BIOCHIM1E, 1975, 57, 609-622.

Mdtabolisme compard des phospholipides des organes effecteurs de l'osmordgulation chez l'anguille europdenne (Anguilla anguilla). G. ZXVINGELSTEIN ( * ~ ) ) , R. MEISTEIq (*) et G. BRICHON (* ").

(*) CNRS, Laboratoire de Physiologie g~nkrale et comparde, ~3 Boulevard du 11 N o v e m b r e 1918, 69621 Villeurbanne. (~ ~) Institut Michel Pacha, Laboratoire m a r i t i m e de Physiologie, 83500 Tamaris-sur-Mer. (28-1-1975). Summary. - - The p h o s p h o l i p i d composition f r o m various organs of the fresh w a t e r eel, such as gill, kidney, gut, l i v e r a n d muscle, were d e t e r m i n e d b y t h i n - l a y e r c h r o m a tography. The m a j o r p h o s p h a t i d e s f o u n d in these tissues were PC, PE and SPH and m i n o r c o n s t i t u e n t s PS, PI, DPG, AP and also LPC in the gut. A greater percentage of PS and SPH occurs in the o s m o r e g u l a t o r y cffector organs such as gill~ kidney, and gut. F r o m in l~ivo com~parative 'kinetic studies of the aep i n c o r p o r a t i o n into the phospholipids, between 6 a n d 48 hours, c e r t a i n r e m a r k a b l e f e a t u r e s of p h o s p h o l i p i d m e t a b o l i s m have been f o u n d in these tissues. A low u p t a k e of inorganic 3')p into the tissue lipid p h o s p h o r u s was observed in the eel at 15°C. The specific activity of the lipid p h o s p h o r u s increased c o n t i n u o u s l y in all tissues d u r i n g 48 h o u r s a f t e r -~2p injection. During t h i s e x p e r i m e n t a l period, p h o s p h a t i d i e acid a n d p h o s p h a t i d y l inositol f r a c t i o n s were labelled most rapidly in gill, kidney a n d gut, while the specific activity of the phosp h a t i d y l choline f r a c t i o n r e m a i n e d low in these organs. In liver, the rate of PC f o r m a t i o n appears to be faster t h a n the PI and PE biosynthesis. In gill a n d gut, the PE showed greater t u r n o v e r t h a n the PC as m e a s u r e d by a2p incorporation. In the eel, an e u r y h a l i n fish, the DPG of o s m o r e g u l a t o r y effector organs has a h i g h specific activity at all times. PS showed only a high specific activity in the gill. Labelling of SPH oeeured slowly in the various tissues, only becoming evident after 24 hours. The results are compared w i t h those p u b l i s h e d for other p o i k i l o t h e r m an(t h o m e o t h e r m vertebrates. Relative differences between the t u r n o v e r of various tissue p h o s p h a t i d e s are discussed w i t h of reference to the general scheme on p h o s p h o l i p i d b i o s y n t h e s i s and to the physiological f u n c t i o n s of the various organs.

L a p l u p a r t d e s r e c h e r c h e s s u r les l i p i d es d e s a n i m a u x a q u a t i q u e s o u t e u p o u r ob}et, j u s q u ' h ees d e r n i 6 r e s a n n 6 e s , l ' a n a l y s e d 6 t a i l l 6 e de la c o m position en acides gras des graisses totales de n o m b r e u s e s e s p g c e s d e v e r % b r 6 s et d ' i n v e r t 6 b r 6 s m a r i u s o u d u l e i e o l e s [1]. P a r a d o x a l e m e n t p e u d e t r a v a u x o n t 6t6 c o n s a c r 6 s , e h e z le p o i s s o n , a u m ~ t a b o l i s m e d e s p h o s p h o l i p i d e s [2~ b i e n q u e ce g r o u p e d e e o m p o s 6 s , d u f a i t n o t a m m e n t d e ses i m p l i c a t i o n s p h y s i o l o g i q u e s [3], a p p a r a i s s e e o m m e partieuli~rement important e h e z ces p o i k i l o t h e r m e s . E n effet, c e s a n i n m u x se t r o u v e n t r 6 g u l i 6 r e m e n t c o n f r o n t 6 s h de p r o f o n d e s t r a n s f o r m a Abr5viations usuelles : RAS. radioactivitd spdcifique, Pi. p h o s p h o r e mindral, P lip. p h o s p h o r e lipidique, SPH. sphingomydline, LPC. l y s o p h o s p h a t i d y l - c h o l i n e , PC. p h o s p h a t i d y l - c h o l i n e , PE. p h o s p h a t i d y l - d t h a n o l amine, PS. p h o p h a t i d y l - s d r i n e , PI. p h o s p h a t i d y l - i n o s i tol, AP. acide p h o s p h a t i d i q u e , DPG. d i p h o s p h a t i d y l glyc6rol. A qui toute correspondanee dolt 6tre adress6e.

