Zeitschrift fur
LebensmittelUntersuchung und-Forschung
Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 163, 2 5 7 4 5 9 (1977)
@ J. F. Bergmann-Verlag 1977
Bedeutung der Cyanglykoside fiir den Benzylalkoholgehalt in Kirschbriinden Rainer Tuttas und Adolf Nahrstedt* Institut ffir Pharmazeutische Biologie der Universit~t Freiburg i. Br., Sch~inzlestr. 1, D-7800 Freiburg
Correlation of Cyanogenic Glycosides with Content of Benzyl Alcohol in Cherry Brandies Summary. A clear correlation between cyanogenic glycosides and the content of benzyl alcohol in fermented mash of cherries was indicated by model experiments with amygdalin and fermenting yeasts, cherry-stones with and without fermenting yeasts as well as bitter and sweet almonds. These correlations proofed that benzyl alcohol has to be regarded as a metabolic product of mandelonitrileglycosides. Zusammenfassung. Modellversuche mit Amygdalin und g~irender Hefe, Ans~itze mit Kirschsteinen mit und ohne g~irende Here sowie Hefeg~irans~itze mit bitteren und stil3en Mandeln ergeben eine eindeutige Korrelation zwischen dem Gehalt an Benzaldehydcyanhydringlykos'iden des G~iransatzes und dem Gehalt an Benzylalkohol der durchgegorenen Maische. Die Abh~ingigkeiten belegen, dab Benzylalkohol als Metabolisierungsprodukt der Benzaldehydcyanhydringlykoside durch Hefen anzusehen ist.
da3 weder eine de-novo-Synthese im Verlauf einef reiuen Zuckerg~irung erfolgt noch im Fruchtfleisch enthaltene Benzoes~iure zu Benzylalkohol reduziert wird. Eine weitere Vorstufe, die bisher nicht beachtet wurde, stellt Benzaldehyd dar, der neben Glucose und Blaus~iure nach enzymatischer Hydrolyse [2] aus den in der Frucht enthaltenen Benzaldehydcyanhydringlykosiden Prunasin und - - quantitativ stark iiberwiegend - - Amygdalin [3] entsteht. Bereits 1921 hatten Neuberg u. Hirsch [4] und sp~iter Ose u. Hironaka [5] sowie Tamura [6] beobachtet, dab g~irende Hefen extern zugefiihrten Benzaldehyd mit elher Ausbeute von ca. 50% zu Benzylalkohol neben weiteren Stoffwechselprodukten [ 4 4 1 umsetzen. Die Reaktion ist enzymatisch katalysiert; eine einfache Disproportionierung yon Benzaldehyd, wie von Mohler u. H~immerle [7] vorgeschlagen, scheidet auch nach unseren Versuchen aus. Im folgenden wird untersucht, welche Bedeutung den Cyanglykosiden als metabolische Vorstufe ftir Benzylalkohol in Kirschmaischen zukommt.
Material und Methoden 1. Hefen: Modellgiirans~itze mit Wildhefen aus angegorener Maische der Firma Schladerer/Staufen. 2. KirschjH~chte: Friichte bzw. Samen der Sorte Hedelfinger aus dem Sifdschwarzwald. Zur Lagerung die Frucht vom Stiel trennen, entsteinen und sofort in flfissigem Stickstoff tiefgefrieren. 3. Standardgiiransatz: 150 ml 15%ige Saccharose-L6sung, 20 ml Hefesuspension und 0,5 g eines N~ihrpriiparates (G~irfix), in 200 ml Erlenmeyerk61bchen mit Mikrog~irr/Shrchen; Dauer 9 his 11 Tage.
