報 告 され て お 別 刷 請 求先:(〒770)徳
平 成4年10月20日
asechainreaction(PCR)法 せ た 方 法 に よ り実 施 した.
島 市 万代 町5-71
徳 島 県保 健 環 境 セ ンタ ー
た め 導 入 され た 牛 のVTEC保
多田
博
菌 調 査 をpolymerと培 養 法 を 組 み 合 わ
1384
多田 材 料 と方 法
1.検
た も の を 検 体 と し てMKプ
査 材 料 お よ び使 用 菌 株
1991年4月
頭,5ヵ
ク リー ニ ン グPCR法
か ら11月 ま で の8ヵ
に 導 入 後,肥
月 間 に徳 島 県 下
育 さ れ て い る 仔 牛(1∼3週
月 牛16頭,10ヵ
23ヵ 月 牛5頭
リー ・ブ レ ア ーN培 検 体 と し た.菌
地(日
水)に
採 取 した も の を
よ り1990年
下 痢 を 主 症 状 とす る 仔 牛 下 痢 便28検
の2年
間 に
体 か ら分 離 し
を 用 い た.
i糞便 はBGLB培 DHL培
月 牛10頭,
健 康 牛 直 腸 便 を キ ャ
株 は1988年
たE.coliの68株
齢)181
月 牛10頭,18ヵ
の 合 計222の
地(日
地(日 水)を
用 いた増菌培養 と
用 いた直接分離培 養 によって
増 菌 培 地(BGLB培
地)か
ら 直 接VTECの
存 在
分 離 培 地(DHL培
地)
の,い く つ か の 集 落 を 集 め てVTECの
存 在 をみ る
方 法(DHL-PCR)の2つ
を 行 った .
のPCR法
は,VT2vpを
含 む す べ て のVT型
が 検 出 で き るKarchら14)のMKプ ト(MK1,MK2)を のPCR法
ラ イ マ ーセ ッ
用 い て ス ク リー ニ ン グ の た め
を 行 い,そ
の増 菌培養 液 あ るいは複 数
の 集 落 混 合 液 中 にVT産 認 し た.つ
い で,そ
れ た 菌 株 ご と に,小
生株 が存 在 す るか を確
れ ぞ れ の方 法 に よ って 分 離 さ 林15)の 混 合 法 に よ るVT型
用 プ ラ イ マ ー セ ッ ト(V1,VT3,VT4 用 い て 型 別 を 行 っ た.PCR混
フ ル ・イ ン キ ュ ベ ー タ ー(リ 変 性94℃20秒,ア
伸 張 反 応72℃1.5分 ル 行 っ た.増
を1サ
幅 後PCR混
ロ ー ス(タ カ ラ,LO3)で
別
,VT5)を
応 は,プ
ロ グ ラマ
3.増
イ ク ル と し て25サ
イ ク
合 液1 .0μ1を1.5%ア
ガ
電 気 泳 動 を 行 い,臭
化 エ
片 を 確 認 し た.
の10株 ず つ を100μ1の
懸 濁 し て,さ
ら に ス ク リ ー ニ ン グPCR法(MKプ
ラ イ マ ー 使 用)を 合 し た10株
菌 培 養 を 用 い るPCRの
方 法(BGLB-
とDHL直
体 の う ち117検 体 は,BGLB増
菌培養
接 分 離 培 養 を 同 時 に 行 っ た .BGLB増
菌 液 は,37℃
一 夜 培 養 後,そ の1.Omlを15
間 遠 心 し,沈
渣 を100μ1の
性 を 示 した検 体 は混
を 個 々 に型 別 用 混 合 プ ラ イ マ ー に よ る
を 行 い,VT産
4.分
生 株 の 確 認 とVT型
離 平 板 を 用 い るPCRの
別 を
方 法(DHL-PCR)
行 わ な か っ た 糞 便105検
地 で 直 接 分 離 培 養 を 行 っ た .検
体 は
らEcoliを
疑 う集 落3個(A法),15検
(B法),3検
体 は20個(C法)をTSAに
し,100μ1の
蒸 留 水 に 最 高10株
濁 し て,BGLB-PCRと い,VT型
,
査 精度 を
み る た め に105検 体 中67検 体 に つ い て は,1検
体か
体 は5個 画線培 養
の 被 検 菌 を混 合 懸
同 様 に し てPCR法
を 行
別 を 行 った .
5.分
離 菌 株 を用 い る方 法
牛 下 痢 症 か ら 分 離 し たEcoli68株 画 線 培 養 し,4∼6株 濁 し て,VT産
を100μ1の
をTSAに 蒸 留水 に混合懸
生 性 を み る た めMKプ
使 っ て ス ク リー ニ ン グ のPCR法
6.Vero細
ライ マ ー を
を 行 い,陽
性 を
胞 試験
tories)で
除 鉄 し た ブ レ イ ン ハ ー トイ ン ヒ ュ ー
ジ ョ ン ブ イ ヨ ン(日 上 清 を0.45μmの た も の を2%仔 水)で10倍
約50%以
,000rpm
蒸 留水 に懸濁 し
7.生 PCR法
水)で37℃
一夜振 盤培養後
,
メ ン ブ ラ ン フ ィル タ ー で濾 過 し 牛 血 清 加 イ ー グ ルMEM培
希 釈 し,そ
の1.Omlを
胞 に 加 え,30℃4∼5日
地(日
単 層 培 養 した 間観察 を行 った
.
上 の細 胞 に細 胞 壊 死 性 の変 化 が 見 られ た
も の をVT陽
糞 便222検
行 っ た.陽
蒸 留水 に混 合
行 っ た.
Vero細
PCR)
で1分
線 培 養 し,そ
画
被 検 菌 株 はchelex100(Bio-RadLabora.0分,
チ ジ ウ ム で 染 色 の 後 トラ ン ス イ ル ミ ネ ー タ ー で 目 的 のDNA断
水,TSA)に
を 行 っ た.
コ ー ,JAPH.90)を ニ ー リ ン グ47℃1
疑 う40集
示 し た 検 体 は 個 々 の 菌 株 に つ い て 型 別 用PCR法
合 液 はtemplateに
加 熱 菌 液 を 用 い て 作 成 し た .反
用 い,熱
遺伝 子
体 あ た りEcoliを
落 を ト リプ ト ソ ー ヤ 寒 天 培 地(日
DHL培
を み る 方 法(BGLB-PCR)と
性 を示 した検
時 に 培 養 を 行 っ て い たDHL直
BGLB-PCRを
査 の方 法
PCR法
体 に つ い て は,同
ラ イ マ ー に よ って ス
を 行 っ た .陽
接 分 離 平 板 か ら1検
PCR法
水)を
分 離 を 行 っ た. 2.調
博 他
性 と し た.
