172

男 子 尿 道 炎 患 者 か ら のChlamydia polymerasechain

trachomatis検

reaction法

(Chlamydiazyme

出 に お け る

と酵 素 抗 体 法

TM)と

の比 較

岐阜 大 学 医 学部 泌 尿 器科 学 教 室1),微 生物 学 教 室2) トヨタ記 念病 院 泌 尿器 科3),東 京 共 済 泌尿 器 科4) 出 口

隆1)山

本

啓 之2)多

田

晃 司1)岩

米 田

尚 生1)斉

藤

昭 弘1)伊

藤

康 久1)坂

玉 木

正 義3)前

田

真 一3)斉

藤

功4)江

河 田

幸 道1)

Key words:

PCR,

(平成3年9月27日

受 付)

(平成3年11月7日

受理)

Chlamydiazyme,

Chlamydia

要 Chlamydia

trachomatis検

(ChlamydiazymeTM)と

に て 除 したcut-off はC.tmchomatis

出 に お け るpolymerase

indexを

は2.6×103コ/assayが azymeと

算 出 し,そ れ が1以 相 当 す るDNA量

検 出 限 界 で あ っ た.男

に よ るCtrachomatis検

陽 性 例41例 す べ て でPCR法 PCR法

chain

と酵 素 抗 体 法 増幅

は,検 体 の 最 終 吸 光 度 をcut-off値 性 と判 定 し た.PCR法

子 尿 道 炎 患 者 の 尿 道 擦 過 材 料 か ら のPCR法

は,74例

で

のChlamydiazymeに

とChlamydi-

に よ り74例 中45例(60.8%)が

中41例(55.4%)が

陽 性 と判 定

陽 性 と判 定 され た.Chlamydiazyme

性 例33例 中,29例

でPCR法

陰 性 で,4例

対 す る陽 性 一 致 率 は100%(41/41),陰

比 較 し,よ り高 感 度 のC.trachomatis検

場 合 に は,Chlamydiazymeの

reaction(PCR)法

ま で 検 出 可 能 で あ る の に 対 して,Chlamydiazymeで

体 で の 一 致 率 は94.6%(70/74)と

Chlamydiazymeに

孝 行2)

urethritis

上 の 場 合 にC.trachomatis陽

陽 性 で あ り,Chlamydiazyme陰

陽 性 で あ った.PCR法

87.9%(29/33)で,全

崎

で は,242bpのC.trachomatisDNAの

出 結 果 の 比 較 で は,PCR法

さ れ た の に対 し て,Chlamydiazymeで

義 人1)

trachomatis,

性 と判 定 した.Chlamydiazymeで

102コ/assayに

英 樹1)

旨

の 比 較 検 討 を お こな っ た.PCR法

を 認 め た 場 合 にCtrachomatis陽

田

高 い一 致 率 を 示 し た.以

で

性一 致 率 は

上 よ り,PCR法

は,

出 系 で あ り,尿 道 擦 過 材 料 を 検 出 材 料 と した

検 出 結 果 と高 い 一 致 率 が 認 め られ,ク ラ ミジ ア 性 尿 道 炎 診 断 に お い て 特 異

性 の 高 い 有 用 な 検 出 方 法 と思 わ れ た.

緒 Chlamydia

一 般 に は普 及 せ ず

言

trachomatisは 偏 性 細 胞 寄 生 性 で,

生 きた 細 胞 内 に お い て の み 増 殖 可 能 で あ る た め, HeLa細

胞 やMcCoy細

胞 な どを 用 い た 細 胞 培 養

matisの

今 回,我

々 が 報 告 し て き たC.trachomatis検

の た め のpolymerase

細 胞 培 養 法 は 特 殊 な設 備 お よび技 術 を要 す るた め

を,一

岐 阜 大 学 医学 部 泌 尿器 科

chain

出口

隆

出

reaction(PCR)法5)

般 検 査 室 に 最 も普 及 し て い る 検 出 方 法 の 一

つ で あ るChlamydiazymeと

阜 市 司 町40

床 検 体 か ら のC.tracho-

を 用 い て お こ な わ れ て い る.

法 に よ り分 離 ・検 出 さ れ て い る1).し か し な が ら,

別刷 請 求 先:(〒500)岐

,臨

検 出 は,蛍 光 抗 体 法2)ま た は 酵 素 抗 体 法3)4)

比 較 し,PCR法

の ク

ラ ミジ ア尿 道 炎 診 断 に お け る有 用 性 の 検 討 を お こ 感 染 症 学 雑誌

第66巻

第2号

PCR法

とChlamydiazymeと

な っ た.

