H. H. Dietrichs und H. Funke

102

höherer Anti-Schwindungs-Wirkung ergab als Polymethylmethacrylat. Acknowledgements The authors thank Dr. F. L. Dalton, Wantage Research Laboratories, for advice and for arranging and carrying out the irradiations. This paper is published by permission of the Ministry of Technology. References (1) E. J. Gibson, R. A. Laidlaw and G. A. Smith, J. Appl. Chem., 1966,16, 58. (2) J. A. Kent, A. Winston, W. R. Boyle, W. Loos and J. E. Ayres, "Preparation of Wood-Plastic Combinations using Gamma Radiation, Interim Rep. ORO-628", 1965 (U. S. Atomic Energy Commission). (3) A. M. Feibush, "Research on Applications of Radiationinduced Reactions in Gases, Rep. No. -3334- ", 1965 (U. S. Atomic Energy Commission). (43) J. C. Evans, D. M. Egan, P. R. McDonald, C. H. Collins and J. Knopp, Rep. No. NYO-35Ö9-I, 1965 (U. S. Atomic Energy Commission). (4b) R. H. Gifford and L. R. Quarles, Rep. No. TID22774, 1966 (U. S. Atomic Energy Commission). (5) J. H. Frankfort and K. M. Black, Rep. No. KLX-I876 (1966) (U. S. Atomic Energy Commission).

Holzforschung

(6) R. A. V. R a f f , I. W. Herrick and M. F. Adams, Forest Prod. J., 1965, 15, 260. (7) J. F. Siau, J. A. Meyer and C. Skaar, Forest Prod. J., I965> I5> 426. '* (8) D. A. Fuccillo, Isotopes and Radiation Technology, Winter 1965—66, 3 (2). H5J R· E. Greene and P. S. Baker, ibid. p. 131. (9) B. S. Bryant, Forest Prod. J., 1966, 16 (2), 20. (10) F. Gütlbauer, E. Proksch and H. Bildstein, Ost. Chem. Ztg., 1966, 67, 349. (u) J. A. Meyer, Forest Prod. J., 1965, 15, 362. (12) F. C. Beall, J. A. Meyer and C. Skaar, Forest Prod. J., 1966,16 (9), 99. (13) J.F. Siauand J.A.Meyer, Forest Prod. J., 1966,16 (8), 47. (14) H. A. Krässig and V. Stannett, Adv. Polymer Sei., 1965, 4> i". (15) T. Koshijinia and E. Muraki, J. Japan Wood Res. Soc., 1964, 10, iio, ii6. (16) T. Koshijima and E. Muraki, J. Japan Wood Res. Soc., 1966, 12, 139. (17) T. Koshijima, J. Japan Wood Res. Soc., 1966, 12, 144. (18) D. L. Kenaga, J. P. Fennessey and V. T. Stannett, Forest Prod. J., 1962, 12, 161. (19) K. V. Ramalingam, G. N. Werezak and J. W. Hodgins, J. Polym. Sei., 1936, C2, 153. (20) W. H. Hoge, TAPPI, 1955, 38, I59A. (21) J. E. Hay and L. J. Haynes, J. Chem. Soc., 1956, 3141.