化学 的性状検査 あ る い はVero細
胞 試 験 で 陽性 を示 し
た 菌 株 に つ い て は 定 法16)に 従 っ て 同 定 を 行 っ た . 血 清 型0157が
み ら れ た 場 合 に は ,ソ ル ビ ッ ト,β感染 症 学 雑 誌
第66巻
第10号
PCR法 グ ル ク ロ ニ ダ ー ゼ(MUG)試 8.血
に よる牛 糞 便 か らのVTECの
験 を 追 加 検 査 し た.
PCR法
で 陽 性 を 示 し,5検
VTECを
清型別
市 販 の 病 原 大 腸 菌 免 疫 血 清(デ
ン カ 生 研)お
よ
1385
検出
分 離 し た.こ
検 体 は,仔
牛(1∼3週
び 家 畜 衛 生 試 験 場 で 作 成 した 家 兎 免 疫 血 清 を 用 い て 行 っ た.
し た 結 果 で は,5検
健 康 牛 糞 便222検 PCRで
グPCR法
績
VTECが
体 中,BGLB-PCRとDHL-
陽 性 を 示 し た52検 体(23-4%)か
たVT産
生 の101株
体(10.7%)か せ た108株
と,仔 牛 下 痢 便28検 体 中,3検
ら 検 出 し たVT産
生 の7株
は,す べ てEcoliで,Vero細
的 な 細 胞 変 性 を 示 し た.血 す べ て は,37℃24時 せ ず,MUG陰
胞 に特 徴
清 型0157:H7の6株
性 で あ っ た. よ るVTECの
117検 体 中39検 法(MKプ
検 索 で は,牛
体(33.3%)が
う に 約230bpの
目 的 のDNA断
と判 定 し,増
検 体(26.5%)か
存 在 が 疑 わ れ た.
落 に つ い て 検 査 し,31
ら54株 のVTECが
(Table1),8検
齢 牛 は,76検
分離 され な
らVTECを
体 中7検
Detection
の う ち25検
分 離 し た.ま
体(43.8%)が
牛 時 に 検 出 し た0血
検 出 し
月 後 に,再
度検 査
ス ク リー ニ ン 体(40.0%)か
か し な が ら,3検
ら 体は仔
清 型 と は 異 な っ て い た(仔
時:0111→5ヵ
月 後:0103,仔
月 後.0145,仔
牛 時:OUT→5ヵ
仔 牛 時 に0157:H7(VT2)を
牛
牛 時:0111→5カ 月 後:0145). 検 出 し た1検
体 は,
5ヵ 月 後 で も 同 じ 血 清 型 が 認 め ら れ た-10ヵ
月牛
10検 体 か ら は,VTECは
認 め ら れ な か っ た が,18
ヵ 月 牛10検
体(10.0%)か
体 で は,1検
ニ ン グPCR法
ら ス ク リー
と 後 の 分 離 培 養 に よ っ てVTEC 牛5検
ク リ ー ニ ン グPCR法
体 の うち,1検
体 はス
で 陽 性 を 示 し た が,VTEC
を 分 離 す る こ と は で き な か っ た. DHL平
板 集 落 を 集 め 直 接PCR法
(DHL-PCR)結
果 は,仔
体
た5カ.月
Table
1
Detection
method
体 中30検 体(39.5%)
で 陽 性 を 示 し,こ
(32-9%)か
にVTECを
体(50.0%)が
で 陽 性 を 示 し4検
ら
体 の う ち10
牛 糞 便105検
を 行 った 体 の うち21検
分 離 され た が
体 か ら はVTECは
か っ た.1∼3週 がPCR法
体40集
示 した よ
回5ヵ
分 離 で き た.し
を 分 離 し た.23カ,月
片 が 確 認 され 陽 性
菌 液 中 にVTECの
そ の 後 の 培 養 で1検
糞便
ス ク リ ー ニ ソ グPCR
ラ イ マ ー 使 用)で,Fig.!に
Fig. 1
を合 わ
間 以 内 に は ソ ル ビ ッ トを 分 解
BGLB-PCRに
も16検
ら検 出 し
月 牛16検
齢)時
て い る 牛 で あ っ た が,今
成
体(31.3%)か
の5ヵ
of
using BGLB
VTEC
strains
enrichment
by
medium
PCR after
incubation
牛
ス ク リー ニ ン グ
of VT-producing
pathogens
after
PCR amplification. lane
1 and
digestion),
13: DNA lane
marker
2 to 11:
(21DNA
samples,
lane
Hind
producing E. coli 0157: 1.O111 sample of each
H7 strains reaction mixture
applied
gel
to the
analysis.
agarose
III
12: VTwas
for electrophoretic
Table
*3 for method
平成4年10月20日
2
method
Detection using some
method C
of
VTEC
colonies
A , 5 for method
strains
by
PCR
on DHL medium
B and
20 colonies
for
1386
多田
Table
3
Results
amplification
of PCR using
method
E. coli
for
isolated
VT
gene
from
calf
博 他 分 離 保 存 中 のE.coli68株 か ら の7株
は,3検
がVTECで
体(10.7%)
あ っ た(Table3)
.
with diarrhea 検 出 し たVTECのO血
清 型 は,14の
不 能 株 に 分 類 さ れ,H型 に 型 別 さ れ た.な 23株
(NM)で Table
4
Serotypes
and toxintypes
of VTEC
isolated
別 結 果 を 含 め24の 血 清 型
か で もO26が15検
と 最 も 多 く,そ
のH型
い でO145が10検
ま た はVT2単
体(25 .0%);
はH:11と
あ り,す べ てVT1産
4).つ
型 と型 別
非 運 動 性
生 株 で あ っ た(Table
体(16
.7%);15株
でVT1
独 産 生 株 で あ っ た .O111は6検
(10.0%);16株
でVT1単
産 生 株 が あ り,H型 O157:H7は5検
体
独 とVT1,VT2両
毒 素
は す べ てNMで
体(8.3%);6株
両 毒 素 産 生 株 とVT2単
あ った .