Einleitung Benzylalkohol ist als Aromakomponente zu ca. 0,14 mmol/l in Kirschbr~inden enthalten. Er ist im genuinen Aromabukett der Kirsche nicht nachweisbar; die vergorene Maische dagegen enth~ilt ca. 0,45 mmoI/kg. Ftir die Herkunft des Benzylalkohols in Steinobstbr~inden wird Phenylgiycin diskutiert [11, nachdem Ehrlich zu Beginn dieses Jahrhunderts beobachtet hatte, dab g~irende Hefen verschiedene Aminos~iuren nach Desaminierung und Decarboxylierung zu den korrespondierenden Alkoholen umsetzen k/Snnen. Wir konnten Phenylglycin in der Kirschfrucht jedoch weder in der Fraktion der freien noch der proteingebundenen Aminosfiuren gaschromatographisch nachweisen. Damit ist die Frage nach der Herkunft des Benzylalkohols often. Vorversuche mit Modellg~irungen zeigten, * Herrn Dr. F.Beye danken wir fiir anregende Diskussionen, Frau G. Siudzinski ffir technische Hilfe
4. Extraktionen: Von den durchgegorenen Ans~itzen die Hefe abzentrifugieren, L6sungen mit Pentan/Dichlormethan (2 + 1) 24 Std lang in einem modifizierten Extraktor nach Kutscher-Steudel [81 extrahieren. Extrakte im Wasserbad mit einem Kuderna-DanischKolben [9] fiber eine Vigreux-Kolonne bei 32~ C auf ca. 5 ml einengen. 5. Bestimmung yon Benzaldehyd und Benzylalkohol: Qualitativ und quantitativ gaschromatographisch mit FFAP als station~irer Phase [10]. Innerer Standard: Octanol-2, Standardkorrekturfaktoren: Benzaldehyd 0,86 + 7,2%, Benzylalkohol 0,75_4_6,9%. - - Auswertung dutch Planimetrieren. 6. Quantitativ e Bestimmun 9 yon Amygdalin: Bestimmung tiber die quantitative Messung der enzymatisch abspaitbaren Blaus~iure [111. Im reifen Samen liegen ca. 95% der freisetzbaren Blaus~iure in
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R.Tuttas und A. Nahrstedt: Bedeutung der Cyanglykoside ffir den Benzylalkoholgehalt in Kirschbr~inden
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2. Umsetzung yon Amygdalin dutch giirende Hefen
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1.0
die Ausbeute an Benzylalkohol mit ca. 50% konstant. Sie f~illt ab 1,6 mmol zuriick; ab 3,2 mmol ist kein Benzylalkohol mehr nachweisbar, eine G~irung findet nicht mehr statt. Derartige Ans~itze enthalten dagegen steigende Mengen an Benzoes~ure unter Abnahme des zugesetzten Benzaldehyd.
.
A
1.5 mMol. ~,mygdatin. (zugesetztl
ABE1. Ausbeuten an Benzylalkohol ( - - - - - - ) , Restmengen an Benzaldehyd (--.--.--) und Umsatz an Amygdalin ( . ) bei variablem Amygdalingehalt. - - A = in Standardg~irans~itzen ohne flGlucosidase, B = in Standardg~rans~itzen mit je 1 mg fl-Glucosidase
Amygdalin vor, ca. 5% im Monoglucosid Prunasin [-3]. Beide Glykoside liefern jeweils ein Aquivalent Benzaldehyd und Cyanid; bei einer Wiedergabe der quantitativen Verh~iltnisse in Molaritgten tritt deshalb kein Fehler auf. Der Einfachheit halber wird der Gesamtcyanglykosidgehalt der Samen als Amygdalin bezeichnet. 7. Test auf enzymatisch abspaltbare Blausiiure: Etwa 0,5--1 g frisch zerkleinertes Untersuchungsgut in einem 25ml fassenden verschlieBbaren Glasgefal3 sofort mit 1 2 ml Citratpuffer (pH 6) und 1 mg fl-Glucosidase (reinst, Serva) versetzen und mit dem Deckel ein Testpapier nach FeigI-Anger [12] fiber der Flfissigkeit befestigen. Blaus~ureentwicklung durch Blauf'~irbung des Papiers. Absolute Erfassungsgrenze ca. 50 ng Cyanid. 8. AusschluJ3 yon Phenylglycin: Die 15sliche Aminos~iurefraktion in Fruchtfleisch und Samen dm'ch Aethanolextraktion, die proteingebundenen Arninosiiuren nach Hydrolyse des gefriergetrockneten Materials in 6 n-HC1 gewinnen, nach [-13] reinigen und isolieren und im wesentlichen nach [14] gaschromatographisch untersuchen. Phenylglycin war in keinem der Extrakte nachweisbar. 9. Sterilisierun 9 der Kirschsteine: Die Kirschsteine durch Eintauchert (5 min) in 96%iges Aethanol sterilisieren. Zur Kontrolle der stefilen Bedingungen die entsprechenden Ans~tze vor der Extraktion zentrifugieren und das Zentrifugat mikroskopisch auf Hefezellen fiberprfifen. Hefezellen waren in keinem der Ans~itze nachweisbar. 10. Diinnschichtchromatographie (Benzoesiiure) : Merck-Fertigplatten, Kieselgel 60-F 254. - - Mobile Phase: n-Butanol/Aethanol/Ammoniak/Wasser (40 + 15 + 5 + 10). - - Auftragemengen: 2 gl 1% ige Benzoes~iure in Methanol; 2, 6, 10 ~tl Extrakt.