Freie Aminosäuren im Phloem- und Frühjahrsblutungssaft der Rotbuche (Fagus sylvatica Linn.) H. H. Dietrichs und H. Funke Institut für Holzchemie und chemische Technologie des Holzes der Bundesforschungsanstalt für Forst- und Holzwirtschaft, Hamburg-Lohbrügge In die Untersuchungen über akzessorische Bestandteile der Rotbuche und deren Einfluß auf das physiologische Verhalten und die technischen Verwendungsmöglichkeiten des Holzes, die bisher vornehmlich phenolische Verbindungen und niedrig molekulare Kohlenhydrate betrafen (2—5, 15)5 wurden nunmehr freie und gebundene Aminosäuren einbezogen. Im vorliegenden ersten Teil erfolgte die qualitative Bestimmung freier Aminosäuren im Phloem- und Frühjahrsblutungssaft, d. h. in den beiden Ferntransportsystemen der höheren Pflanzen, die das eigentliche Holz u. a. mit lebenswichtigen Stickstoff-Verbindungen versorgen. Für die Trennung und Identifizierung der in sehr geringen Mengen vorliegenden Aminosäuren erwies sich ein von E. von Arx und R. Neher (i) 1963 entwickeltes, „multidimensionales" dünnschichtchromatographisches Verfahren als sehr brauchbar. Material und Methoden Die Probeentnahmen erfolgten 1964 an mehreren, etwa 60—80 Jahre alten Rotbuchen in Reinbek (Hamburg) und naher Umgebung, in wenigen Fällen auch in Süddeutschland und der Schweiz. Zur Gewinnung des Frühjahrsblutungssaftes wurden am Stammfuß der Bäume Bohrungen bis zu 15 cm Tiefe vorgenommen und durch passende Glasrohre, die mit ihrer Wandung den Rindenteil dicht abschlössen, Auslaufvorrichtungen hergestellt. Das Auffangen der Säfte erfolgte in vorher zur Hälfte mit Äthanol gefüllten Glasgefäßen. Erstmaliges Bluten erfolgte Ende Februar an Bäumen auf feuchten Standorten; der Saftfluß hielt bei ständig

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wechselnder Ergiebigkeit bis zum 10. Mai an. Maximal wurden pro Bohrloch innerhalb von 24 Std. etwa 1,2 l Saft erhalten. Das zu Beginn, zur Hauptzeit und zum Ende der Saftflußperiode gewonnene Sammelgut mehrerer Buchen wurde gesondert analysiert. Die Deproteinierung der drei Fraktionen erfolgte durch Zugabe von Äthanol bis auf eine Endkonzentration von 80%. Nach mehrtägigem Stehen bei o° C wurden die ausgeschiedenen Eiweißniederschläge abfiltriert, die Filtrate im Vakuum auf etwa ein Hundertstel ihrer Volumina eingeengt, wiederum mit Äthanol auf eine Konzentration von 70% gebracht und bis zur weiteren Aufarbeitung bei o° C gelagert. Die Siebröhrensäfte wurden auf bekannte Weise (8) durch gezieltes Anschneiden der Rinde und Aufnehmen der austretenden Flüssigkeit mittels eines feinen Saugrohrs gewonnen. Die Probeentnahmen erfolgten stets in Stammhöhen bis zu 1,5 m und zwischen 13—18 Uhr, d. h. der Zeit hohen Saftflusses. Erste, sehr geringe Exkretionen lieferten Schnitte zu Anfang Juli; mit Beendigung des Laubfalls Anfang November setzte auch der Saftfluß aus. Die Daten der Probeentnahmen sind Tabelle 2 zu entnehmen. Der gesammelte Phloemsaft wurde gleich nach der Entnahme mit Äthanol auf eine Alkoholkonzentration von 80% verdünnt, und das nach Stehen bei o° C ausfallende Eiweiß abzentrifugiert. Bis zur weiteren Aufarbeitung lagerten die Proben bei o°C. Zur Erzielung einwandfreier chromatographischer Trennungen erwies es sich als notwendig, die besonders im Phloemsaft enthaltenen, vergleichsweise sehr hohen Anteile nicht Nhaltiger Stoffe abzutrennen. Die Reinigung erfolgte über eine Kationenaustauscher-Säule (DOWEX 50 W, X 8, 100—200 mesh, 0 2 cm, h 20 cm). Nach Aufgabe der Analysenlösungen auf das vorher 10 Stunden gequollene und mit Wasser neutral gewaschene Austauscherharz erfolgte die Eluierung der neutralen und sauren Bestandteile mit 200-300 ml Wasser und anschließend der basischen Anteile mit 200 ml 3-proz. wäßriger Ammoniaklösung. Die ammoniakalischeh Eluate wurden im Vakuum zur Trockene eingeengt und die* Rückstände in wenig

Bd. 2i (1967) H. 4

Freie Aminosäuren im Phloem- und Frühjahrsblutungssaft der Rotbuche (Fagus sylvatica Linn.)