でVT1
,VT2
独 産 生 株 で あ っ た .こ の ほ
か 優 勢 に 検 出 さ れ た 血 清 型 は,O98は5検 (8.3%);17株,O103は3検 で あ る.こ
て い る.同
す べ て 検 出 され
一 検 体 か ら複 数 の 血 清 型 を 検 出 し た の
体 あ り,そ
の血 清 型 と毒 素 型 の組 合 せ は
O157:
H7(VT1,VT2)とO145:
O153:
NM(VT1)とO103:
H2(VT1) H11(VT1),
H16(VT1)とO113:
H21(VT1)
(VT1)とO26:H11(VT1)で
,
, O1: O116:
, O26:
NM
あ っ た .VTECが
検 出 さ れ た60検 体 の うち,VT1単 頻 度 が 高 く34検 体(56.7%),つ 検 体(31.7%)で
,
NM(VT2)
H7(VT1)とO26:
(11.7%)に
な ど
れ まで わ が 国 で み られ た 集 団 発 生 か ら
分 離 さ れ たO111,O145,O157は
は5検
体
体(5.0%);7株
独産生株 が最 も い でVT2単
あ っ た.両
独 株19
毒 素 産 生 株 は7検
体
み ら れ た が,O111:NMとO157:H7
の 血 清 型 に 限 られ て い た . 考
察
牛 糞 便 か らVTECの 二 通 りのPCR法
検 索 をVero細
で 行 っ た .増
菌 培 養 か ら のPCR
法 で あ るBGLB-PCRは,117検
体(20.0%)か DHL平
らVTECを
検 出 した(Table2)
板 上 の3集 落 を試 験 したA法
中8検 体(11.9%),5集 検 体(26.7%),20集 (39.1%)か
落 のB法 落 のC法
らVTECが
. で は67検 体
で は15検 体 中4
で は23検 体 中9検 体
検 出 され,1検
体 あた り
の被 検 菌 株 数 が 多 い 実 験 系 の 方 が 高 い 陽 性 率 が得 られ た. 1988年 か ら1990年 の 間 に28頭 の 仔 牛 下 痢 便 か ら
(33.3%)が VTECを と5ヵ
月 牛 ,18ヵ
月
月 牛 と成 牛 に な る につ れ 低 下 す る傾 向 に 検 出 した 健 康 牛 を
月 後 に 再 検 査 し た と こ ろ,10検
(40.0%)か
ら
に 仔 牛(32.9%)
高 く,10ヵ
あ っ た.ま た 仔 牛 時 にVTECを 5ヵ
体
体(26.5%)か
出 率 は,特
月 牛(31.3%)が
牛,23ヵ
体 中39検
陽 性 を 示 し,31検 検 出 し た .検
胞 試 験 と
ら 再 度VTECを
体 中4検
検 出 し た が,そ
ち 前 回 と 同 一 の 血 清 型 を 検 出 し た の は1検 感 染症 学 雑 誌
第66巻
体 の う 体 で
第10号
PCR法
あ った.こ れ は 肥 育 中 に別 のVTECに か,前
に よ る牛 糞 便 か らのVTECの
感 染 した の
回 の 時 にす で に 保 菌 して い た もの で あ る の
か 明 らか で は な い が,1検
体 中の検査菌株 数を増
1387
検出
分 離 したVTEC108株
の うち 型 別 で きた0血
清 型 は14種 で026,0145,0111,0157の
順 に多 く
検 出 さ れ た.こ の4血 清 型 がVTECを
検 出 した60
や す な ど詳 細 に検 査 を 行 うこ と に よ り明 らか に な
検 体 中36検 体(60.0%)を
る も の と考 え る.下 痢 症 の仔 牛 便28検 体 か ら分 離
血 清 型 は,わ が 国 で の 集 団 発 生 例3)18)∼21)や 散発 事
保 存 中 のE.coli68株
例4)∼6)か ら も多 く検 出 さ れ て い る.ま た 中 澤 ら12)
の7株
がVTECで
は,3検
体(10.7%)か
あ った.こ の 結 果 は健 康 仔 牛 の
最 少 集 落 を 検 査 す るDHLPCRA法 (11.9%)よ
ら
の検 出 率
りもや や 低 い 結 果 が 得 られ,検
らみ る と,VTECが
出率 か
仔 牛 の 下 痢 原 因 菌 で あ る とは
考 え られ な か った.し
か し今 回 の 成 績 は,増 菌 培
養 中 の 検 体 お よ び分 離 平 板 上 の複 数 の 集 落 を ス ク リー ニ ソ グす るPCR法
を 用 い て お り,こ の こ と
占 め て い た.こ
も牛 か ら026,0145,0157な
れ らの
どの 血 清 型 を 分 離 し
て お り,人 へ の感 染 源 とし て 牛 が 密 接 に 関与 して い る こ とが 示 唆 され た.ま
た 同 じ地 域 か ら導 入 さ
れ,同 一 牛 舎 内 で 肥 育 さ れ て い る仔 牛 か らは,同 一 血 清 型 のVTECが 多 く検 出 され る傾 向 に あ り, 肥 育 中 の牛 か ら牛 へ の感 染 に つ い て も十 分 な配 慮 が 必 要 で あ る.さ
らに仔 牛 に 高 率(BGLB-PCR:
が,こ れ ま で の よ うに集 落 を 分 離,同 定 後VT試
32.9%,DHL-PCRC法:39.1%)にVTECが
験 を 行 うと い う方 法 よ り も検 査 精 度 を高 く して い
在 す る こ とが 判 明 した こ とか ら,肥 育 中 に畜 産 業
る も の と思 わ れ る.ま た 今 回,検 査 した 時 の牛 は
従 事 者 へ の 感 染 や 地 下 水,河 川 水 な どの環 境 汚 染
健 康 状 態 で あ った が,仔 牛 時 に は症 状 に 程 度 の差
が 危 惧 され る.ま た 一 見 健 康 な成 牛 か ら もVTEC
は あ るが 原 因不 明 の 下 痢 が 多 くみ られ る こ と もあ
が検 出 され た こ とか ら屠 殺 解 体 時 の 食 肉 の 二 次 汚
り,そ の原 因 の一 つ と し てVTECが
染 な ど に も十 分 な 配 慮 が必 要 と考 え られ る. 文 献
関与 してい る
こ とが 推 察 され る.こ れ につ い て はMohammad ら17)は牛 に お い て も人 と同様 に 下 痢 原 因 菌 と考 え られ る 結 果 を 報 告 し て い る.BGLB-PCRで
陽性
を 示 した に も か か わ らずVTEC株
が分離 で きな
か った8検
が 他 菌(雑 菌)
体 は,検 体 中 のVTEC数
に比 べ て 極 端 に 少 な か っ た た め 釣 菌 した40株 中 に は存 在 し な か った の か,Ecoli以
外 の 細 菌 がVT
遺 伝 子 を 保 有 して いた の か,あ
る い は 全 くの非 特
異 的 反 応 で あ った の か は 不 明 で あ る.今 後 詳 細 な 調 査 を 行 い 明 ら か に され な け れ ば な らな い. DHL-PCRで
のVTECの
1) Riley, L.W., Remis, R.S., Helgerson, S.D., McGee, H.B., Wells, J.G., Davis, B.R., Hebert, R.J., Olcott, H.M., Johnson, L.M., Hargrett, N. T., Blake, P.A. & Cohen, M.L.: Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype. N. Engl. J. Med., 308: 681-685, 1983. 2) Ostroff, S.M., Hopkins, D.P., Tauxe, R.V., Sowers, E.G. & Strockbine, N.K.: Surveillance of Escherichia coli 0157 isolation and confirmation, United States, 1988. M.M.W.R., 40: 1-6, 1991. 3)
検 出 率 は,A法
11.9%,B法26.7%,C法39.1%と1検
落 数 を増 や す ほ ど高 くな る こ と は 当然 の こ と と考
BGLB-PCRは
ス ク リー ニ ン グ検 査 で 陽 性 検 体 だ
け を 菌 検 索 す れ ば よ く,DHLPCRに よ く迅 速,簡 便 にVTECの
を 示 して い る.し た が って,糞 便 の み な らず,食 品 を は じ め 河 川 水 な ど の 自然 環 境 か ら のVT産 生 菌 の検 索 に は,有 効 な方 法 とな る もの と考 え ら れ る. 平成4年10月20日
よ る 出 血 性 大 腸 炎.
