Arch. Toxicol. 34, 47--52 (1975) 9 by Springer-Verlag 1975

Nachweis und Bestimmung von Parathion und p-Nitrophenol in biologischem Material durch Reverse-Phase-Hochdruck-Fltissigkeitschromatographie K. Harzer und R. Barchet Chemisches Untersuchungsamt der Stadt Stuttgart Eingegangen am 22. Mi~rz 1975

Dctection and Determination of Parathion and p-Nitrophenol in Biological Material by Reverse-Phase-High-Power-Liquid Chromatography Abstract. In 2 persons (female and male} who committed suicide reverse-phase-highpower-liquid chromatography (HPLC) was used to detect, in the first case, Parathion in the stomach and blood as well as p-Nitrophenol in the kidneys, and in the second case, p-I~itrophenol in the urine. The Parathion in the stomach was analyzed in quantity, directly and also after hydrolysis to p-Nitrophenol. The results were checked with gas-chromatographic and spectralphotometric methods. Key words: Parathion -- p-Nitrophenol -- Analysis of Biological Material -- ReversePhase HPLC. Zusammen]assung. Bei 2 durch Selbstmord verstorbenen Personen, einer Frau und einem Mann, werden im ersten Fall im Mageninhalt und Blut Parathion, in der Niere p-Nitrophenol, im zweiten Fall im Urin p-Nitrophenol dutch l~everse-Phase-Hochdruck-Fliissigkeitschromatographic nachgewieaen. Das Parathion im Mageninhalt wurde dabei sowohl direkt als auch nach Verseifung zu p-Nitrophenol quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse wurden mit gaschromatographischen nnd spektralphotometrischen Methoden iiberpriift. Schli~sselw6rter: Parathion -- p-Nitrophenol -- Analyse yon Organmaterial -- Reverse. Phase-Hochdruck-Flfissigkeitschromatographie (HPLC). Zum qualitativcn und quantitativen Nachweis yon Parathion und p-Nitrophenol sind die Papier- und die Diinnschichtchromatographic sowie die UVSpektrophotometrie geeignete Methoden (s. ]~bersicht bei Sperlieh, 1969); fiir Parathion k o m m t dazu noch die Gaschromatographie (Gudzinowiez, i967). Als einc neue physikalisch-chemische Methode stcht seit einiger Zeit fiir den RoutineLaborbetrieb die Hoehdruckfliissigkeitschromatographie zur Vcrfiigung, die eine S~ulenchromatographie mit den kurzen Retentionszeiten der Gaschromatographie mSglieh macht. Aus den verschiedenen Arten der Hochdruckfliissigkeitschromatographic (HPLC) haben wir die Reverse-Phase-Chromatographie fiir unsere Untersuchungen ausgew~hlt. Diese ist einfach zu handhaben und benStigt mit MethanolWasser-Mischungen verschiedener Zusammensetzung nut zwei Laufmittelkomponenten (Smith, 197i; Gere and Majors, i97i).

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K. Harzer und R. Barehet

Material und Methoden :Bei der durch Selbstmord verstorbenen F r a u wurden Mageninhalt, Blur und l~iere untersucht. Weitere Asservate waren nicht vorhanden. Bei dem ebenfalls dureh Selbstmord verstorbenen Mann stand n u r Urin zur Verffigung. Auf Grund der Vorgesehichte bestand in beiden F/~llen der begriindete Verdacht, dab Phosphorsiiureester eingenommen wurden. Weitere Einzelheiten waren uns nicht bekannt.