t i o n s d e c e r t a i n s f a c t e u r s 6 c o l o g i q u e s , l e l s des 6 1 6 v a t i o n s ou d e s a b a i s s e m e n t s s a i s o n n i e r s d e t e m p 6 r a t u r e , l e s q u e l s t e n d e n t p a r e x e m p l e ~t tood i f f e r le v o l u m e d e s 6 c h a n g e s h y d r o - m i n b r a u x [4]. Or, c h e z le p o i s s o n o s s e u x d ' e a u d o u c e o n d ' e a u d e m e r , t r o i s o r g a n e s p r i n c i p a u x : la b r a n c h i e , le r e i n et l ' i n t e s t i n , c o n c o u r e n t , a v e c u n e i n t e n sit6 p l u s o u m o i n s g r a n d e s u i v a n t la s a l i n i t 6 [5], a u m a i n t i e n d e la p r e s s i o n o s n m t i q u e d u m i l i e u i n t 6 r i e u r ~6]. D a n s de telles c o n d i t i o n s , les p h o s p h o l i p i d e s d u f a i t de I e u r i n c l u s i o n d a n s l ' a r e h i t e c t u r e m e m b r a n a i r e [7] e t d e l e u r rSle d a n s le fonctionnement de certaines enzymes associ6es ces m e m b r a n e s [8], v o n t a v o i r d a n s ces e s p 6 c e s , au niveau des organes d'6changes, un int6r~t aecru. C'est pourquoi nous nous sommes attach6 •a 6 t u d i e r le m 6 t a b o l i s m e de c e s l i p i d e s p h o s p h o r 6 s d a n s les l i s s u s d e s p o i s s o n s [91 et h p r 6 c i s e r ses v a r i a t i o n s s o u s l ' i n f l u e n c e d e c o n d i t i o n s 6cologiques vari6es.

610

G. Z w i n g e l s t e i n , R. M e i s l e r el G. B r i c h o n .

Dans cette p u b l i c a t i o n , nous r a p p o r t o n s les r6sultats relatifs au m6tabolisme de la copule phosphate des p r i n c i p a u x p h o s p h a t i d e s pr6sents dans les organes effecteurs de l'osmor6gulation de Fanguille adapt6e h l'eau douce, en te c o m p a r a n t avee eelui d ' u n organe tel que le rote, sans r a p p o r t direct avec Fosmor6gulation.