457-465,
小 林 一 寛,
り"調 5)
神 野 逸 郎,
高 橋 寛 彦: 分 離.
石井
Escherichia
よ る 出 血 性 大 腸 炎 の"さ
染 症 誌59:
H7の
中 務 光 人,
田 村 和 満, 坂 崎 利 一:
H7に
査.感
疋 田 和 生, 0157:
coli
臨 床 と 微 生 物,
1991. 原 田 七 寛,
colio157:
比べ て効率
検索 が可能で あ るこ と
埼 玉 県 某 幼 稚 園 で 流 行 し たE.
H7に
経 康, 下 辻 常 介
検 査 し な けれ ぽ
同 等 の 検 出 率 に な ら な い こ とは,
宏 輔:
18: 4)
え られ る.し か し20集 落(C法)を
城 O157:
体 の検査集
BGLB-PCRと
存
1056-1060,
かのぼ
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環 境 管 理技
1388
8)
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伊 藤 哲 哉,
川北
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H7を
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水 谷 文 彦,
西村
豊,
永井
65:
12)
13)
15)
1188
工 藤 泰 雄:
片岡
康,
甲 斐 明 美:
18)
伊藤
武,
美 佐 子, 泰 雄,
池 上 重 明, 淑 夫,
H7の
Vero毒
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20)
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稲葉
松下
工藤
友 次,
秀,
山 下 征 洋,
加 藤 喜 市,
弘岡
博, 大 関 哲 也, 大 芝
豊,
綱 川 敏 夫,
産 生 す るEscherichia
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田中
大 瀬 戸 光 明,
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高 野 伊 知 郎,
山 田 幸 正, 秋 山
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高 橋 正 樹,
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感 染症 学 雑 誌
第66巻
第10号
PCR法
Detection
に よ る牛 糞便 か らのVTECの
of Verotoxin-Producing Chain Reaction
1389
検出
Escherichia coli Using from Dairy Cattles.
Polymerase
Hiroshi TADA, Sachiko ITAMI & Yasuo YAMAMOTO Tokushima Prefectural Institute of Public Health and Environmental Kazuhiro KOBAYASHI & Masumi TAGUCHI Osaka Prefectural Institute of Public Health Muneo NAKAZAWA
Sciences
Kyusyu Branch Laboratory, National Institute of Animal Health
The vero cytotoxin (VT) is responsible for hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome. Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect VT-producing coliform bacteria from dairy cattle. It was found that 39 (33.3%)of the 117 fecal samples examined were recognized with VT genes in BGLB enrichment broth by the PCR method (named BGLB-PCR).Of the VT-positive samples, 31 samples (26.5%)were found to have VT-producing Escherichia coli. Frequencies of isolation in younger cattles (under 5 months) were 31.3-32.9%. On the other hand, the PCR method using the bacterial suspension of some colonies from DHL selective isolation medium (named DHL-PCR),was used for 105 samples. The DHL-PCRwas validated according to the number of colonies tested for detecting VTEC. When using E. coli strains which have been stored after isolation by the conventional culture method, the VT-producing strains found were 7 (10.3%)of the 68 isolates tested. The 101 out of the 108 VTEC strains from cattle were classified into 14 0 groups. 4 0 serogroups (026, 0111, 0145, 0157) from 60% of VTEC positive cattle, were also the most common in humans with diarrhea. All E. coli O157:H7 isolates failed to ferment after 48 hrs and to hydorolyze 4-methyl-umbelliferyl43-D-glucuronide(MUG). These results suggests that cattle may play an important role in human VTEC infections. The BGL B-PCR technique is usefull in ecological studies for VT-producing pathogens.
平 成4年10月20日
PCR法
を用 い た肥 育 牛 か らのVero毒
素 産 生性 大 腸菌 の検 出
徳 島県保健環境セ ソター 多田
博
小
伊丹 幸子 山本 大阪府立公衆衛生研究所
林
一
寛
田
口
真
保男 澄
家畜衛生試験場九州支場 中
澤
宗
生
(平成4年5月27日 受付) (平成4年6月26日 受理)
Key
words:
Vero-cytotoxin,
要 健 康 牛 糞 便(1週
齢 ∼23ヵ 月 牛);222検
下 痢 便28検 体 か ら分 離 したEcoli;68株 (PCR)法
を 用 い て 調 べ た.そ
か ら7株 のVT産 てVTECで
の 結 果,健
生 性Escherichiaooli(VTEC)と
のVero毒
生 性 をpolymerasechainreaction
あ っ た.検 出 し たVTECの0血
れ らの 蜻
素(VT)産
康 牛 糞 便52検 体(23.4%)か
生 菌 を 検 出 した.検 出 したVT産
占 め,こ
旨
体 か らのVerotoxin産
ら101株,牛
下 痢 便3検
生 菌 は 生 化 学 的 性 状 検 査,Vero細
清 型 は14の 型 と0型
24の 血 清 型 に 型 別 さ れ,026,0145,0111,0157の 体 の60%を
Verotoxin
型 は人 の散 発事例 か ら轍
の4血
体(10.7%)
胞 試験 の結 果す べ
別 不 能 に 分 類 され,H型
順 に 多 く検 出 した.こ
仔牛
別 結果 を含 め
清 型 がVTEC検
多 く報 告 さ れ て お り,ま た026以
出検
外 は,わ
が
国 で 集 団 発 生 の あ っ た 血 清 型 で あ る こ と か ら,人 へ の 感 染 源 と し て 牛 が 関 与 し て い る こ とが 示 唆 さ れ た. 検 索 方 法 で はBGLB増 BGLB-PCRと
菌 液 中 のVT遺
伝 子 の撫
をPCR法
同 程 度 の 検 出 率 を 得 る に は,DHL-PCRで
か ら,増 菌 培 地 か ら直 接 ス ク リー ニ ン グ す るBGLB-PCRが
序 Vero毒
効 率 的,簡
便,迅
速 で あ る と考 え られ た.