Wasser-Aceton aufgenommen. Für den chromatographischen Auftrag dieser Lösungen wurden ihre Konzentrationen empirisch so eingestellt, daß eine optimale Trennung und ein sicherer Nachweis gewährleistet war. Die Chromatographie der Aminosäuren erfolgte nach dem „multidimensionalen" Verfahren von E. v. Arx und R. N eher (i) auf Cellulosepulver-beschichtetcn Dünnschichtplatten. Bei dieser Technik wird das Analysengemisch auf die Startpunkte in den Ecken von drei Dünnschichtplatten (A, B, C) gegeben und anschließend die Chromatographie mit dem gleichen Laufmittel (I) für alle drei Platten durchgeführt. In der zweiten, senkrecht zur ersten gerichteten Dimension erfolgt die Entwicklung jedes Chromatogramms mit einem Lösungsmittelsystem unterschiedlicher Zusammensetzung (II für A, III für B, IV für C); auf diese Weise erhält man drei zweidimensionale Chromatogramme, in denen die Reihenfolge der Aminosäuren in der ersten Dimension die gleiche ist, während ihre Sequenz in den zweiten Dimensionen durch die Auswahl geeigneter Systeme so stark variiert wird, daß in Kombination mit verschiedenen Farbreaktionen eine sichere Zuordnung und Unterscheidung der abgetrennten Substanzen, bei v. Arx und N eh er 57 verschiedene Aminosäuren, ermöglicht wird. In unseren Versuchen diente Cellulosepulver 300 HR ( M a c h e r e y und Nagel) als Trägermaterial. Besonders für den späteren Gebrauch des Laufmittels IV erwies es sich als zweckmäßig, die beschichteten Platten durch „Blind"-Chromatographie mit Laufmittel I vorzuwaschen (i) oder das Cellulosepulver vor der Beschichtung mit Laufmittel I und anschließend Aceton heiß zu extrahieren. Das mit Aceton und Wasser nachgewaschene Produkt wurde auf einer Fritte abgesaugt und unter häufigem Umrühren und Zerreiben bei 105° C getrocknet. Die Beschichtung der Platten erfolgte mit dem UnoplanStreichgerät ( S h a n d o n ) bei einer Schlitzbreite von 250/1. Zur Herstellung von 5 Platten wurden 15 g Cellulosepulver in 75 ml Wasser suspendiert und anschließend 3 Alinuten im Mixgerät homogenisiert. Die beschichteten Platten blieben bis zum Mattwerden ihrer Oberflächen im Applikator; erst dann wurden sie zunächst bei 70 °C und guter Belüftung und nachfolgend bei 105° C getrocknet. Beim Auftrag der Analysenlösungen wurde darauf geachtet, daß der Durchmesser der Startflecke 3 mm nicht überschritt. Gegebenenfalls konnte durch mehrfaches Auftragen kleiner Portionen und Zwischentrocknungen ein Verlaufen über größere Flächen vermieden werden. Als Vergleichssubstanzen für beide Laufrichtungen dienten Lösungen von Leucin und Tyrosin in Konzentrationen von sowie Glycin mit 0,5 y//d. Als Lösungsmittelsystem wurden verwendet (i): I. n-Butanol-Aceton-Diäthylamin-Wasser (10:10:2:5), pH: 11,05—n>4 II. Isopropanol-Ameisensäure (99%)-Wasser (40:2:10), pH: 2,7—2,8 III. sec.-Butanol-Methyläthylketon-Dicyclohexylamin-Wasser (10:10:2:5), pH: 10,9—"j0 IV. Phenol-Wasser (75:25), Gasphase equilibriert mit 3-proz. .wäßrigem Ammoniak, pH: 7,1—7,3. Die chromatographischen Trennungen erfolgten aufsteigend in Glastanks, die mit Einsatzrahmen aus rostfreiem Stahl versehen waren (Shandon) und die gleichzeitige Entwicklung bis zu sieben Platten erlaubten. Die Laufzeiten betrugen bei 20° C: Lösungsmittelsystem I: 2—3 Std. Lösungsmittelsystem II: 2,5—3,5 Std. Lösungsmittelsystem III: 2—2,5 Std. Lösungsmittelsystem IV: 3—3,5 Std. Die Trocknung der Platten erfolgte nach der ersten Trennung in gleicher Lage wie im Chromatographie-Tank für 5—10 Minuten bei 90° C und anschließend bei Raumtemperatur und guter Belüftung für mindestens 30 Minuten. Nach der zweiten Entwicklung wurde bei 100° C getrocknet. Zum Nachweis der Aminosäuren wurde ausschließlich das Ninhydrin-Collidin-Reagenz verwendet (i), das bei relativ guter Farbdifferenzierung hohe Empfindlichkeit aufwies. Die Reaktionsfärbungen sind Tabelle i zu entnehmen. Im Gegensatz zu den Angaben von v. Arx und N eher erhielten wir für Histidin keine graue, sondern eine purpurne Färbung. Der Nachweis erfolgte durch Besprühen der Chromatogramme und anschließende Erhitzung bei 90° C bis zum Erscheinen der Flecke.