Mageninhalt. Wenn der Mageninhalt w~Brig u n d dfinnit/issig ist, k a n n er direkt untersucht werden, andernfalls empfiehlt es sich I g nach der Methode yon Kaiser u. Haag (1956) aufzuarbeiten. Die so erhaltene LSsung kann sowohl fiir die qualitative wie ffir die quantitative U n t e r s u c h u n g verwendet werden. Eine LSsung von 1 m g Parathion in I ml J~thanol wird als EichlSsung verwendet. Blur. 100 ml Herzblut werden m i t dem Ultra-Turrax homogenisiert u n d d a n n m i t 800 g Natriumsulfat getrocknet. Das d a n a durch Verreiben im MSrser erhaltene Pulver wird m i t A t h e r erschSpfend extrahiert. Der J~therextrakt wird nochmals mit wenig Natriumsulfat getroeknet, abfiltriert u n d d a n n fast bis zur Trockene eingedampft. Der verbliebene Riickstand wird ohne weitere Reinigung in den Fliissigkeitschromatographen eingespritzt. lgiere. 30 g Niere werden im Mixer zerkleinert u n d d a n n anschlieBend m i t 30 ml t 5 %iger Salzs/iure t 5 rain am R/ickflu6 gekocht. Die erhaltene LSsung wird naeh dem Erkalten 2mal m i t je 10 ml Gemisch nach Lawford u. Harvey (1953) [400 ml Petroli~ther, t 0 0 ml J~ther, 6 ml Amylalkohol] ausgeschfittelt. :Die beiden organischen Phasen werden vereinigt, m i t Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert u n d eingedampft. Der Riickstand wird m i t 100 ~l J~thanol aufgenommen und eingespritzt. Urin. Zur Bestimmung von p-l~itrophenol wird ein modifiziertes Verfahren nach van Eicken (t954) angewandt. 25 ml Urin, 10 ml Wasser u n d 5 ml konz. Salzs~ure werden 30 min ureter R/ickflul] gekocht. Naeh dem E r k a l t e n wird 2mal m i t je 30 ml Gemisch nach Lawford u. H a r v e y (t953) ausgesehiittelt. AnschlieBend wird 3real m i t je 2,5 ml 2 n Ammoniak reextrahiert. Die ammoniakalische Phase wird auf ca. 2 ml eingedampft und darm in einen 5 ml Mel]kolben iiberfiihrt. Nachdem m i t konz. Salzs/iure anges~uert wurde, wird a u f 5 ml aufgefiillt u n d diese L6sung eingespritzt. Versei/ung yon Parathion zu p-~Vitrophenol. J e nach Konzentration werden 5 bis l 0 ml einer P a r a t h i o n e n t h a l t e n d e n LSsung m i t I ml einer 33 %igen Natronlauge auf dem Wasserbad 15 m i n erhitzt. Naeh dem Abk/ihlen wird m i t ca. 0,8 ml konz. Salzs~ure anges~uert u n d die LSsung m i t Wasser in einen 25 ml Mei]kolben iibergesp/ilt u n d zur Marke anfgeffillt. Als Eich16sung dient eine LSsung yon 2 mg p-Nitrophenol in 1 ml _~thanol. UV-Spek~ralphotometer. Die Bestimmungen warden m i t einem Zeiss Spektralphotometer PMQ IImit

Monochromator M4Q I I in Glaskiivetten yon t cm Sehiehtdicke durchgefiihrt.

Gas-Chromatograph ie. 1. Quantitative P a r a t h i o n - B e s t i m m u n g -- Ger~t Perkin Elmer F 7 m i t F I D Detektor. :Die Metallsaule war 2,0 m lang m i t einem Durchmesser yon 4,65 ram. Packmaterial Kieselgur 60 bis 100 mesh, Belegung: Silikongummi SE 52/5 %. Tri~gergas N~; Verbrennungsgas Luft und H a. DurchfluB 50 ml/min. S/iulentemperatur 210 ~ C. 2. Qualitative Parathion-Bestimmung -- Gerat Perkin Elmer F 20 F E m i t ECD-Detektor. :Die Metalls~ule war 2,0 m lang m i t einem Durehmesser yon 0,125 Zoll. Packmaterial Chromosorb G 80 bis 1 0 0 m e s h , Belegung: Silikongummi SE 30/3%. Triigergas N2. DurchfluB 30 ml/min. S/iulentemperatur 180 ~ C.

Hochdruck-Fli~ssigkeitschromatographie. Wir verwendeten ein Ger/it Perkin Elmer 1250 mit UV-Detektor bei 254 nm. S~ule: P e r k i n E l m e r ODS Sil-X-II, Lange 50 cm, Durehmesser 2,6 mm, Druck 750 psi, Durchflui]geschwindigkeit 0,8 ml/min, Papiervorsehub 5 mm/min, mobile Phase f/ir Parathion. 50 % MeOH/50 % H20 bei 50 ~ C p-Nitrophenol, t0 % MeOH/90 % HuO bei 35 ~ C. Die S~ule h a t t e einen Glasmantel und wurde durch einen Umlaufthermostaten beheizt.