り4)∼6),近年 注 目 され て い る 下 痢 原 因 菌 の 一 つ で
文
あ る.こ れ らの 数 多 くの事 例 に お け る感 染 源 は疫
素 産 生 性 大 腸 菌(Verotoxinproducing
Ecoli;VTEC)は
で 検 査 し,陽 性 検 体 だ け を 菌 検 索 す る
は20個 の 集 落 を 検 査 し な け れ ぽ な ら な い こ と
出 血 性 大 腸 炎 の 原 因 菌 と して
学 調 査 に よ って 明 らか に され た も の は 少 な い が,
よ く知 られ,下 痢 症 に 続 い て起 こ る溶 血 性 尿 毒 症
家 畜 の関 連 が 示 唆 さ れ て い る7)8).外国 に お い て は
症 候 群(HUS)の
食 肉,家 畜 の 糞 便,牛 乳 等 のVTECの
併 発 が 死 に 至 る こ と もあ る危 険
な 病 原 菌 で あ る.1982年
ア メ リ カ合 衆 国 で ハ ソ
ノミー ガ ーを 原 因 とす るVTECに 毒 事 例 が 報告1)さ れ て 以 来,特
汚染調査 が
み られ,人 の 感 染 源 と して そ の重 要 性 が指 摘 され
の食 中
て い る9)∼11).わが 国 で の 家 畜 の 調 査 報 告 は 一
に北 米 で の 発 生 が
部12)13)には あ るが,汚 染 状 況 は ほ とん ど 明 らか に
よ る2例
多 く見 られ て い る2).わ が 国 で も1990年 浦 和 市 の
され て い な い の が 現 状 で あ る.今 回,私 達 は本 菌
幼 稚 園 に お い て,本
の 分 布 状 況 を 把 握 す るた め に,徳 島 県 内 に肥 育 の
菌 に汚 染 され た 飲 料 水 を 原 因
とす る集 団 発 生 が あ り2名
の園 児 が死 亡 した事
例3)がみ られ る.散 発 事 例 も数 多 く報 告 され て お 別 刷 請 求先:(〒770)徳
平 成4年10月20日
asechainreaction(PCR)法 せ た 方 法 に よ り実 施 した.
島 市 万代 町5-71
徳 島 県保 健 環 境 セ ンタ ー
た め 導 入 され た 牛 のVTEC保
多田
博
菌 調 査 をpolymerと培 養 法 を 組 み 合 わ
1384
多田 材 料 と方 法
1.検
た も の を 検 体 と し てMKプ
査 材 料 お よ び使 用 菌 株
1991年4月
頭,5ヵ
ク リー ニ ン グPCR法
か ら11月 ま で の8ヵ
に 導 入 後,肥
月 間 に徳 島 県 下
育 さ れ て い る 仔 牛(1∼3週
月 牛16頭,10ヵ
23ヵ 月 牛5頭
リー ・ブ レ ア ーN培 検 体 と し た.菌
地(日
水)に
採 取 した も の を
よ り1990年
下 痢 を 主 症 状 とす る 仔 牛 下 痢 便28検
の2年
間 に
体 か ら分 離 し
を 用 い た.
i糞便 はBGLB培 DHL培
月 牛10頭,
健 康 牛 直 腸 便 を キ ャ
株 は1988年
たE.coliの68株
齢)181
月 牛10頭,18ヵ
の 合 計222の
地(日
地(日 水)を
用 いた増菌培養 と
用 いた直接分離培 養 によって
増 菌 培 地(BGLB培
地)か
ら 直 接VTECの
存 在
分 離 培 地(DHL培
地)
の,い く つ か の 集 落 を 集 め てVTECの
存 在 をみ る
方 法(DHL-PCR)の2つ
を 行 った .
のPCR法
は,VT2vpを
含 む す べ て のVT型
が 検 出 で き るKarchら14)のMKプ ト(MK1,MK2)を のPCR法
ラ イ マ ーセ ッ
用 い て ス ク リー ニ ン グ の た め
を 行 い,そ
の増 菌培養 液 あ るいは複 数
の 集 落 混 合 液 中 にVT産 認 し た.つ
い で,そ
れ た 菌 株 ご と に,小
生株 が存 在 す るか を確
れ ぞ れ の方 法 に よ って 分 離 さ 林15)の 混 合 法 に よ るVT型
用 プ ラ イ マ ー セ ッ ト(V1,VT3,VT4 用 い て 型 別 を 行 っ た.PCR混
フ ル ・イ ン キ ュ ベ ー タ ー(リ 変 性94℃20秒,ア
伸 張 反 応72℃1.5分 ル 行 っ た.増
を1サ
幅 後PCR混
ロ ー ス(タ カ ラ,LO3)で
別
,VT5)を
応 は,プ
ロ グ ラマ
3.増
イ ク ル と し て25サ
イ ク
合 液1 .0μ1を1.5%ア
ガ
電 気 泳 動 を 行 い,臭
化 エ
片 を 確 認 し た.
の10株 ず つ を100μ1の
懸 濁 し て,さ
ら に ス ク リ ー ニ ン グPCR法(MKプ
ラ イ マ ー 使 用)を 合 し た10株
菌 培 養 を 用 い るPCRの
方 法(BGLB-
とDHL直
体 の う ち117検 体 は,BGLB増
菌培養
接 分 離 培 養 を 同 時 に 行 っ た .BGLB増
菌 液 は,37℃
一 夜 培 養 後,そ の1.Omlを15
間 遠 心 し,沈
渣 を100μ1の
性 を 示 した検 体 は混
を 個 々 に型 別 用 混 合 プ ラ イ マ ー に よ る
を 行 い,VT産
4.分
生 株 の 確 認 とVT型
離 平 板 を 用 い るPCRの
別 を
方 法(DHL-PCR)
行 わ な か っ た 糞 便105検
地 で 直 接 分 離 培 養 を 行 っ た .検
体 は
らEcoliを
疑 う集 落3個(A法),15検
(B法),3検
体 は20個(C法)をTSAに
し,100μ1の
蒸 留 水 に 最 高10株
濁 し て,BGLB-PCRと い,VT型
,
査 精度 を
み る た め に105検 体 中67検 体 に つ い て は,1検
体か
体 は5個 画線培 養
の 被 検 菌 を混 合 懸
同 様 に し てPCR法
を 行
別 を 行 った .