の比 較

173

μlに5%NP-40,5%Tween-20と1mg/ml 材 料 と方 法

1.標

proteinase

準 菌 株 と菌 液 の調 整

PCR法

よ るC.tracho-

出 感 度 の 検 討 に は,Ctmchomatis

UW-5/CXを

DNA抽 E/

用 い て,4',6-diamino-2-phenylindole

dihydrochloride(DAPI)に

てDNA染

い 菌 数 を 数 え,DNAの azyme用

抽 出 お よ びChlamydi-

assay当

の

被 検DNAと

し

に よ る検 出

前 回 の 報 告5)6)と 同 様 のCtrachomatiS血 outer

membrane

清型

protein(MOMP)

遺 伝 子 の 塩 基 配 列 に 相 補 的 な2種 cleotideを

り,C.tmchomatisが1×105コ,1×104

抽 出 を お こ な っ た5).そ

て 用 い た.

L2のmajor

お よ びChlamydiazymeの1

つ 加 え,55℃,60

出 溶 液 の10μ1をPCRの

5.PCR法

色 を お こな

検 体 希 釈 緩 衝 液 に よ る希 釈 を 経 て 最 終

濃 度 が,PCR法

そ れ ぞ れ10μlず

分 間 処 理 し,DNAの

とChlamydiazymeに

matis検

Kを

類 のolygonu-

プ ラ イ マ ー と し て 用 い た.PCRの

条 件 は 変 性95℃,20秒,ア

反応

ニ ー リ ン グ55℃,20秒,

コ,1×103コ,1×102コ,1×10コ,1×100コ

伸 長72℃,30秒

お よ び1×10-1コ

に 繰 り返 し た.PCR後,2%ア

ガ ロースゲルにて

電 気 泳 動 を お こ な いethidium

bromide染

と な る よ う に'菌 液 を 調 整 し

た5). 2.尿

道擦過 材料

242bpのDNAの

尿 道 炎 の 臨 床 症 状 と 共 に 尿 道 ス ミ ア の 多 核 白血 球 が1,000倍

の 検 鏡 に て5コ

尿 道 炎 患 者74例

PEN)に

道 擦 過 材 料 は,

体 採 取 用 専 用 綿 棒(STD-

て 採 取 し た.そ

Chlamydiazymeキ

ら15分 間 室 温 で 放 置 し た 後,撹

で 激 し く振 と う し,緩

拌機

お よ びChlamydi-

よ るC.trachomatisの

検 出 を 試 み た.

azymeに

3.Chlamydiazymeに

従 っ て,菌

りC.trachomatisの は,同

検 出 を お こ

時 に 測 定 し た3本

の陰 性

コ ン ト ロ ー ル の 吸 光 度 の 平 均 値 に0 .100を 加 え た 値 と し,各 検 体 の 最 終 吸 光 度 をcut-off値 たcut-offindexを

とcut-offindexと index

に て除 し

算 出 し た.Chlamydiazymeに

お け るC.trachomat盛s検

出 感 度 の 検 討 で は,菌

の 関 係 を グ ラ フ に 描 き,cut-off

indexが1以

検 出 限 界 と し た.臨 上 をCtrachomatis陽

床 検 体 で はcut-off 性 と判 定 し

た. 4.DNAの

検 出 感 度 の 検 討 で は 電 気 泳 動 に て242 認 め た 最 小 の 菌 数 を検 出

結 1.PCR法

果

とChlamydiazymeと

の検 出感 度 の

比較 PCR法

に よ る 検 出 感 度 は 前 回 の 報 告5)と 同 様 に で242bpのband

方,Chlamydiazymeに

数 とcut-off

indexと

の 間 にFig.1

に 示 す よ う な 関 係 が 得 ら れ,C.trachomatis陽 と 判 定 さ れ るcut-off

index1と

菌 液 お よ び 尿 道 擦 過 材 料 を 浮 遊 さ せ た 緩 衝 液70

性

な る菌 数 す なわ ち

検 出 限 界 は グ ラ フ よ り2.6×103/assayと れ た.し

た が っ て,PCR法

比 較 し て26倍 2.尿

求 め ら

はChlamydiazymdこ

高 感 度 で あ っ た.