MATI~RIEL E T Mt~THO,DES. Les poissons ufilis6s sont des anguilles proven a n t de la r6gion d'Arles oh e]les sont pSch6es en ea~u douce. A leur arriv6e au laboratoire, l es animaux pesant e n v i r o n 180 g sont r6partis en lots bomog6nes dans diff6rents bacs aliment6s en eau douce e o n t i n u e l l e m e n t filtr6e et a6r6e et m a i n tenue h une t e m p 6 r a t u r e constante de 150C. Les a n i m a u x sont ainsi laiss6s h jeun duran,t leur p6riode d ' a c c l i m a t a t i o n (Octobre-D6cembre). Apr6s plus d'un mois &adaptation, chaque a n i m a l regoit 20:0,~Ci de asp p a r 100 g de poids, so~s forme d ' o r t h o p h o s p h a t e de Na (Aetivit6 sp6cifique 20 m Ci/mg) e n solution physiologique, inject6 dans la cavit6 coelomique. Puts les anguilles sont saerifi6es 6, 12, 24 et 48 heures apr6s cette injection. P o u r ceta 1.es anima'ux son.t anesth6si6s au MS222 (Sandoz) ~ la dose de 1 g p a r litre d'eau. Du sang est recueilli ~ l'aorte ventrale et les 6chantillons des d~vers tissus sont r a p i d e m e n t pr6lev6s. P o u r l'intestin, la p a t t i e m u q u e u s e qui dolt 4tre analys6e est facilement d6colt6e du muscle p a r grattage au scalpel. Dans le cas de la b r a n e h i e , on isole les filaments en les d4.tach.ant des arcs b r a n chiaux que l'on 61.imine ensuite. Des parties allquotes de ces pr616vements sont i m m 6 d i a t e m e n t homog6n6is6es, soit d.ans de t'acide p e r c h l o r i q u e 7 p. cent glac6 en vue de la mesure de la radioactivit6 du p h o s p h o r e i n o r g a n i q u e , soit dans u n m61ange chloroforme-m6thanoI (2:1) pour l'extraction des lipides. A p a r t i r de l'extrait p e r c h l o r i q u e p r 6 c 6 d e m m e n t pr6par6, le dosage et la mesure de la radioactivit6 4u p h o s p h o r e i n o r g a n i q u e tissulaire sont r6alis6s s u i v a n t la m6thode de Martin et Doty [22]. 1. - - P u r i f i c a t i o n el analyse des phospholipides. L'extrait l i p i d i q u e o b t e n u ap.r6s homog6n6isation du .tissu dans le m61ange c h l o r o f o r m e - m f t h a nol, est .ensuite pnri'fi6 suivan,t la m6thode de Folch el aL [10]. Au cours des exp6riences radioactives, le n o m b r e de lavages de la phase organ i q u e pr6conis6s p a r ces derniers, a 616 port6 h trois afin d'61iminer .enti6rement les c o n t a m i n a n t s 32p n o n lipidiques. BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 5.

Apr6s 6vaporation du solvant sous vide, les lipides, aprbs pes6e, sont diss.ous dans u n m61ange benz.6ne-m6thanol (2:1) et conserv6s h - - 3 5 ° C . Une d 6 t e r m i n a t i o n du p h o s p h o r e et de la radioactivit6 est faite sur une p a t t i e aliquote de c h a c u n e de ces solutions. Les c o n s t i t u a n t s phosphorgs de ces lipides sont alors s6par6s, le plus r a p i d e m e n t possible, par c h r o m a t o g r a p h i c b i d i m e n t i o n n e l l e sur t o u c h e m i n c e [12]. P o u r eela des plaques de verre de 10 × 2.0 cm sont recouvertes d ' u n e t o u c h e de 0,6 m m d'6paisseur de gel de silice H (Macherey et Nagel) pr6par6 h p a r t i r de 52 g de gel, mfilanggs avee 100 ml d'eau bidistill6e c o n t e n a n t 75'0 mg de carbonate de sodium, s u i v a n t S:kipski et al. [111. Les plaques sont aetiv6es h 120°C plusieurs heures avant leur util:isation. Le ddp6t de la solution h analyser est r6alis6 dans un coin sous forme d ' u n e tache de 5 m m de diam6tre et peut c o n t e n i r jusqu'h 2 mg de phospholipides. Puts le f r a c t i o n n e m e n t sur ce type de plaque est rgalis6 au m o y e n du syst6me de solvants couramm e n t employ6 au laboratoire p o u r l'analyse des Iipides d ' a n i m a u x aquatiques [12] (*). Solvant 1. - - T d t r a h y d r o f u r a n e / a c 6 t o n e / m b t h a n o l / a m m o n i a q u e (d = 0,92)/eau, dans les p r o p o r tions : 55:25:43:1':7. Ce solvant est utilis6 dans la premi6r,e d i m e n s i o n (petit c6t6 de la plaque : 10 cm), la m i g r a t i o n est arr6t6e lorsque Ie front du solvant est h 1 em du bord de la plaque. Puts apr6s s6ehage de 2 h 3 m i n u t e s sous c o u r a n t d ' a i r chaud, 1.e d6veloppem e n t dans la deuxi6me d i m e n s i o n (migration sur 2'0 cm) est effeetu6 avec le solvant classique suirant : SoIvant 2. - - C h l o r o f o r m e / a c 6 t o n e / m 6 t h a n o l / acide ac6tique/eau, dans les p r o p o r t i o n s : 5:0/20./ 1,0/10/4,7. A la fin du d6veloppement des e h r o m a t o g r a m rues, les plaques sont s6eh6es quelques m i n u t e s h l'6tuve h 100°G. Apr6s r6v61ation des diff6rents compos6s phosphor6s ainsi s6par6s p a r le r6actif de Dittmer [13], les taches c o n t e n a n t d u p h o s p h o r e sont s o i g n e u s e m e n t recueillies dans des tubes h min6raliser. La m i n 6 r a l i s a t i o n du p h o s p h o r e lipidique de chaque tube est alors r6alisfie r a p i d e m e n t au m o y e n du m61ange sulfo-perchlorique eonten a n t 0,1 p. cent de t6traoxyde de v a n a d i u m (VuO4), (*) Dans certains cas, pour ddbarrasser le ddp6t des lipides neutres parfois g6nants (eas du foie et du muscle), on effeetue au pr6alable un entrainement de ceux-ei par l'6ther dthylique au eours d'une migration de ce solvant dans le sens de la plus grande dimension de la plaque (e6t6 de 20 cm).