5.分
離 菌 株 を用 い る方 法
牛 下 痢 症 か ら 分 離 し たEcoli68株 画 線 培 養 し,4∼6株 濁 し て,VT産
を100μ1の
をTSAに 蒸 留水 に混合懸
生 性 を み る た めMKプ
使 っ て ス ク リー ニ ン グ のPCR法
6.Vero細
ライ マ ー を
を 行 い,陽
性 を
胞 試験
tories)で
除 鉄 し た ブ レ イ ン ハ ー トイ ン ヒ ュ ー
ジ ョ ン ブ イ ヨ ン(日 上 清 を0.45μmの た も の を2%仔 水)で10倍
約50%以
,000rpm
蒸 留水 に懸濁 し
7.生 PCR法
水)で37℃
一夜振 盤培養後
,
メ ン ブ ラ ン フ ィル タ ー で濾 過 し 牛 血 清 加 イ ー グ ルMEM培
希 釈 し,そ
の1.Omlを
胞 に 加 え,30℃4∼5日
地(日
単 層 培 養 した 間観察 を行 った
.
上 の細 胞 に細 胞 壊 死 性 の変 化 が 見 られ た
も の をVT陽
糞 便222検
行 っ た.陽
蒸 留水 に混 合
行 っ た.
Vero細
PCR)
で1分
線 培 養 し,そ
画
被 検 菌 株 はchelex100(Bio-RadLabora.0分,
チ ジ ウ ム で 染 色 の 後 トラ ン ス イ ル ミ ネ ー タ ー で 目 的 のDNA断
水,TSA)に
を 行 っ た.
コ ー ,JAPH.90)を ニ ー リ ン グ47℃1
疑 う40集
示 し た 検 体 は 個 々 の 菌 株 に つ い て 型 別 用PCR法
合 液 はtemplateに
加 熱 菌 液 を 用 い て 作 成 し た .反
用 い,熱
遺伝 子
体 あ た りEcoliを
落 を ト リプ ト ソ ー ヤ 寒 天 培 地(日
DHL培
を み る 方 法(BGLB-PCR)と
性 を示 した検
時 に 培 養 を 行 っ て い たDHL直
BGLB-PCRを
査 の方 法
PCR法
体 に つ い て は,同
ラ イ マ ー に よ って ス
を 行 っ た .陽
接 分 離 平 板 か ら1検
PCR法
水)を
分 離 を 行 っ た. 2.調
博 他
性 と し た.
化学 的性状検査 あ る い はVero細
胞 試 験 で 陽性 を示 し
た 菌 株 に つ い て は 定 法16)に 従 っ て 同 定 を 行 っ た . 血 清 型0157が
み ら れ た 場 合 に は ,ソ ル ビ ッ ト,β感染 症 学 雑 誌
第66巻
第10号
PCR法 グ ル ク ロ ニ ダ ー ゼ(MUG)試 8.血
に よる牛 糞 便 か らのVTECの
験 を 追 加 検 査 し た.
PCR法
で 陽 性 を 示 し,5検
VTECを
清型別
市 販 の 病 原 大 腸 菌 免 疫 血 清(デ
ン カ 生 研)お
よ
1385
検出
分 離 し た.こ
検 体 は,仔
牛(1∼3週
び 家 畜 衛 生 試 験 場 で 作 成 した 家 兎 免 疫 血 清 を 用 い て 行 っ た.
し た 結 果 で は,5検
健 康 牛 糞 便222検 PCRで
グPCR法
績
VTECが
体 中,BGLB-PCRとDHL-
陽 性 を 示 し た52検 体(23-4%)か
たVT産
生 の101株
体(10.7%)か せ た108株
と,仔 牛 下 痢 便28検 体 中,3検
ら 検 出 し たVT産
生 の7株
は,す べ てEcoliで,Vero細
的 な 細 胞 変 性 を 示 し た.血 す べ て は,37℃24時 せ ず,MUG陰
胞 に特 徴
清 型0157:H7の6株
性 で あ っ た. よ るVTECの
117検 体 中39検 法(MKプ
検 索 で は,牛
体(33.3%)が
う に 約230bpの
目 的 のDNA断
と判 定 し,増
検 体(26.5%)か
存 在 が 疑 わ れ た.
落 に つ い て 検 査 し,31
ら54株 のVTECが
(Table1),8検
齢 牛 は,76検
分離 され な
らVTECを
体 中7検
Detection
の う ち25検
分 離 し た.ま
体(43.8%)が
牛 時 に 検 出 し た0血
検 出 し
月 後 に,再
度検 査
ス ク リー ニ ン 体(40.0%)か
か し な が ら,3検
ら 体は仔
清 型 と は 異 な っ て い た(仔
時:0111→5ヵ
月 後:0103,仔
月 後.0145,仔
牛 時:OUT→5ヵ
仔 牛 時 に0157:H7(VT2)を
牛
牛 時:0111→5カ 月 後:0145). 検 出 し た1検
体 は,
5ヵ 月 後 で も 同 じ 血 清 型 が 認 め ら れ た-10ヵ
月牛
10検 体 か ら は,VTECは
認 め ら れ な か っ た が,18
ヵ 月 牛10検
体(10.0%)か
体 で は,1検
ニ ン グPCR法
ら ス ク リー
と 後 の 分 離 培 養 に よ っ てVTEC 牛5検
ク リ ー ニ ン グPCR法
体 の うち,1検
体 はス
で 陽 性 を 示 し た が,VTEC
を 分 離 す る こ と は で き な か っ た. DHL平
板 集 落 を 集 め 直 接PCR法
(DHL-PCR)結
果 は,仔
体
た5カ.月
Table
1
Detection
method
体 中30検 体(39.5%)
で 陽 性 を 示 し,こ
(32-9%)か
にVTECを
体(50.0%)が
で 陽 性 を 示 し4検
ら
体 の う ち10
牛 糞 便105検
を 行 った 体 の うち21検
分 離 され た が
体 か ら はVTECは
か っ た.1∼3週 がPCR法
体40集
示 した よ
回5ヵ
分 離 で き た.し
を 分 離 し た.23カ,月
片 が 確 認 され 陽 性
菌 液 中 にVTECの
そ の 後 の 培 養 で1検
糞便
ス ク リ ー ニ ソ グPCR
ラ イ マ ー 使 用)で,Fig.!に
Fig. 1
を合 わ
間 以 内 に は ソ ル ビ ッ トを 分 解
BGLB-PCRに
も16検
ら検 出 し
月 牛16検
齢)時
て い る 牛 で あ っ た が,今
成
体(31.3%)か
の5ヵ
of
using BGLB
VTEC
strains
enrichment
by
medium
PCR after
incubation
牛
ス ク リー ニ ン グ
of VT-producing
pathogens
after
PCR amplification. lane
1 and
digestion),
13: DNA lane
marker
2 to 11:
(21DNA
samples,
lane
Hind
producing E. coli 0157: 1.O111 sample of each
H7 strains reaction mixture
applied
gel
to the
analysis.