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Das Pa u l y-Reagenz, das Reindel-Hoppe-Reagenz oder Nitroprussid-Natrium-Kaliumferricyanid (i, 9, 7) waren für die in unseren Proben enthaltenen Aminosäuren nicht spezifisch oder wiesen eine zu geringe Nachweisempfindlichkeit auf. Das Isatin-Reagenz (i, 9) lieferte zwar gut differenzierte Färbungen, doch erreichten in den Baumsäften selbst bei maximaler Beladung der Chromatogramme nur Glycin und Hydroxyprolin die untere Nachweisgrenze. Die Auswertung der Chromatogramme erfolgte anhand der bei v. Arx und N eh er dargestellten Vergleichschromatogramme wie auch eigener, die unter Verwendung bekannter Aminosäuren-Gemische hergestellt worden waren (Abb. i). LEU

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Abb. i. Aminosäuren-Vergleichschromatogramme, zweidimensional mit den Lösungsmittelsystemen I/II, I/III und I/IV (vgl. Text).

Holzforschung

H. H. Dietrichs und H. Funke

104

Tabelle i Nachweisbereich und Farbreaktionen von Aminosäuren [nach E. v. Arx und R. Neher (6), korrigiert] Farbreaktion praktisch mit unterer Nachweisbereich (y) Ninhydrin

Aminosäuren

violett grün violett violett gelb grün violett violett braun purpur gelb violett violett violett violett braun gelb gelb violett violett violett grau violett

0,05 0.05 0,05 0,2

Ala a-Alanin ß-Ala. /5-Alanin Aminobuttersäuren Abu Arginin Arg Asparagin Asp(NH2) Asparaginsäure Asp Glutamin Glu(NHo) Glu Glutaminsäure Gly Glycin Histidin His Hydroxyprolin Hypro Leucine Leu Lysin Lys Methinonin Met Ornithin Orn oc-Phenylalanin Phe a-Phenylglycin Phegly Prolin Pro Serin Ser Threonin Thr Tryptophan \ ,Try Tyrosin Tyr Valin Val

2,0 0,05

o,5 0,05 0,05 o,3 1,0

o,5 o,5 o,5 0,2 0,2 5,o o,5 0,2 o,5 o,5 o,5 0,05

Die zwischen den Vergleichschromatogrammen auftretenden Abweichungen waren mit Ausnahme des Histidins gering. · Eine Mengenschätzung der einzelnen abgetrennten Aminosäuren erfolgte nach der Größe und Farbintensität der Flecke. Weiterhin wurde die Nachweisempfindlichkeit der einzelnen Verbindungen berücksichtigt, da beispielsweise ein gerade noch sichtbarer Fleck von Phenylglycin (praktischer unterer Nachweisbereich vgl. Tabelle i) etwa die hundertfache Substanzmenge enthält wie Alanin oder Asparaginsäure.