Mdtabolisme des phospholipides Apr~s dilution, le phosphate est d6termin6 directem e n t sur cette d i s p e r s i o n p a r la m6thode de Bartlett [14]. Les lectures photom6triques sont faites sur la solution color6e obtenue aprbs 61imination du gel de silice p a r centrifugation.

2 - - Mesure de la radioactivitd chromatographiques.

des fractions

D ' a u t r e part la radioactivit6 des divers constituants est d6termin6e sur c h a c u n e des laches r6v616es p a r le r6actif du p h o s p h o r e de Dittmer [13] sur les c h r o m a t o g r a m m e s des ln6mes extraits lipidiques s6par6s, duns des c o n d i t i o n s analogues, sur u n e deuxi6me plaque. P o u r cela, l'acide silicique c o r r e s p o n d a n t h chaque spot est plac6 dans des fioles de comptage, puts soigneusement dispers6 dans 4 ml d'ean, auxquels on ajoute 1'0 ml de m61ange s c i n t i l l a n t Ins~agel (Soc%t6 Packard) p o u r o b t e n i r un gel stable. Apr6s 6 q u i l i b r a t i o n thermique, le comptage et la mesure du > sont r6alis6s an m o y e n d ' u n spectrom~tre h scintillation liquide T r i c a r b (Packard).

de l ' a n g u i l l e .

611

pr6conis6s par Skipski et aI. [16], on compare le c o m p o r t e m e n t c h r o m a t o g r a p h i q u e des phosphatides ainsi 61u6s du gel de silice et celui de substances de rbf6rences. En r6v61ant les chromatogrammes au m o y e n de r6actifs sp6cifiques comme le r6actif de Dittmer [13], le r6actif /~ la n i n h y d r i n e [17~ ou le r6actif de Vaskovsky et Suppes [18], on confirme la p r e m i b r e identification du compos6 isol6. Lorsque la puret6 du p h o s p h a t i d e s6par6 a 616 v6rifi6e, on effectue ensuite sur une autre p o r t i o n de l'61uat, une h y d r o l y s e p a r le m6thanol c h l o r h y d r i q u e 1,7 N h 100°C p e n d a n t 4 heures duns les c o n d i t i o n s de Skidmore [19]. Apr6s 6vaporation, l ' h y d r o l y s a t repris dans le m i n i m u m d'eau est d6pos6 sur u n e plaque de gel de silice et te c h r o m a t o g r a m m e d6velopp6 au m o y e n du solvant m 6 t h a n o l / e a u / a m m o n i a q u e 7 N (6:3:1). Les bases sont ensuite identifi6es par leur R e et p a r lear r6v61ation soit h la n i n h y d r i n e [17], soit au r6actif de Draggendorf [20J ou de Vakovsky et Suppes [18~. L'inositol est d6tect6 difficilement au m o y e n du r6actif au nitrate d ' a r g e n t ammoniacal [21].

3 - - Identification des dif[drents phosphatides.

Rt~SULTATS.

Dans ce cas, les phosphatides fractionn6s sur plaque s u i v a n t la .technique pr6c6denlmeut d6crite, son t localis6s au m o y e n de v a p e u r d'iode. Chaque tache ainsi d6cel6e est alors r6cup6r6e dans u n tube h centrifuger. Les lipides sont ensuite 61ufs au m o y e n d ' u n large volume du m61ange chlorof o r m e / m 6 t h a n o l / a c i d e f o r m i q u e / e a u (48:48:2:1) pr6conis~ par A b r a m s o n et Blecher [153. Apr6s 61imination du gel p a r centrifugation, la phase organique est concentr6e. Au m o y e n de chromatographies m o n o d i m e n s i o n n e l l e s , sur gel de silice H, en utilisant les couples de solvants et le protocole

I --

C O M P O S I T I O N EN P H O S P H O L I P I D E S DES TISSUS

DE L ' A N G U I L L E .