agarose
III
12: VTwas
for electrophoretic
Table
*3 for method
平成4年10月20日
2
method
Detection using some
method C
of
VTEC
colonies
A , 5 for method
strains
by
PCR
on DHL medium
B and
20 colonies
for
1386
多田
Table
3
Results
amplification
of PCR using
method
E. coli
for
isolated
VT
gene
from
calf
博 他 分 離 保 存 中 のE.coli68株 か ら の7株
は,3検
がVTECで
体(10.7%)
あ っ た(Table3)
.
with diarrhea 検 出 し たVTECのO血
清 型 は,14の
不 能 株 に 分 類 さ れ,H型 に 型 別 さ れ た.な 23株
(NM)で Table
4
Serotypes
and toxintypes
of VTEC
isolated
別 結 果 を 含 め24の 血 清 型
か で もO26が15検
と 最 も 多 く,そ
のH型
い でO145が10検
ま た はVT2単
体(25 .0%);
はH:11と
あ り,す べ てVT1産
4).つ
型 と型 別
非 運 動 性
生 株 で あ っ た(Table
体(16
.7%);15株
でVT1
独 産 生 株 で あ っ た .O111は6検
(10.0%);16株
でVT1単
産 生 株 が あ り,H型 O157:H7は5検
体
独 とVT1,VT2両
毒 素
は す べ てNMで
体(8.3%);6株
両 毒 素 産 生 株 とVT2単
あ った .
でVT1
,VT2
独 産 生 株 で あ っ た .こ の ほ
か 優 勢 に 検 出 さ れ た 血 清 型 は,O98は5検 (8.3%);17株,O103は3検 で あ る.こ
て い る.同
す べ て 検 出 され
一 検 体 か ら複 数 の 血 清 型 を 検 出 し た の
体 あ り,そ
の血 清 型 と毒 素 型 の組 合 せ は
O157:
H7(VT1,VT2)とO145:
O153:
NM(VT1)とO103:
H2(VT1) H11(VT1),
H16(VT1)とO113:
H21(VT1)
(VT1)とO26:H11(VT1)で
,
, O1: O116:
, O26:
NM
あ っ た .VTECが
検 出 さ れ た60検 体 の うち,VT1単 頻 度 が 高 く34検 体(56.7%),つ 検 体(31.7%)で
,
NM(VT2)
H7(VT1)とO26:
(11.7%)に
な ど
れ まで わ が 国 で み られ た 集 団 発 生 か ら
分 離 さ れ たO111,O145,O157は
は5検
体
体(5.0%);7株
独産生株 が最 も い でVT2単
あ っ た.両
独 株19
毒 素 産 生 株 は7検
体
み ら れ た が,O111:NMとO157:H7
の 血 清 型 に 限 られ て い た . 考
察
牛 糞 便 か らVTECの 二 通 りのPCR法
検 索 をVero細
で 行 っ た .増
菌 培 養 か ら のPCR
法 で あ るBGLB-PCRは,117検
体(20.0%)か DHL平
らVTECを
検 出 した(Table2)
板 上 の3集 落 を試 験 したA法
中8検 体(11.9%),5集 検 体(26.7%),20集 (39.1%)か
落 のB法 落 のC法
らVTECが
. で は67検 体
で は15検 体 中4
で は23検 体 中9検 体
検 出 され,1検
体 あた り
の被 検 菌 株 数 が 多 い 実 験 系 の 方 が 高 い 陽 性 率 が得 られ た. 1988年 か ら1990年 の 間 に28頭 の 仔 牛 下 痢 便 か ら
(33.3%)が VTECを と5ヵ
月 牛 ,18ヵ
月
月 牛 と成 牛 に な る につ れ 低 下 す る傾 向 に 検 出 した 健 康 牛 を
月 後 に 再 検 査 し た と こ ろ,10検
(40.0%)か
ら
に 仔 牛(32.9%)
高 く,10ヵ
あ っ た.ま た 仔 牛 時 にVTECを 5ヵ
体
体(26.5%)か
出 率 は,特
月 牛(31.3%)が
牛,23ヵ
体 中39検
陽 性 を 示 し,31検 検 出 し た .検
胞 試 験 と
ら 再 度VTECを
体 中4検
検 出 し た が,そ
ち 前 回 と 同 一 の 血 清 型 を 検 出 し た の は1検 感 染症 学 雑 誌
第66巻
体 の う 体 で
第10号
PCR法
あ った.こ れ は 肥 育 中 に別 のVTECに か,前
に よ る牛 糞 便 か らのVTECの
感 染 した の
回 の 時 にす で に 保 菌 して い た もの で あ る の
か 明 らか で は な い が,1検
体 中の検査菌株 数を増
1387
検出
分 離 したVTEC108株
の うち 型 別 で きた0血
清 型 は14種 で026,0145,0111,0157の
順 に多 く
検 出 さ れ た.こ の4血 清 型 がVTECを
検 出 した60
や す な ど詳 細 に検 査 を 行 うこ と に よ り明 らか に な
検 体 中36検 体(60.0%)を
る も の と考 え る.下 痢 症 の仔 牛 便28検 体 か ら分 離
血 清 型 は,わ が 国 で の 集 団 発 生 例3)18)∼21)や 散発 事
保 存 中 のE.coli68株
例4)∼6)か ら も多 く検 出 さ れ て い る.ま た 中 澤 ら12)
の7株
がVTECで
は,3検
体(10.7%)か
あ った.こ の 結 果 は健 康 仔 牛 の
最 少 集 落 を 検 査 す るDHLPCRA法 (11.9%)よ
ら
の検 出 率
りもや や 低 い 結 果 が 得 られ,検
らみ る と,VTECが
出率 か
仔 牛 の 下 痢 原 因 菌 で あ る とは
考 え られ な か った.し
か し今 回 の 成 績 は,増 菌 培
養 中 の 検 体 お よ び分 離 平 板 上 の複 数 の 集 落 を ス ク リー ニ ソ グす るPCR法
を 用 い て お り,こ の こ と
占 め て い た.こ
も牛 か ら026,0145,0157な
れ らの
どの 血 清 型 を 分 離 し
て お り,人 へ の感 染 源 とし て 牛 が 密 接 に 関与 して い る こ とが 示 唆 され た.ま
た 同 じ地 域 か ら導 入 さ
れ,同 一 牛 舎 内 で 肥 育 さ れ て い る仔 牛 か らは,同 一 血 清 型 のVTECが 多 く検 出 され る傾 向 に あ り, 肥 育 中 の牛 か ら牛 へ の感 染 に つ い て も十 分 な配 慮 が 必 要 で あ る.さ
らに仔 牛 に 高 率(BGLB-PCR:
が,こ れ ま で の よ うに集 落 を 分 離,同 定 後VT試
32.9%,DHL-PCRC法:39.1%)にVTECが
験 を 行 うと い う方 法 よ り も検 査 精 度 を高 く して い
在 す る こ とが 判 明 した こ とか ら,肥 育 中 に畜 産 業
る も の と思 わ れ る.ま た 今 回,検 査 した 時 の牛 は
従 事 者 へ の 感 染 や 地 下 水,河 川 水 な どの環 境 汚 染
健 康 状 態 で あ った が,仔 牛 時 に は症 状 に 程 度 の差
が 危 惧 され る.ま た 一 見 健 康 な成 牛 か ら もVTEC
は あ るが 原 因不 明 の 下 痢 が 多 くみ られ る こ と もあ
が検 出 され た こ とか ら屠 殺 解 体 時 の 食 肉 の 二 次 汚
り,そ の原 因 の一 つ と し てVTECが
染 な ど に も十 分 な 配 慮 が必 要 と考 え られ る. 文 献