Ergebnisse Die zu verschiedenen Zeiten der Vegetationsperiode 1964 entnommenen Frühjahrsbjutungs- und Phloemsäfte der Rotbuche enthielten nach den dünnschichtchromatographischen Untersuchungsergebnissen insgesamt 27 ninhydrinpositive Substanzen, von denen sich 23 bestimmten Aminosäuren bzw. Amiden zuordnen ließen. Die 23 identifizierten Verbindungen fanden sich sämtlich im Phloemsaft, während der Frühjahrsblutungssaft nur 16 von ihnen enthielt. Die Untersuchungsergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Von den nicht identifizierten ninhydrinpositiven Substanzen fanden sich vier im Phloemsaft und vermutlich wiederum zwei von diesen im Frühjahrsblutungssaft. Über diese Stoffe wird später gesondert berichtet werden. Die im Frühjahrsblutungssaft mengenmäßig vorherrschenden Stickstoff-Verbindungen sind Hydroxyprolin3 Asparagin und Glutamin, letztere beide jedoch nur in der Hauptsaftflußzeit. Weitgehend konstant während der gesamten Saftflußperiode traten Alanin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Hydroxyprolin, Leucine, Lysin, Threonin und Valin auf. Analog zum Blutungssaft waren auch in den Phloemsäften Asparagin, Glutamin und Hydroxyprolin am stärksten vertreten. Daneben fand sich hier in höchster Konzentration eine nur zu Anfang bis Mitte der Saftflußzeit auftretende, mit Ninhydrin gelb reagierende Substanz, die sich chromatographisch in Richtung I/II und I/III dem Phenylglycin zuordnen ließ, in Richtung I/IV jedoch nicht mehr aufzufinden war. Die über die gesamte Vegetationsperiode konstant vorhandenen

Tabelle 2 Vorkommen freier Aminosäuren in Frühjahrsblutungs- und Phloemsäften der Rotbuche. Aminosäuren1)

Ala

0-Ala Abu1)

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P r o b e e n t n a h m e n 1964 3.9. 14.9. 22.9.

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?: Vorkommen fraglich; sp: Vorkommen in Spuren; +: vorhanden; + + - > + + : stärker vorhanden Quantitative Vergleiche haben nur innerhalb einer senkrechten Spalte Gültigkeit. *) Abkürzungen vgl. Tab. 1. *) *-» ß-, y-Abus und iso-Abus sowie Leu, Heu, allo-Ileu und Nleu wurden nicht unterschieden.

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7.10.

Bad Kissingen 28.10. 3.10. Bern

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Bd. 21 (1967) H. 4

Freie Aminosäuren im Phloem- und Frühjahrsblutungssaft der Rotbuche (Fagus sylvatica Linn.)

105

Betula-, Carpinus-, Alnus- und Juglans-faten Citrullin (18). Das im Siebröhrensaft der Robinie vorherrschende Canavanin stellt möglicherweise ein typisches Merkmal für die Leguminosen-Pflanzen dar (19). Neben Glutamin- und Asparaginsäure sowie ihren Amiden wies T.E.Mittler (11) im Siebröhrensaft von Salix Senn, Alanin, Valin, Leucin und/oder Isoleucin, Phenylalanin, Threonin und wahrscheinlich y-Aminobuttersäure nach; H. Ziegler (17) fand neben den beiden genannten Aminosäure/Amid-Paaren im Siebröhrensaft der Robinie Prolin, Lysin, Serin, Alanin, Leucin und/oder Isoleucin sowie Methionin. Auch die Xylemsäfte enthalten häufig den höchsten Gesamt-N-Gehalt im Frühjahr — d. h. während der sogenannten Blutungszeit gewisser Holzgewächse — und zeigen im Sommer eine Abnahme, im Herbst dagegen wieder eine Zunahme derartiger Stoffe. Die N-Maximalwerte dürften um 0,012—0,02% (6) bzw. 0,025—°j°3% ( I 0 > l 6 ) liegen. Häufig scheinen lösliche, nicht Protein-gebundene Verbindungen fast 100% des Gesamtstickstoffs zu enthalten (6,10,16). Analog zum Phloemsaft treten im Blutungssaft von Acer- und — nicht ganz so ausgeprägt — AesculusArten Allantoin und Allantoinsäure als dominierende N-Translokationsformen auf (13,14, 16); in Betula-, Alnus- und Carpinus-Arten spielt diese Rolle in entsprechender Weise das Citrullin (16,10). Fagus-, Ulmus- und P/c^a-Arten, mit Einschränkungen weiterhin Aesculus-, Fraxinus- und Z,an#-Arten, gehören nach den Untersuchungsergebnissen von G. Reuter und H. W o l f f g a n g ( i o ) einem Säureamid-Typus an, der durch das vorherrschende Auftreten von Glutaminsäure/Glutamin und Asparaginsäure/Asparagin gekennzeichnet ist (vgl. Tabelle 3). Auch L. E. Barnes (ib) ermittelte als mengenmäßig dominierende N-Translokationsverbindungen der Xylemsäfte Allantoinsäure, Citrullin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin und Arginin. Mit Ausnahme der letztgenannten Verbindung stimmen somit seine, an 60 verschiedenen Holzarten durchgeführten Untersuchungen mit den vorhergehenden Literaturangaben überein. Die identifizierten Aminosäuren und ihr Vorkommen in den untersuchten Holz-