Nachweis yon Parathion und p-Nit.rophenol durch Hochdruckit~issigkeitsehromatographie 49

E

t

? P

B

I

t]min)6 5 4 3 2 ~ 0 Abb. I. Chromatogramm des Atherextraktes, gewonnen aus 100 ml Blur; P = Parathion, B = Begleitsubstanzen

|

1

1

t imin)6 5 4 3 2

0

Abb. 2..&therextrakt aus ].00 ml Blur, zusammen mit 0,5 ~g Parathion (P), B = Begleitsubstanzen

Ergebnisse und Diskussion

Parathion. Die Reteationszeit bei der F]fissigkeitsehromatograpt~e be~r~gt bei den angegebenen Bedingungen 4,4 rain, die Standardabweichung +_ 2,3%, die Erfassungsgreaze 25 Fg/ml (bei Einspritzung yon t ~l). Bei der Untersuehung des MageRinhaltes wurde eine geringere Konzentration gefunden, wena die iiberstehende LSsung direkt eingespritzt wurde, als wenn t g nach Kaiser u. Haag (1956) aufgearbeitet und diese LSsung dann direkt eingespritzt wurde. Eine Erkl/~rung dafiir kSnnte sein, dab Parathion im Fett besser 15slieh ist und somit zwischen Fliissigkeit und Bodensatz ein Konzentrationsunterschied vorlag. Die quantitative Bestimmung des nach Kaiser u. Haag (i956) aufgearbeiteten Mageninhaltes ergab im vorliegenden Fall einen Wert von 34,6 mg/ml. Ausgehend yon 67 ml l~agenAnhalt lag der Gesamtgehalt bei 2,32 g r~mem WJxkstoff Parathion. Durch die Gaschromatographie wurde die Konzentration zu 34,9, durch die Spektrophotometrie zu 35,9 mg/ml bestimmt. B/~umler u. Rippstein (i969) wiesen Parathion im Blur durch Gaschromatographie mit einem Halogen-Phosphor-Detektor nach. Die geringere Empfindliehkeit des UV-Detektors bei der Hochdruckfliissigkeitschromatographie versuchten wir auszugleichen, indem wir als Ausgangsma~erial i00 ml Blur einsetzten. Trotz vieler Begleitstoffe konnte Parathion identifiziert werden (Abb. i u. 2). Der Befund kormte auch gaschromatographisch best~tigt werden. P-Nitrophenol. Die Retentionszeit bei den angegebenen Bedingungen betrug 4,2 mira Die Standardabweichung war +_ 1,8%. Die Erfassungsgrenze lag bei 25 ~g/ml (bei Eiaspritzung yon l ~zl). Als innerer Standard karm 5-Phenyl-5-&thylbarbitursaure (Phenobarbital) verwendet werden (Abb. 3).

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:K. Harzer und R. Barehet

PNP

PNP

IE

t Ph

,

I

I

~

|

i

t(min)8 7 6 5 /~ 3 ~ ] 0 Abb. 3. Chromatogramm der Reinsubstanzen p-Nitrophenol (PNP) und Phenobarbital (Ph) als innerer Standard

J

t(min) 7 6 5 4 3 2 1 0 Abb. 4. Chromatogramm des Extraktes aus der aufgearbeiteten Niere. PNP = p-Nitrophenol, B = Begleitsubstanz

Da bei der verstorbenen Frau kein Urin zur Verffigung stand, wegen der bei Parathionintoxikationen h&ufig eintretenden Spontanmiktion (Quecke, t954), wurde die Niere auf p-Nitrophenol untersucht. Wie beim Blut stSren hier stark Begleitsubstanzen. P-Nitrophenol konnte aber dennoch als Aufsetzerpeak identifiziert werden (Abb. 4). I m Urin bei dem zweiten Fall war eine quantitative Bestimmung des p-Nitrophenols mSglich. Es wurden 6,3 ~g/ml (Ausgangsmaterial waren 25 ml Urin) gefunden. Auch dieses Ergebnis stimmte sehr gut mit dem durch spektralphotometrische Bestimmung gewonnenen, n&mlich 6,2 ~g/ml, fiberein. Eventuell im Urin vorhandenes p-Aminophenol stSrt den Nachweis nicht. Bei der Verseifung yon reinem Parathion zu p-Nitrophenol konnten 95 % des theoretischen Wertes gefunden werden, die Verseifung des Mageninhaltes ergab 89 % des erwarteten ~Vertes. I m Gegensatz zur Gaschromatographie k6nnen mit der Reverse-Phaset{ochdruck-Flfissigkeitschromatographie sowohl Parathion als auch der Metabolit p-Nitrophenol erfal3t werden. Die Empfindlichkeit der Methode kann durch einen variablen UV-Detektor, der auf die Wellenl~nge des Absorptionsmaximum yon Parathion oder p-Nitrophenol eingestellt wird, noch betr~chtlich gesteigert werden (Naundorf). Parathion-Methyl stSrt den Nachweis yon Parathion nicht. Bei den angegebenen Bedingungen besitzt es eine Retentionszeit yon 2,6 rain gegenfiber 4,4 rain yon Parathion. Auch Amino-parathion, in das Parathion in verwesendem 0rganmaterial durch Bakterien umgewandelt wird (Sperlich, ~969), stSrt nicht. Die Retentionszeit betr~gt 2,2 rain.