道 擦 過 材 料 か ら のCtmchomatisの

較 で は,PCR法

で は,74例

検 出 出結 果 の比

中45例(60.8%)が

陽

性 と 判 定 さ れ た の に 対 し て,Chlamydiazymeで は,74例

中41例(55.4%)が

陽 性 と判 定 され た

(Table1).Chlamydiazyme陽 PCR法 中,29例

抽 出

平成4年2月20日

に よ るC.tra-

臨 床 検 体 か ら のCtmchomatis検 数

1と な る 菌 数 を グ ラ フ よ り求 めChlamydi-

azymeの

chomatisの

bpのDNAのbandを

お い て は,菌

ッ トに 添 付 さ れ た 操 作 法 に

な っ た.cut-off値

性 と判 定 し た6).PCR法

が 認 め ら れ た(Fig.1).一

液 お よび 尿 道 擦 過 材 料 を 浮 遊 させ た 緩

衝 液 の200μlよ

chomatis陽

電 気 泳 動 に て1×102/assayま

よ る検 出

Chlamydiazymeキ

色 にて

感 度 と し た.

衝液 中に擦過材料 を浮遊 さ

の 緩 衝 液 か らPCR法

自動 的

増 幅 を 認 め た 場 合 をCtra-

の 綿 棒 の入 った試 験 管 に

ッ トの 検 体 希 釈 用 緩 衝 液1ml

を 加 え,10か

せ,そ

以 上 認 め られ た 男 子

を 対 象 と し た.尿

Chlamydiazyme検

と し て 温 度 サ イ ク ル を32回

性 例41例

陽 性 で あ り,Chlamydiazyme陰 でPCR法

陰 性 で,4例

あ っ た.Chlamydiazyme陽 認 め な か っ た.PCR法

でPCR法

性 でPCR法 のChlamydiazymeに

すべてで 性 例33例 陽性で 陰 性例 は 対す

174

出口

Fig. 1 Comparison of PCR method and Chlamydiazyme in sensitivity by testing C. trachomatis E/ UW-5/CX. An agarose gel electrophoresis profile of PCR product and a dose response curve of Chlamvdiazvme.

隆 他 Fig. 2

Scatter

plot

specimens

of

cut-off

determined

by

presenting relationship between cut-off PCR. Open circle, Chlamydiazyme-negative men;

て い

solid circle,

1

Comparison

by testing

of

PCR

in detection

clinical

method

index and speci-

Chlamydiazyme-positive

る.そ

の 中 で 酵 素

Chlamydiazyme3)は,最

Chlamydiazyme

of clinical

Chlamydiazyme

speci-

men.

NUMBEROF C. trachomatis/ASSAY

Table

index

一つ であ る

and

of C. trachomatis

で あ

る

も普 及 して い る検 査 法 の

.Chlamydiazymeに

抗 ク ラ ミジ ア 抗 体 は,ポ

specimens

抗 体 法

用 い られて い る リク ロ ーナ ル 抗 体 で あ り

ク ラ ミ ジ ア 属 特 異 性 で あ る た めChlamydia psittaciと

も反 応 し8),さ ら に,気

道 常 在 菌9)や,E.

coliを は じ め と す る 尿 路 か ら 出 現 の 可 能 性 の あ る グ ラ ム 陰 性 桿 菌 に お い て も 多 菌 量 で の 交 差 反 応10) が 指 摘 さ れ,咽 検 出 で は,高 い る10).し る 陽 性 一 致 率 は100%(41/41)で 87.9%(29/33)で,全 74)と

体 で の 一 致 率 は94.6%(70/

とChlamydiazymeに

お け るcut-off

の 比 較 で は,PCR法

陽 性 例 のcut-off

indexは,4例

で0.21,

で あ っ た が,残

り41例 で は す べ て1以

PCR法

0.25,

陰 性 例 のcut-off

0.59,

indexは

0.65と1未

満

上 で あ っ た.

す べ て0。33以 下

で あ っ た(Fig.2). 察

道 擦 過 材 料 か ら のC.

検 出 に お い て は,培

検 出 系 を 開 発 し,そ がC.trachomatis種

養 法 との 一 致

断 法7)が お こ な わ れ

の 基 礎 的 検 討 を 行 い,PCR法 特 異 的 な検 出方 法 で あ る こ

と を 報 告 し た5).さ ら に,男 過 材 料 か ら のPCR法

れ,感

検 出 に は,細 胞 培 養 法1)の 他 に

免 疫 学 的 方 法2)∼4)や,DNA診

か し な が ら,尿

有 用 性 は,確 立 さ れ て い る3). 一 方 ,我 々 はPCR法 に よ るC.trachomatisの

出 を 試 み,培 考

Ctrachomnatisの

trachomatisの

率 に偽 陽 性 を 示 す こ とが 報 告 され て

率 は 高 く尿 道 炎 診 断 に お け るChlamydiazymeの

高 い 一 致 率 で あ っ た.