Ergebnisse und Diskussion 1. Reduktion yon Benzaldehyd durch 9i#ende Helen Die von uns verwendeten Wildhefen metabolisieren Benzaldehyd in Standardg~irans~itzen ebenso wie die in [ ~ ] verwendeten St~imme. Bis zu einer Konzentration von 1,6 mmol Benzaldehyd im Ansatz bleibt
G/irenden Hefeans~itzen in steigender Konzentration zugegebenes Amygdalin wird zu etwa 60% yon der Hefe hydrolysiert (Abb. 1). Dabei tritt Benzylalkohol zu 47% bezogen auf hydrolysiertes Amygdalin auf. Dieser Weft deckt sich sehr gut mit der bei der Reduktion von Benzaldehyd erhaltenen Ausbeute von ca. 50% Benzylalkohol. Bezogen auf das insgesamt angebotene Amygdalin betr~igt die Ausbeute an Benzylalkohol 32%. Trotz durchgegorener Ans~itze bleibt eine Restmenge yon ca. 10% Benzaldehyd zuriick. Wit nehmen an, dab dies auf einen die Reduktion hemmenden Effekt der bei der Hydrolyse von Amygdalin entstehenden Blaus~iure zurtickzufiihren ist. Tats~ichlich sinkt bei konstanter Benzaldehydmenge (1 mmol) die Ausbeute an Benzylalkohol mit zunehmender KCN-Konzentration ab: Sie betr~gt bei 0,5 mmol KCN im Ansatz 35%, bei 1 mmol 20% des eingesetzten Benzaldehyds. Ab 2 mmol KCN ist kein Benzylalkohol mehr nachweisbar. Ein ghnlicher Effekt wird beobachtet, wenn g~irenden Hefeans~itzen Amygdalin zusammen mit fl-Glucosidase zugesetzt und damit die Hydrolyse von Amygdalin wesentlich beschleunigt wird (Abb. 1). Hier werden zwar 93% des angebotenen Amygdalins hydrolysiert, jedoch nur 35% des umgesetzten Amygdalins als Benzylalkohol wiedergefunden. Gleichzeitig bleiben ca. 25% Benzaldehyd zudick. 3. Giiransiitze rnit Kirschsteinen In Ans~itzen mit oberfl~ichensterilisierten Kirschsteinen (je 10, Same + Endocarp) in sterilisiertem Wasser konnte nach 4, 8 bzw. 16 Tagen weder Benzaldehyd noch Benzylalkohol nachgewiesen werden. Der gleiche Versuch in Gegenwart von g~irenden Hefen ergab nach 16 Tagen einen Gehalt an Benzylalkohol von 0,013 retool. Frische Kirschsamen enthalten durchschnittlich 0,052 mmol/g Amygdalin [3], w~ihrend das Endocarp frei yon Cyanglykosiden ist. Bei einem Durchschnittsgewicht von 88 mg/Same wurden im o.a. Versuch insgesamt 0,046 mmol Amygdalin angeboten. Die erhaltene Ausbeute von 0,013 mmol Benzylalkohol entspricht 28%, bezogen auf das verftigbare Amygdalin. Die Versuche zeigen, dab bei frischen, unverletzten Kirschsteinen Helen zur Produktion von Benzylalko-
R.Tuttas und A. Nahrstedt: Bedeutung der Cyanglykoside ftir den Benzylalkoholgehalt in Kirschbr/inden
hol notwendig sind, und dab Helen offenbar in der Lage sind, das Endocarp sowie die Samenschale, das Endosperm- und das Cotyledonengewebe zu durchdringen und deren Inhaltsstoffe zu metabolisieren. Die Kirschsteine durchgegorener Ans~itze besitzen ein brtichiges Endocarp und geschrumpfte, weiche Samen, die praktisch kein Cyanglykosid mehr enthalten (Test auf enzymatisch abspaltbare Blaus~iure verl~iuft negativ). Offensichtlich besitzt aber auch die Kirsche selbst Enzymsysteme, die den durch sameneigene fi-Glucosidasen freigesetzten Benzaldehyd reduzieren k6nnen. Durch Tiefgefrierung verletzte Kirschsteine entwickelten in sterilen Ans~itzen mit Wasser in Abh~ingigkeit vonder Zahl der Steine steigende Mengen Benzylalkohol. Bezogen auf den Gehalt an Cyanglykosid errechnet sich eine Ausbeute von ca. 20% Benzylalkohol. Dieses Experiment liefert gleichzeitig einen Ansatzpunkt ftir das metabolische Schicksal der aromatischen Hydrolysekomponente bei einem Umsatz yon Benzaldehydcyanhydringlykosiden im intakten Gewebe, wie er z.B. bei Sorghum vulgare ffir Dhurrin nachgewiesen wurde [ 15].