Chez l'anguille, la richesse en p h o s p h o l i p i d e s des divers organes a p p a r a i t conmle sp6cifique de c h a c u n des tissus envisag6s (tableau I). Ainsi, les teneurs en lipides phosphor6s oscillent de 1,45 p. cent du tissu frais p o u r la b r a n c h i e , organe le m o i n s riche en lipides (lipides totaux : 2,7 ± 0,1 p. cent du poids frais), h 2,2 p. cent pour le foie, tissus trSs l a r g e m e n t p o u r v u eu graisse chez ce poisson (lipides totaux : 8,8 ± 1,7 p. cent du poids

TABLEAU I.

Composition des phospholipides des diH~rents tissus ~tudi~s. (Phosphatides en pourcentage du P lipidique tota]). PI Rein . . . . . . . . . . . . . . . .

'744 -P_-_+--lip'

_SPfl _

,

36 (12) 12,3 _-/- 0,5 ] 52,0 Branchie . . . . . . . . . . . . /580 ~- 32 (12) 11,1 ~___0,6 52,1 Muqueuse intestinale.. 736-~- 52 (9)1 9 , 0 ~ 0 , 4 I 53,9 Foie . . . . . . . . . . . . . . . . 876~_48 (12)[ 6 , 8 1 0 , 3 59,8 Muscle . . . . . . . . . . . . . . . /132 + 20 (7)1 6,0-~ 0,2J 62,8

PS

PE

i

DPG

PC + 0,7 ! ,0 + ~ 0,5 ___ 0,5 + 0,9

3,0 3,4 5,1 3,9 4,2

-4- 0,2 +___0,1 + 0,5 + 0,2 ___~0,7

4,9 5,2 4,7 2,5 2,9

+ 0,4 _____0,1 -P 0,3 ~ 0,1 -k- 0,2

25,3 23,2 21,I 24,8 21,2

___~0,5] ~ 1,7 --~ 0 , 7 ~ 0,5 ___~0,5

2,3 3,2 2,3 2,7 1,5

~- 0,1 __+ 0,2 ~ 0,2 ~ 0,3 ___~0,3

(Anguille d'eau douce maintenue h 15°C). P lipidique (P lip.) en ttg de P par g de tissu frais. (Le chiffre entre parenthbses indique le nombre de valeurs retenues pour le caleul de la moyenne). SPH Sphingomy~line. PC Phosphatidvl choline ou 16eithine. PI Phosphatid3q inositol. PS Phosphatidyl sSrine. PE Phosphatidyl dthanolam~ne. DPG Diphosphatidyl glyedrol.

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 5.

612

G. Z w i n g e l s t e i n ,

R . M e i s t e r e t G. B r i c h o n .

frais). C'est p o u r q u o i alors que dans le foie les phosph.olipides r epr6sentent seulement 25 p. cent des lipides totaux, eeux ci c o n s t i t u e n t 35 p. cent des lipides du r e i n et 54 h 55 p. cent des lipides totaux d.e Ia b r a n e h i e .et de la m u q u e u s e intestinale. Ces phosphoglyc6rides e o m p r e n n e n t en g6n6ral une p r o p o r t i o n i m p o r t a n t e de p h o s p h a t i d y l - c h o -

tides sont aussi g6n6ralement prfisents ~ des conc e n t r a t i o n s moindres. La sphingomy61ine (de 7 "~ 12 p. cent) qui se s6pare so.uvent en deux fractions distinctes au cours des chromatographies, la phosphatidyls~rin.e (de 2,6 /t 5,3 p. cent), le p h o s p h a tidyl in.ositol (entre 2,9 et 4,5 p. cent) et le diphosp h a t i d y l glyckrol ou c a r d i o l i p i d e (entre 2,4 et 3,2 p. cent). E n outre, on distingue souvent des traces d'acide p h o s p h a t i d i q u e dans tes extraits d.e b r a n -

/l

103cpm/}:g de P. lip.