Nachweis yon Parathion und p-I~itrophenol durch Hochdruckflfissigkeitschromatographie 5i Pm ~,p

P

t(min)5

6, 3 2 1 0

Abb. 5. Chromatogramm der Reinsubstanzen :Parathion (P), Parathion-Methyl (Pro) und Amiaoparathion (Ap)

Es kSnnen also Parathion, Methylparathion 1 und Aminoparathion nebeneinander bestimmt werden (Abb. 5), wobei es sich empfiehlt, die Trennung yon Methyl-parathion und yon Aminoparathion bei 25~ start bei 50~ durchzufiihren. Die Retentionszeiten betragen dann 4,0 und 2,8 rain. Auch die Phosphors~ureester Demeton, Demeton-methyl, Dimethoat und Malathion haben wesentlich kiirzere Retentionszeiten als Parathion, so dab sie den Naehweis nieht beeintiussen. Wie bei der Gasehromatographie sollte aueh bei der Hochdruekfliissigkeitschromatographie zur Absieherung des Befundes noeh ein zweites System verwendet werden. Neben der Reverse-Phase-Chromatographie z. B. die Adsorptionsehromatographie. Es kSnnen aber aueh die Diinnsehichtehromatographie oder die iibliehen Vorproben (Sperlieh, t969) herangezogen werden. Herrn Dr. K~chele danken wir fiir die Durchfiihrung der Gaschromatographie und fiir viele Anregungen, Herrn Bogenrieder und Herrn und Frau Baumgartner ffir die technisehe Assistenz. Literatur

B~umler, J., l~ippstein, S.: Gaschromatographische Bestimmung yon Inscktiziden im Blur mit dem Halogen-Phosphor-Detektor. Arch. Toxikol. 2~, 57 (1969) v. Eieken, S.: Zur Ausseheidung yon p-Nitrol~henol im Urfn naeh Einwirkung von Pflanzenschutzmitt~! E 605. Angew. Chemie 66, 551 (~954) Gere, D. R., Majors, R. E.: Liquid-Liquid-Chromatography. In: Basic Liquid Chromatography, 4.2.2. Varian Aerograph 1971 Gudzinowicx, B. J.: Gaschromatographie analysis of drugs and pesticides. In: Chromatographic science series, Vol. 2, p. 428. London: Edward Arnold 1967 1 Eine Trennung yon Parathion und Parathion-Methyl ffihrten D. Randau und H. Bayer (1972) an Aluminiumoxyd dutch.

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K. Harzer und R. Barchet

Kaiser, H., Haag, Th.: Zum chemisch-toxikologischen Nachweis yon E 605 ,,Bayer" sowie einiger anderer Insektizide der Thiophosphorreihe. Arch. Pharm. (Weinheim) 289/61, 542 (1956) Lawford, D. M., Harvey, D. G. : The determination of p-nitrophenol in urine and in blood by the indophenol-reaction. Analyst 78, 63 (1952) :Naundorf, G. : Pers. Mitteilung, Bodenseewerk Perkin-Elmer, Bfiro Frankfurt Queck, K.: Das Pr~parat E 605, S. 25, Remscheid-Lermep: Dustri 1954 Randau, D., Bayer, H.: Flfissigkeitschromatographie an Aluminiumoxid. J. Chromat. 66, 382 (1972) Stair, J. A.: Reversed-phase partition. In: Modem practice of liquid chromatography, Ed. J. J. Kirkland, pp. 381--384. New York-London-Sidney-Toronto:J. Wiley and Sons 1971 Sperlich, H.: Forensisch-chemischer Nachweis yon Insektiziden. In: Gadamers Lehrbuch der chemisehen Toxikologie and Anleitung zur Ausmittelung der Gifte, Band I, Ed. F. R. Preuss, pp. 555--579. GSrrhlgen: Vandenhoek und Ruprecht 1969 Dr. Klaus ttarzer Chemisches Untersuchungsamt der Stadt Stuttgart D-7000 Stuttgart 1 Stafflenbergstr. 81 Bundesrepublik Deutschland