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Abbau der Glykoside stattfindet. Erst nach Wasseraufnahme setzt die enzymatische Hydrolyse ein, haupts~ichlich durch sameneigene Enzymsysteme. Die Hydrolyseprodukte werden wegen der Endosperm[17], Samenschalen- und Endocarpbarriere jedoch normalerweise erst nach deren Verrottung frei. Helen sind offensichtlich befiihigt, diese Barrieren zu zerstSren, die Inhaltsstoffe der Samen zu nutzen und dabei Metabolisierungsprodukte zu bilden, die im Destillat der Maischen als Aromakomponenten auftauchen. Dieser Aspekt sollte besonders bei der Beurteilung solcher Kirschbdinde berticksichtigt werden, die - wie es am Markt beobachtet wurde [18] - - aus Kirschs~iften hergestellt werden. Zwar enth~ilt auch das Fruchtfleisch der Kirsche Amygdalin und Prunasin, jedoch in sehr geringer Menge yon 0,0007 mmol/g Trockensubstanz [3]. Es ist daher nicht erstaunlich, dab in aus Kirschs~iften hergestellten Bdinden Benzylalkohol allenfalls in Spuren nachweisbar ist [18]. Es ist zu erwarten, dab ~ihnliche Verh~iltnisse auch fiir andere Steinobstarten bestehen, wie Zwetschgen, Pflaumen, Mirabellen, Aprikosen und Pfirsiche.
4. Giiransiitze mit bitteren und stiffen Mandeln Zur Best~itigung der Korrelation Benzaldehydcyanhydringlykosid-Benzylalkohol wurden dem Kirschsamen ~ihnliche biologische Systeme ausgew~ihlt, deren Inhaltsstoffe sich im wesentlichen nur durch das Vorhandensein (= bittere Mandeln) bzw. die Abwesenheit (= stige Mandeln) von Amygdalin unterscheiden [16]. Durch Verg~iren yon je 10 unzerkleinerten Mandeln in Standardg~irans~itzen wurden bei bitteren Mandeln 0,022 mmol Benzylalkohol/g gefunden. Im G~iransatz der siigen Mandeln war Benzylalkohol nicht nachweisbar. Die verwendeten bitteren Mandeln enthielten 0,094 mmol/g Amygdalin; die Ausbeute an Benzylalkohol betr~igt danach 23,5%, bezogen auf das angebotene Cyanglykosid. Es besteht demnach sowohl im Modellsystem (Amygdalin) als auch in den getesteten biologischen Systemen (Kirschsamen, bittere/siil3e Mandeln) eine eindeutige Korrelation zwischen dem Gehalt an Benzaldehydcyanhydringlykosiden und der Ausbeute an Benzylalkohol nach erfolgter G/irung. Insbesondere das Ergebnis mit bitteren und stiBen Mandeln zeigt, dab fiir das Auftreten yon Benzylalkohol in der Maische derartige Cyanglykoside notwendig sind. Es ist anzunehmen, dab im Ruhezustand der Samen kein
Literatur 1. Suomalainen, H., Kauppila, O., Nyk~inen, L., PeItonen, R.J.: Handbch. d. Lebensmittelchemie, Bd. VII, p. 597, Berlin-Heidelberg-New York: Springer 1968 2. Haisman, D.R., Knight, P.J.: Biochem. J. 103, 528 (1967) 3. Nahrstedt, A.: Phytochemistry 11, 3121 (1972) 4. Neuberg, G., Hirsch, J.: Biochem. Z. 115, 282 (1921) 5. Ose, S., Hironaka, J. : Proc. Intern. Symp. on Enzyme Chemistry. Tokyo and Kyoto 1957, New York: Academic Press 1958 6. Tamura, A.: Presented at the Symposium on Chemistry, Tokyo, Jan. 1957 (zit. nach 5) 7. Mohler, H., H~immerle, W.: Z. Unters. Lebensm. 