PCR法 indexと

陰 性一 致 率 は

頭 や 直 腸 か ら のC.trachomatisの

子 尿 道 炎 患 者 の尿 道 擦

に よ るC.trachomatisの

検

養 法 に よ り簡 便 性 お よ び 迅 速 性 に 優

度 に お い て も 同等 あ るい はそ れ 以 上 の優 れ

た 検 出 方 法 で あ る こ と を 示 し た6).今 回 は,男 子 尿 道 炎 患 者 の 尿 道 擦 過 材 料 を 検 体 と し,PCR法 感 染 症学 雑 誌

第66巻

お よ 第2号

PCR法

びChlamydiazymeに 試 み,両

とChlamydiazymeと

てC.trachomat盛sの

175

の比 較

壮,

検 出を

北 川 龍 一,

小 島 弘 敬,

者 の 比 較 を お こ な っ た.

善 次 郎:

PCR法

とChlamydiazymeと

chomatis標 PCR法

のC.tra-

が26倍 高 感 度 で あ り,臨 床 材 料 か ら の 検 出

出.

壮,

りPCR法(55.4%)に

く,Chlamydiazyme陽

性 例 す べ て でPCR法

で あ り,Chlamydiazyme陰

性 例4例

cut-off

で,PCR法

は,Chlamydiazymeの

indexが0.59と0.65の2検

chomatis の2検

れ ら4例

103コ/assayの

体 で,C.tra-

Chlamydiazymeに

assayで

5)

西 浦 常 雄,

斉藤

功,

出限界以 下 の菌量 で

回 の 検 討 で,尿

熊 本 悦 明,

長 田 尚 夫,

trachomatis感

染症診断試

有用性一尿路性 感 染 症 誌,

60:

378

Prog.

Med.,

10:

2948-2955,

出口

隆,

山 本 啓 之,

chainreaction法

6)

道擦過材料 におい

岩 田 英 樹,

感 染 症 誌,

65:

出口

山 本 啓 之,

岩 田 英 樹,

河 田 幸 道:

伊藤

Polymerase

に よ るC.trachomatis検

礎 的 検 討. 隆,

山 本 直 樹,

功, 河 田 幸 道:

1183-1187,

伊 藤 康 久,

小 野 一 徳, 斉 藤

Polymerase

chain

出の 基 1991. 玉木

功, 江 崎 孝 行,

reaction法

による

て ク ラ ミジ ア 検 出 に 特 異 性 の 高 い こ と が 確 認 さ れ

男 子 尿 道 炎 患 者 の 尿 道 擦 過 材 料 か

て い るChlamydiazymeの

Chlamydia

検 出 結 果 とPCR法

の

検 出 結 果 と に 高 い 一 致 率(94。6%)を

認 めた こ と

は,PCR法

出 の特 異 性

も ま た,Ctrachomatis検

に 優 れ た 方 法 で あ る こ と を 示 す も の と 思 わ れ た. 以 上 よ り,今

回 の 検 討 お よ びPCR法

と の 比 較 検 討6)を あ わ せ,PCR法 性,感

と培 養 法

は,簡 便 性,迅

度 お よ び 特 異 性 の 点 か ら,ク

速

ラ ミジ ア 性 尿

道 炎 診 断 に 応 用 可 能 な 臨 床 的 に も有 用 な 方 法 で あ

1555-1559, 7)

1409-1416,

9)

献

1) 加藤 直 樹, 伊藤 康 久, 出 口

隆, 兼 松

人, 河 田 幸道, 西 浦 常雄, 鄭

稔, 坂

義

漢 彬, 土 井達 朗,

酒井 俊 助, 松 田 聖 士: Chlamydia

trachomatisの

尿道 炎 患 者 か ら の分 離. 感 染 症 誌, 58:

29-38,

1984. 2) 西浦 常 雄, 加 藤 直 樹, 中尾

山崎

ら の

検 出.

感 染 症 誌,

65:

断.

最 新 医 学,

45:

1991. 感 染 症 のDNA診 1990.

勉,

10)

橋 爪

壮,

吉 沢 花 子,

trachomatis気

第1編.

交 差 反 応.

感 染 症 誌,

63:

小 島 弘 敬,

森

高 井 計 弘,

康 弘, 子,

忠 三,

森 田 豊 寿,

藤 原 睦 憲:

淋 菌,

気道 常 在 細 菌 との

1195-1200,

野 口泰 子,

種 検 出 法 の 為 陽 性 反 応.