関与 してい る
こ とが 推 察 され る.こ れ につ い て はMohammad ら17)は牛 に お い て も人 と同様 に 下 痢 原 因 菌 と考 え られ る 結 果 を 報 告 し て い る.BGLB-PCRで
陽性
を 示 した に も か か わ らずVTEC株
が分離 で きな
か った8検
が 他 菌(雑 菌)
体 は,検 体 中 のVTEC数
に比 べ て 極 端 に 少 な か っ た た め 釣 菌 した40株 中 に は存 在 し な か った の か,Ecoli以
外 の 細 菌 がVT
遺 伝 子 を 保 有 して いた の か,あ
る い は 全 くの非 特
異 的 反 応 で あ った の か は 不 明 で あ る.今 後 詳 細 な 調 査 を 行 い 明 ら か に され な け れ ば な らな い. DHL-PCRで
のVTECの
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検 出 率 は,A法
11.9%,B法26.7%,C法39.1%と1検
落 数 を増 や す ほ ど高 くな る こ と は 当然 の こ と と考
BGLB-PCRは
ス ク リー ニ ン グ検 査 で 陽 性 検 体 だ
け を 菌 検 索 す れ ば よ く,DHLPCRに よ く迅 速,簡 便 にVTECの
を 示 して い る.し た が って,糞 便 の み な らず,食 品 を は じ め 河 川 水 な ど の 自然 環 境 か ら のVT産 生 菌 の検 索 に は,有 効 な方 法 とな る もの と考 え ら れ る. 平成4年10月20日
よ る 出 血 性 大 腸 炎.
457-465,
小 林 一 寛,
り"調 5)
神 野 逸 郎,
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石井
Escherichia
よ る 出 血 性 大 腸 炎 の"さ
染 症 誌59:
H7の
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田 村 和 満, 坂 崎 利 一:
H7に
査.感
疋 田 和 生, 0157:
coli
臨 床 と 微 生 物,
1991. 原 田 七 寛,
colio157:
比べ て効率
検索 が可能で あ るこ と
埼 玉 県 某 幼 稚 園 で 流 行 し たE.
H7に
経 康, 下 辻 常 介
検 査 し な けれ ぽ
同 等 の 検 出 率 に な ら な い こ とは,
宏 輔:
18: 4)
え られ る.し か し20集 落(C法)を
城 O157:
体 の検査集
BGLB-PCRと
存
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西村
豊,
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65:
12)
13)
15)
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片岡
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美 佐 子, 泰 雄,
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第66巻
第10号
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Detection
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of Verotoxin-Producing Chain Reaction
1389
検出
Escherichia coli Using from Dairy Cattles.
Polymerase
Hiroshi TADA, Sachiko ITAMI & Yasuo YAMAMOTO Tokushima Prefectural Institute of Public Health and Environmental Kazuhiro KOBAYASHI & Masumi TAGUCHI Osaka Prefectural Institute of Public Health Muneo NAKAZAWA
Sciences
Kyusyu Branch Laboratory, National Institute of Animal Health
The vero cytotoxin (VT) is responsible for hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome. Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect VT-producing coliform bacteria from dairy cattle. It was found that 39 (33.3%)of the 117 fecal samples examined were recognized with VT genes in BGLB enrichment broth by the PCR method (named BGLB-PCR).Of the VT-positive samples, 31 samples (26.5%)were found to have VT-producing Escherichia coli. Frequencies of isolation in younger cattles (under 5 months) were 31.3-32.9%. On the other hand, the PCR method using the bacterial suspension of some colonies from DHL selective isolation medium (named DHL-PCR),was used for 105 samples. The DHL-PCRwas validated according to the number of colonies tested for detecting VTEC. When using E. coli strains which have been stored after isolation by the conventional culture method, the VT-producing strains found were 7 (10.3%)of the 68 isolates tested. The 101 out of the 108 VTEC strains from cattle were classified into 14 0 groups. 4 0 serogroups (026, 0111, 0145, 0157) from 60% of VTEC positive cattle, were also the most common in humans with diarrhea. All E. coli O157:H7 isolates failed to ferment after 48 hrs and to hydorolyze 4-methyl-umbelliferyl43-D-glucuronide(MUG). These results suggests that cattle may play an important role in human VTEC infections. The BGL B-PCR technique is usefull in ecological studies for VT-producing pathogens.
平 成4年10月20日