1 0 3 c p m / p g Pi

GRAPHIQUE Ib

GRAPHIQUE Ia

50

/ / Foie

// "" '

40

\

/ /

\ \

/

Foie

/

k

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30 •.

Rein

1 \

/.~/ Rein

20

//

Branchie 2

".. 10

/

I " ~

/

Inte s tin

1t

/ /

. ...."

J 6

12

24

48 h

6

t2

24

48 h

GIIAPttlQUE I.

a --

Variation dans le lemps de la radioaclivild sp~cifique du phosphate inorganique des tissus de l' anguille. b --- Varialion dans le temps de la radioactioit4 spdcifique du phosphore lipidique total des lissus de l' anguille.

Pour ehaque graphique la radioaetivitfi sp~eifique est exprimfie en 103 cpm par '~g de phosphore. Les barres verticales repr~sentent les valeurs extremes observ~es pour ehaque point (moyenne ealeulde sur 3 5 animaux par point).

line dont le pourcentage oscille entre 51 et 59 p. cent de l'ensembl.e. De n~,~me, la p h o s p h a t i d y l ~ t h a n o l a m i n e r epr~sente aussi u n autre c o m p o s a n t majeur de ce groupe de lipides (entre 22 .et 26 p. cen.t du p h o s p h o r e total)• Quatr.e autres phosphaBIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 5.

chie ou d'intestin. De m~me, on observe syst~mat i q u e m e n t la presence de l y s o p h o s p h a t i d y l choline dans les lipides de la m u q u e u s e intestinale, en prop o r t i o n n o n n~gligeable puisque ce compos6 repr~sente 3,3 p. oent du p h o s p h o r e l i p i d i q u e total.

Mdtabolisme

des phospholipides

R e m a r q u o n s q u e les a n a l y s e s d o i v e n t 4 t r e r 6 a l i s6es le p l u s r a p i d e m e n t p o s s i b l e a p r 6 s e x t r a c t i o n des fissus. E n effet, a p r 6 s p l u s i e u r s s e m a i n e s d e c o n s e r v a t i o n de ces l i p i d e s e n s o l u t i o n d a n s le benz6ne/m6thanol h--35°C apparaissent, au cours

de

l'anguille.

613

d e l a L P C , les a u t r e s c o m p o r t a n t d e l ' 6 t h a u o l a m i n e n f i g r e n t a u v o i s i n a g e de la S P H et d e la PC. P a r a l l 6 1 e m e n t o n c o n s t a t e u n e d i m i n u t i o n signific a t i v e d u p o u r c e n t a g e de P E d a n s les p h o s p h o l i p i d e s to,taux.

10 3 c p m / p s P

103cprn/pg P

GRAPHIQUE

GR.APHIQ U E IIa

Ilb

Branchie

Rein

5

6

12

24

6

48 h

12

24

48

103cpm/pg P

103cpm/~g P

] GRAPHIQUE IId

G R A P H I Q U E IIc

7

1.4

Foie

M u q u e u s e inte s t i n a l e

/ /

5

l

PC

/

/ / 0.6

3

PI

_9 6

12

24

48 h

6

!2

24

48 h

GRAPHIQUE II.

Variation compar~e de la radioactioit~ sp~cifique de la p h o s p h a t i d y l - c h o l i n e (PC : en t r a i t s discontinus) et du p h o s p h a t i d g l - i n o s i t o l (PI : en t r a i t s pleins) des lissus de l'anguille en eau douce. a - - tissu r6nal. b - - tissu br~inchial. c - - m u q u e u s e intestinale. d - - tissu h6patique. P o u r chaque g r a p h i q u e la radioactivit6 sp6cifique est exprim6e en 103 cpm p a r vg de phosphore, les valeurs rapport6es p o u r chacun des points r e p r 6 s e n t e n t les m o y e n n e s de 3 h 5 a n i m a u x . Les b a r r e s vcrticales i n d i q u e n t les valeurs extr4mes observ6es p o u r chaque temps.

des chromatographies, plusieurs taches parasites, l ' u n e c o n t e n a n t d e la c h o l i n e se s i t u e h h a u t e u r BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 5.