Aminosäuren sind Alanin, Arginin, Asparaginsäure, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Lysin, Valin, mit gewisser Einschränkung weiterhin Leucine, Prolin, Histidin, Serin, Threonin und Tyrosin. Nur im Phloem-, nicht dagegen im Frühjahrsblutungssaft wurden ß-Alanin, Ornithin, Phenylalanin, Phenylglycin, Prolin, Tryptophan und vermutlich Methionin nachgewiesen, wogegen der Frühjahrsblutungssaft keine identifizierten Aminosäuren bzw. Amide enthielt, die nicht auch im Phloem gefunden worden waren. Zu annähernd gleichen Zeiten entnommene Siebröhrenproben verschiedener Standorte wiesen keine qualitativen Unterschiede auf. Die verschiedenen Formen der Aminobuttersäuren und Leucine ließen sich nicht eindeutig zuordnen; sie wurden deshalb nur unter den Sammelbegriffen in Tabelle 2 aufgeführt. Mitunter dem Methioninsulfoxyd (Rf I: 0,25, II: 0,19, III: 0,26) bzw. dem Methioninsulfon (Rf I: 0,40, II: 0,20, III: 0,36) in der zweiten und dritten Dimension zuzuordnende Chromatogrammflecke wiesen auf das Vorkommen von Methionin hin. Diskussion Nach der vorliegenden Literatur ist der Gesamt-NGehalt in Blutungs- und Phloemsäften von Holzgewächsen vergleichsweise niedrig und erheblichen jahreszeitlichen Schwankungen unterworfen. Im Phloemsaft betrug er beispielsweise bei Salix während der Knospenschwellung 0,2%, während des Blattaustriebs 0,12%, in der Zeit reifer Sommerblätter 0,03% und während des Laubfalls 0,13%; etwa die Hälfte vom Gesamt-N-Gehalt dürfte dabei ProteinStickstoff sein (11,12). Ähnliche Verhältnisse liegen für eine Reihe anderer Holzarten vor (20). Die löslichen Stickstoffverbindungen des Phloemsafts stellen im wesentlichen Aminosäuren und Amide dar, unter denen meist die Paare Glutaminsäure-Glutamin und Asparaginsäure/Asparagin dominieren. Einige Holzarten weisen aber auch spezielle N-Wanderformen auf, wie z. B. in Acer-, Platanus- und Aesculus-Artei]. Allantoin und Allantoinsäure oder in

Tabelle 3 Durchschnittsergebnisse der Zusammensetzung der Aminosäurefraktion G. Reuter und H. Wolffgang (15)

von Baumblutungssäften

nach

Aminosäuren L» 3

Baum JC

"5 5 u

Alnus glutinosa Betula pubescens Carpinus betulus Corylus avellana Picea excelsa Larix decidua Fagus sylvatica Ulmus campestris Aesculus hippocastanum Fraxinus excelsior

5 5 5 5

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