72, 504 (1936) 8. Gattermann-Wieland: Die Praxis des organischen Chemikers. Teil I, Berlin : Walter de Gruyter 1972 9. Misselhorn, K., Haeseler, G., Nosko, St., Kummer, H.: Branntweinwirtschaft 108, 107 (1968) 10. Tuttas, R., Beye, F.: Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 155, 88 (1974) 11. KrSller, E.: Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 127, 130 (1965) 12. Feigl, F., Anger, V. : Analyst 91,282 (1966) 13. Salminen, K_, Koivistoinen, P.: Act. Chem. Scand. 23, 999 (I969) 14. Gehrke, C. W. : J. Chromatogr. 45, 24 (1969) 15. Bough, W. A., Gander, J. E. : Phytochemistry 10, 67 (1971) 16. Berger, F.: Handbuch der Drogenkunde, Bd. VI, p. 178 und 183, Wien: W.Maudrich 1964 17. Hess, D.: Pflanzenphysiologie, p. 281, Stuttgart: F. Ulmer 1970 18. Nosko, St. : Chem. LUA Offenburg, priv. Mitteilung
Eingegangen am 29. September 1976
LebensmittelUntersuchung und-Forschung
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@ J. F. Bergmann-Verlag 1977
Bedeutung der Cyanglykoside fiir den Benzylalkoholgehalt in Kirschbriinden Rainer Tuttas und Adolf Nahrstedt* Institut ffir Pharmazeutische Biologie der Universit~t Freiburg i. Br., Sch~inzlestr. 1, D-7800 Freiburg
Correlation of Cyanogenic Glycosides with Content of Benzyl Alcohol in Cherry Brandies Summary. A clear correlation between cyanogenic glycosides and the content of benzyl alcohol in fermented mash of cherries was indicated by model experiments with amygdalin and fermenting yeasts, cherry-stones with and without fermenting yeasts as well as bitter and sweet almonds. These correlations proofed that benzyl alcohol has to be regarded as a metabolic product of mandelonitrileglycosides. Zusammenfassung. Modellversuche mit Amygdalin und g~irender Hefe, Ans~itze mit Kirschsteinen mit und ohne g~irende Here sowie Hefeg~irans~itze mit bitteren und stil3en Mandeln ergeben eine eindeutige Korrelation zwischen dem Gehalt an Benzaldehydcyanhydringlykos'iden des G~iransatzes und dem Gehalt an Benzylalkohol der durchgegorenen Maische. Die Abh~ingigkeiten belegen, dab Benzylalkohol als Metabolisierungsprodukt der Benzaldehydcyanhydringlykoside durch Hefen anzusehen ist.
da3 weder eine de-novo-Synthese im Verlauf einef reiuen Zuckerg~irung erfolgt noch im Fruchtfleisch enthaltene Benzoes~iure zu Benzylalkohol reduziert wird. Eine weitere Vorstufe, die bisher nicht beachtet wurde, stellt Benzaldehyd dar, der neben Glucose und Blaus~iure nach enzymatischer Hydrolyse [2] aus den in der Frucht enthaltenen Benzaldehydcyanhydringlykosiden Prunasin und - - quantitativ stark iiberwiegend - - Amygdalin [3] entsteht. Bereits 1921 hatten Neuberg u. Hirsch [4] und sp~iter Ose u. Hironaka [5] sowie Tamura [6] beobachtet, dab g~irende Hefen extern zugefiihrten Benzaldehyd mit elher Ausbeute von ca. 50% zu Benzylalkohol neben weiteren Stoffwechselprodukten [ 4 4 1 umsetzen. Die Reaktion ist enzymatisch katalysiert; eine einfache Disproportionierung yon Benzaldehyd, wie von Mohler u. H~immerle [7] vorgeschlagen, scheidet auch nach unseren Versuchen aus. Im folgenden wird untersucht, welche Bedeutung den Cyanglykosiden als metabolische Vorstufe ftir Benzylalkohol in Kirschmaischen zukommt.