D e u x p o i n t s p a r t i c u l i e r s r e s s o r t e n t de ces a n a lyses. D ' u n e p a r t le foie et le m u s c l e c o n t i e n n e n t

614

G. Z w i n g e l s t e i n ,

R . M e i s t e r e t G. B r i c h o n .

la plus faible p r o p o r t i o n de sphingomy61ine (6,8 et 6,0 p. cent) aIors que fe r e i n (12,3 p. cent) et la b r a n c h i e (11,1 p. c e n t ) e n poss6dent une t e n e u r 61ev6e et l ' i n l e s t i n (8,9 p. cent)' une valeur m o y e n -

he. D ' a u l r e part, la p h o s p h a t i d y l s6rin,e p a r a l l beaucoup ptus concentr6e dans les 3' organes effec.teurs 4e l'osinor6gulation, la b r a n c h i e (5,2 p. cent), le r e i n (4,9 p. cent) a i n s i que la m u q u e u s e i n t e s t i n a l e (4,7 p. cent) ,et peu a b o n d a n t e dans le foie (2,5 p. cent), et le muscle (2,9 p. cent). 103cp~/pg P GRAPHIQUE

Ilia

in oivo a u moy.en d ' i n j e c t i o n de phosphate marqu6 au 32p. L ' i u c o r p o r a t i o n de ce t r a c e u r a 6t6 suivie au n i v e a u des diff6rents tissus sur une p6riode de 48 heures, temps au bout duquel la radioactivi.t6 sp6cifique du p h o s p h o r e i n o r g a n i q u e c o m m e n c e fi d6croitre (graphique Ia). Au cours de ce laps de temps l ' a c c u m u l a t i o n du 32p clans les phospholipides des p r i n c i p a u x organes reste r6guli6rement croissan4e (graphique Ib). Cepen4ant, le p o u r c e n lage de radioactivit6 retrouv6 au n i v e a u du phosp h o r e l i p i d i q u e demeure extr~inement f a i b l e (de l ' o r d r e de 1 ,h 3 p. cent de la radioactivit6 tissulaire

103cprn/pg P

GRAPHIQUE

Illb

/\ 12

\

/

\

/

/ \

/

/

\

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\

:/

•..

Foie

/'~

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/

I0

Foie

/-

/

6

/

Rein

/

. Rein

3

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/(

..""

°

,f

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/ ~.

~

~

.."'"

t"

./...

lntestin

_

-

m-

24

12

a-

Variation

dans

le temps

48 h GRAPHIQUE III.

6

de let radioactivitd spdcifique

12

Z4

de l'acide phosphatidique

45 b

des tissus de

t'anguilte. (Du fait de la tr~s faible concentration tissulaire de ce phosphatide, la radioactivi[d spdcifique de celui-ci a 6t6 calcul6e en prenant pour sa concentration tissulaire, les valeurs pr6c6demment d6termin6es sur d'antres lots d'anguil]es apr~s concentration de ce compos6 par chromatographic sur colonne de get de silice). b - - Variation dans le temps de la radioactivitd spdcifique de la phosphatidyl-~thanolamine des tissus de l'anguille.

Pour chaque graphique la radioactivit6 sp6ciflque du phosphatide est exprim6e en 10.3 cpm par ~tg de phosphore. II

--

INCORPORATION

DU

3ep in vivo.

1. - - I n c o r p o r a l i o n d a n s le p h o s p h o r e l i p i d i q u e total.

L'6tude du r e n o u v e l l e m e n t de la copule phosphate des phospholipides tissulaires a 6t6 r6alis6e BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 5.

totale, 1:2 heures apr6s l'injecti.on) t r a d u i s a n t u n faible taux de r e n o u v e l l e m e n t de la copule phosphate de ces composSs. La radio,activit6 la plus forte est observ6e dans les p h o s p h o l i p i d e s du foie, puis du rein, cons6-

Mdtabolisme

des p h o s p h o l i p i d e s

quence logique du marquage plus rapide du Pi de ces 2 tissus (graphique Ia). Dan,s de telles conditions, il n'est pas possible d'fivaluer et de c o m p a r e r l'intensit~ d.e la synth~se des ph.ospholipides de c h a c u n de ces organes, puisque la radioactivit~ du phosphore lipidique va ~tre f o n c t i o n de la radioactivit~ spficifique des p r 4 c u r s e u r s prgsen.ts dans c h a c u n des tissus.