山 崎 と も み:

道感染の診断における

抗 原 検 査 法 に つ い て.

1990.

亨, 熊 本 悦 明, 橋 爪

trachomatisの

8) Saikku, P., Pnolakkainen, M., Leinonen, M., Nurminen, M. & Nisaiwen, A.: Crosoreactivity between Chlamydiazyme and Acinetobacter strains. N. Engl. J. Med., 314: 922-923, 1986.

る も の と思 わ れ た.

平成4年2月20日

松 岡 幸 雄:

Chlamydia

文

橋爪

野 口 昌 良,

熊 本 悦 明, 熊 澤 浄 一, 松 田 静 治, 橋 爪 壮: "IDEIAク ラ ミ ジ ア" の 基 本 的 ・臨 床 的 研 究 一 共 同

正 義, 前 田 真 一,

た,今

検

1984.

義 人,

康 久, 江 崎 孝 行, 斉 藤

で は 検 出 限 界 が102コ/

あ るた め に 検 出 可 能 で あ った もの と思 わ

れ た.ま

tmchomatisの

1305-1314,

Chlamydia

高瀬

(Micro

1990.

量 に 相 当 す る た め,

て は,検

あ っ た も の の,PCR法

坂

研 究summary-.

量 に 相 当 し,0.21と0.25

体 で は,102コ/assayの

58:

器 感 染 症 に お け る 検 討 一. -386 , 1986.

陽性

長 田 尚 夫,

藤 森 一 平,

薬 と し て のChlamydiazymeTMの

4)

陽 性 で あ っ た.そ

博:

中 村 正 夫,

萩 尾 敏 且,

に よ るChlamydia

小 島 弘 敬,

中野

て検 出 率 は高

康 之,

識 モ ノ ク ロー ナ ル抗 体

感 染 症 誌,

3) 加 藤 直 樹,

に お い て も 感 度 の 差 を 反 映 し,Chlamydiazyme (60.8%)よ

FITC標

TrakTM法)

準 菌 株 を 用 い た 検 出 感 度 の 比 較 で は,

林

赤 尾 頼 幸,

1989.

久 米 春 喜,

橋 本 昭 一,

村上

稲 本美 穂

ク ラ ミジア検 出 にお け る各 日性 感 染 症 誌, 1: 61-65,

176

出口

隆 他

Comparison of Polymerase Chain Reaction and Enzyme Immunoassay (ChlamydiazymeTM) in Detection of Chlamydia trachomatis from Male Urethritis Takashi DEGUCHI1),Hiroyuki YAMAMOT02),Koji TADA1),Hideki IWATA1), Hisao KOMEDA1),Akihiro SAITO1, Yasuhisa IT01), Yoshihito BAN1), Masayoshi TAMAKI3),Shin-ichi MAEDA3),Isao SAIT04), Takayuki EZAKI2)& Yukimichi KAWADA1) Departmentof Urology1) & Departmentof Microbiology2), GifuUniversitySchoolof Medicine Departmentof Urology,ToyotaMemorialHospital3) Denartmentof Tfrolno-y_ TokyoKyosaiHosnitalo A method using polymerase chain reaction (PCR) was compared to an enzyme immunoassay (Chlamydiazyme) for detection of Chlamydia trachomatis by testing a reference strain and clinical specimens. Two oligonucleotides based on sequences within the major outer membrane protein gene from C. trachomatis serovar L2were used as primers for the PCR. A DNA fragment of 242 by specific for C. trachomatis was amplified by the PCR, when DNA of 102 C. trachomatis was used as template for the PCR. A chlamydial antigen was detected by Chlamydiazyme, when 2.6 X 103C. trachomatis were applied for the enzyme immunoassay. The PCR method was 26 times more sensitive than Chlamydiazyme in detection of C. trachomatis. The PCR method and Chlamydiazyme were carried out to examine 74 urethral swabs obtained from male patients with urethritis for detection of C. trachomatis. In 45 of 74 specimens, the DNA fragment of C. trachomatis was amplified by the PCR, and in 41 of 74, the chlamydial antigen was detected by Chlamydiazyme. The detection rate of the PCR method (60.8%)was higher than that of Chlamydiazyme (55.4%).The positive coincidence rate of the PCR method to Chlamydiazyme was 100%(41/41) and negative coincidence rate was 87.9%(29/33). The overall coincidence rate between the two methods was high (94.6%).Thus, the PCR method was more sensitive than Chlamydiazyme for detection of C. trachomatis and specific for diagnosis of chlamydial urethritis.

感 染 症 学雑 誌

第66巻

第2号