Material und Methoden 1. Hefen: Modellgiirans~itze mit Wildhefen aus angegorener Maische der Firma Schladerer/Staufen. 2. KirschjH~chte: Friichte bzw. Samen der Sorte Hedelfinger aus dem Sifdschwarzwald. Zur Lagerung die Frucht vom Stiel trennen, entsteinen und sofort in flfissigem Stickstoff tiefgefrieren. 3. Standardgiiransatz: 150 ml 15%ige Saccharose-L6sung, 20 ml Hefesuspension und 0,5 g eines N~ihrpriiparates (G~irfix), in 200 ml Erlenmeyerk61bchen mit Mikrog~irr/Shrchen; Dauer 9 his 11 Tage.
Einleitung Benzylalkohol ist als Aromakomponente zu ca. 0,14 mmol/l in Kirschbr~inden enthalten. Er ist im genuinen Aromabukett der Kirsche nicht nachweisbar; die vergorene Maische dagegen enth~ilt ca. 0,45 mmoI/kg. Ftir die Herkunft des Benzylalkohols in Steinobstbr~inden wird Phenylgiycin diskutiert [11, nachdem Ehrlich zu Beginn dieses Jahrhunderts beobachtet hatte, dab g~irende Hefen verschiedene Aminos~iuren nach Desaminierung und Decarboxylierung zu den korrespondierenden Alkoholen umsetzen k/Snnen. Wir konnten Phenylglycin in der Kirschfrucht jedoch weder in der Fraktion der freien noch der proteingebundenen Aminosfiuren gaschromatographisch nachweisen. Damit ist die Frage nach der Herkunft des Benzylalkohols often. Vorversuche mit Modellg~irungen zeigten, * Herrn Dr. F.Beye danken wir fiir anregende Diskussionen, Frau G. Siudzinski ffir technische Hilfe
4. Extraktionen: Von den durchgegorenen Ans~itzen die Hefe abzentrifugieren, L6sungen mit Pentan/Dichlormethan (2 + 1) 24 Std lang in einem modifizierten Extraktor nach Kutscher-Steudel [81 extrahieren. Extrakte im Wasserbad mit einem Kuderna-DanischKolben [9] fiber eine Vigreux-Kolonne bei 32~ C auf ca. 5 ml einengen. 5. Bestimmung yon Benzaldehyd und Benzylalkohol: Qualitativ und quantitativ gaschromatographisch mit FFAP als station~irer Phase [10]. Innerer Standard: Octanol-2, Standardkorrekturfaktoren: Benzaldehyd 0,86 + 7,2%, Benzylalkohol 0,75_4_6,9%. - - Auswertung dutch Planimetrieren. 6. Quantitativ e Bestimmun 9 yon Amygdalin: Bestimmung tiber die quantitative Messung der enzymatisch abspaitbaren Blaus~iure [111. Im reifen Samen liegen ca. 95% der freisetzbaren Blaus~iure in
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R.Tuttas und A. Nahrstedt: Bedeutung der Cyanglykoside ffir den Benzylalkoholgehalt in Kirschbr~inden
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2. Umsetzung yon Amygdalin dutch giirende Hefen
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die Ausbeute an Benzylalkohol mit ca. 50% konstant. Sie f~illt ab 1,6 mmol zuriick; ab 3,2 mmol ist kein Benzylalkohol mehr nachweisbar, eine G~irung findet nicht mehr statt. Derartige Ans~itze enthalten dagegen steigende Mengen an Benzoes~ure unter Abnahme des zugesetzten Benzaldehyd.
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Amygdalin vor, ca. 5% im Monoglucosid Prunasin [-3]. Beide Glykoside liefern jeweils ein Aquivalent Benzaldehyd und Cyanid; bei einer Wiedergabe der quantitativen Verh~iltnisse in Molaritgten tritt deshalb kein Fehler auf. Der Einfachheit halber wird der Gesamtcyanglykosidgehalt der Samen als Amygdalin bezeichnet. 7. Test auf enzymatisch abspaltbare Blausiiure: Etwa 0,5--1 g frisch zerkleinertes Untersuchungsgut in einem 25ml fassenden verschlieBbaren Glasgefal3 sofort mit 1 2 ml Citratpuffer (pH 6) und 1 mg fl-Glucosidase (reinst, Serva) versetzen und mit dem Deckel ein Testpapier nach FeigI-Anger [12] fiber der Flfissigkeit befestigen. Blaus~ureentwicklung durch Blauf'~irbung des Papiers. Absolute Erfassungsgrenze ca. 50 ng Cyanid. 8. AusschluJ3 yon Phenylglycin: Die 15sliche Aminos~iurefraktion in Fruchtfleisch und Samen dm'ch Aethanolextraktion, die proteingebundenen Arninosiiuren nach Hydrolyse des gefriergetrockneten Materials in 6 n-HC1 gewinnen, nach [-13] reinigen und isolieren und im wesentlichen nach [14] gaschromatographisch untersuchen. Phenylglycin war in keinem der Extrakte nachweisbar. 9. Sterilisierun 9 der Kirschsteine: Die Kirschsteine durch Eintauchert (5 min) in 96%iges Aethanol sterilisieren. Zur Kontrolle der stefilen Bedingungen die entsprechenden Ans~tze vor der Extraktion zentrifugieren und das Zentrifugat mikroskopisch auf Hefezellen fiberprfifen. Hefezellen waren in keinem der Ans~itze nachweisbar. 10. Diinnschichtchromatographie (Benzoesiiure) : Merck-Fertigplatten, Kieselgel 60-F 254. - - Mobile Phase: n-Butanol/Aethanol/Ammoniak/Wasser (40 + 15 + 5 + 10). - - Auftragemengen: 2 gl 1% ige Benzoes~iure in Methanol; 2, 6, 10 ~tl Extrakt.
Ergebnisse und Diskussion 1. Reduktion yon Benzaldehyd durch 9i#ende Helen Die von uns verwendeten Wildhefen metabolisieren Benzaldehyd in Standardg~irans~itzen ebenso wie die in [ ~ ] verwendeten St~imme. Bis zu einer Konzentration von 1,6 mmol Benzaldehyd im Ansatz bleibt
G/irenden Hefeans~itzen in steigender Konzentration zugegebenes Amygdalin wird zu etwa 60% yon der Hefe hydrolysiert (Abb. 1). Dabei tritt Benzylalkohol zu 47% bezogen auf hydrolysiertes Amygdalin auf. Dieser Weft deckt sich sehr gut mit der bei der Reduktion von Benzaldehyd erhaltenen Ausbeute von ca. 50% Benzylalkohol. Bezogen auf das insgesamt angebotene Amygdalin betr~igt die Ausbeute an Benzylalkohol 32%. Trotz durchgegorener Ans~itze bleibt eine Restmenge yon ca. 10% Benzaldehyd zuriick. Wit nehmen an, dab dies auf einen die Reduktion hemmenden Effekt der bei der Hydrolyse von Amygdalin entstehenden Blaus~iure zurtickzufiihren ist. Tats~ichlich sinkt bei konstanter Benzaldehydmenge (1 mmol) die Ausbeute an Benzylalkohol mit zunehmender KCN-Konzentration ab: Sie betr~gt bei 0,5 mmol KCN im Ansatz 35%, bei 1 mmol 20% des eingesetzten Benzaldehyds. Ab 2 mmol KCN ist kein Benzylalkohol mehr nachweisbar. Ein ghnlicher Effekt wird beobachtet, wenn g~irenden Hefeans~itzen Amygdalin zusammen mit fl-Glucosidase zugesetzt und damit die Hydrolyse von Amygdalin wesentlich beschleunigt wird (Abb. 1). Hier werden zwar 93% des angebotenen Amygdalins hydrolysiert, jedoch nur 35% des umgesetzten Amygdalins als Benzylalkohol wiedergefunden. Gleichzeitig bleiben ca. 25% Benzaldehyd zudick. 3. Giiransiitze rnit Kirschsteinen In Ans~itzen mit oberfl~ichensterilisierten Kirschsteinen (je 10, Same + Endocarp) in sterilisiertem Wasser konnte nach 4, 8 bzw. 16 Tagen weder Benzaldehyd noch Benzylalkohol nachgewiesen werden. Der gleiche Versuch in Gegenwart von g~irenden Hefen ergab nach 16 Tagen einen Gehalt an Benzylalkohol von 0,013 retool. Frische Kirschsamen enthalten durchschnittlich 0,052 mmol/g Amygdalin [3], w~ihrend das Endocarp frei yon Cyanglykosiden ist. Bei einem Durchschnittsgewicht von 88 mg/Same wurden im o.a. Versuch insgesamt 0,046 mmol Amygdalin angeboten. Die erhaltene Ausbeute von 0,013 mmol Benzylalkohol entspricht 28%, bezogen auf das verftigbare Amygdalin. Die Versuche zeigen, dab bei frischen, unverletzten Kirschsteinen Helen zur Produktion von Benzylalko-
R.Tuttas und A. Nahrstedt: Bedeutung der Cyanglykoside ftir den Benzylalkoholgehalt in Kirschbr/inden
hol notwendig sind, und dab Helen offenbar in der Lage sind, das Endocarp sowie die Samenschale, das Endosperm- und das Cotyledonengewebe zu durchdringen und deren Inhaltsstoffe zu metabolisieren. Die Kirschsteine durchgegorener Ans~itze besitzen ein brtichiges Endocarp und geschrumpfte, weiche Samen, die praktisch kein Cyanglykosid mehr enthalten (Test auf enzymatisch abspaltbare Blaus~iure verl~iuft negativ). Offensichtlich besitzt aber auch die Kirsche selbst Enzymsysteme, die den durch sameneigene fi-Glucosidasen freigesetzten Benzaldehyd reduzieren k6nnen. Durch Tiefgefrierung verletzte Kirschsteine entwickelten in sterilen Ans~itzen mit Wasser in Abh~ingigkeit vonder Zahl der Steine steigende Mengen Benzylalkohol. Bezogen auf den Gehalt an Cyanglykosid errechnet sich eine Ausbeute von ca. 20% Benzylalkohol. Dieses Experiment liefert gleichzeitig einen Ansatzpunkt ftir das metabolische Schicksal der aromatischen Hydrolysekomponente bei einem Umsatz yon Benzaldehydcyanhydringlykosiden im intakten Gewebe, wie er z.B. bei Sorghum vulgare ffir Dhurrin nachgewiesen wurde [ 15].
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Abbau der Glykoside stattfindet. Erst nach Wasseraufnahme setzt die enzymatische Hydrolyse ein, haupts~ichlich durch sameneigene Enzymsysteme. Die Hydrolyseprodukte werden wegen der Endosperm[17], Samenschalen- und Endocarpbarriere jedoch normalerweise erst nach deren Verrottung frei. Helen sind offensichtlich befiihigt, diese Barrieren zu zerstSren, die Inhaltsstoffe der Samen zu nutzen und dabei Metabolisierungsprodukte zu bilden, die im Destillat der Maischen als Aromakomponenten auftauchen. Dieser Aspekt sollte besonders bei der Beurteilung solcher Kirschbdinde berticksichtigt werden, die - wie es am Markt beobachtet wurde [18] - - aus Kirschs~iften hergestellt werden. Zwar enth~ilt auch das Fruchtfleisch der Kirsche Amygdalin und Prunasin, jedoch in sehr geringer Menge yon 0,0007 mmol/g Trockensubstanz [3]. Es ist daher nicht erstaunlich, dab in aus Kirschs~iften hergestellten Bdinden Benzylalkohol allenfalls in Spuren nachweisbar ist [18]. Es ist zu erwarten, dab ~ihnliche Verh~iltnisse auch fiir andere Steinobstarten bestehen, wie Zwetschgen, Pflaumen, Mirabellen, Aprikosen und Pfirsiche.
4. Giiransiitze mit bitteren und stiffen Mandeln Zur Best~itigung der Korrelation Benzaldehydcyanhydringlykosid-Benzylalkohol wurden dem Kirschsamen ~ihnliche biologische Systeme ausgew~ihlt, deren Inhaltsstoffe sich im wesentlichen nur durch das Vorhandensein (= bittere Mandeln) bzw. die Abwesenheit (= stige Mandeln) von Amygdalin unterscheiden [16]. Durch Verg~iren yon je 10 unzerkleinerten Mandeln in Standardg~irans~itzen wurden bei bitteren Mandeln 0,022 mmol Benzylalkohol/g gefunden. Im G~iransatz der siigen Mandeln war Benzylalkohol nicht nachweisbar. Die verwendeten bitteren Mandeln enthielten 0,094 mmol/g Amygdalin; die Ausbeute an Benzylalkohol betr~igt danach 23,5%, bezogen auf das angebotene Cyanglykosid. Es besteht demnach sowohl im Modellsystem (Amygdalin) als auch in den getesteten biologischen Systemen (Kirschsamen, bittere/siil3e Mandeln) eine eindeutige Korrelation zwischen dem Gehalt an Benzaldehydcyanhydringlykosiden und der Ausbeute an Benzylalkohol nach erfolgter G/irung. Insbesondere das Ergebnis mit bitteren und stiBen Mandeln zeigt, dab fiir das Auftreten yon Benzylalkohol in der Maische derartige Cyanglykoside notwendig sind. Es ist anzunehmen, dab im Ruhezustand der Samen kein
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Eingegangen am 29. September 1976