2. - - R~partition du .~2p duns les diffOrents phosphatides des organes de l'anguilIe. La radioactivit6 sp~cifique de chac.un des constituants du groupe des p h o s p h o l i p i d e s 6volue suivant u n e cinfitique p r o p r e h c h a c u n d'eux et variable s u i v a n t l'organe c onsid6r6. Cependant, lorsque l'on compare en f o n c t i o n du temps l ' i m p o r tance de l ' i n c o r p o r a t i o n du a2p duns les diff~rents p h o s p h a l i d e s de . t o u s l e s tissus, on constate que ces lipides phosphor6s se divisent en deux groupes distincts :

de l ' a n g u i l l e .

615

la 48" heure apr+s l ' i n j e c t i o n du traceur. I1 s'agit de l'aeide p h o s p h a t i d i q u e dont les cin6tiques sont illustr&es par les courbes du gr.aphique l I I a dans lequel on a fait l%gurer la radioactivit~ de ce phosphoglyc~ride exprim6 en p o u r c e n t a g e de celle du P l i p i d i q u e total du tissu. On c onstate que ce eompos6 se comporte eomme un d~riv6 phosphor6 /~ marquage singuli6rement r a p i d e et pr6coce, puisque sa radioactivit6 repr6sente tr6s vile apr$s i n j e c t i o n du t r a c e u r une p r o p o r t i o n de l'activit6 du P lipidique bien sup6rieure h celles de la plupart des autres phosph,atides. De retiree, le phosp h a t i d y l i n o s i t o l a p p a r a i t aussi chez ce poikilotherme eomme u n colnpos6 /~ r e n o u v e l l e m e n t rapide et ceci pr6f6rentiellement dans les organes effecteurs de l'osmor6gulation. A leurs niveaux, sa r a d i o a c t i . i t 6 se m o n t r e tr~s nettement plus forte que celle de la p h o s p h a t i d y l choline ~t chaque temps d'exp6rience, alors que l'on d6e61e l'inverse dans Ie foie. Le DPG se pr6sente 6galement chez l'anguille comme un p h o s p h a t i d e particulier. P a r a l l 6 l e m e n t

TM~LEAU II. Radioactivit~ incorporde duns la fraction DPG et PC des tissus, en 24 et 48 heures. (En poureentage de la radioactivit(~ du P lip. tissulaire). Foie

DPG PC rapport DPG/PC

Branchie

Rein

lntestin

24 h

48 h

24 h

f~8 h

24 h

48 h

2t~ h

48 h

0,87

0,77 (0,54-0,87) 67,0 (66,5-69,3) 1,15 (0,81-1,32)

3,27 (3,07-3,29) 28,7 (23,0-35,3) 11,4 (10,2-13,9)

2,81 (2,37-3,35) 30,1 (24,8-35,1) 9,4 (6,7-13,7)

4,48 (3,80-5,06) 46,3 (45,7-49,8) 9,7 (8-11,8)

3,98 (3,49-4.19)

2,88 (2,39-3,65) 29,6 (27,5-31,7) 9,7 (s,2-1o,7)

1,70 1,63-1,72) 34,3 29,6-43,7) 5,1 4,3-5,5)

(0,54-1,09) 64,2 (61,8-67,1) 1,36 (0,90--1,63)

47,3 (46,2-48,8) 8,4 (7,6-9,7)

(Chaque valeur repr4sente la moyenne de 3 h 5 animaux ; entre parenthbses les valeurs extr4mes pour chaque temps).

a - - le groupe de l'acide p h o s p h a t i d i q u e et du p h o s p h a t i d y l inositol duns lequel la p r o p o r t i o n de radioactivit~ incorpor~e attein~t r a p i d e m e n t u n o p t i m u m dans la p I u p a r t des organes (graphiques II et II,Ia). b - - le groupe des autres compos~s PC, PE, PS, SP et DPG, dont la v a r i a t i o n de radioactivit~ sp~cifique a p p a r a i t c,omme homologue de celle du p h o s p h o r e lipidique extrait du tissu consider6 (graphiques II, IIIb, IVa, b). Parrot les p h o s p h a t i d e s du p r e m i e r groupe, un seul m o n t r e dans certains tissus (foie, rein et intestin} u n m a x i m u m de marquage net entre la 24 ° et

BIOCItlMIE, 1975, 57, n o 5.

au p h o s p h a t i d y l inositol, ce lipide diphosphor6 manifeste dans t o u s l e s organes autres que le rote, u n e radioacfivit6 sp6cifique plus forte que celle de la PC d u r a n t route l'exp6rience (voir tableau I1). De plus, au n i v e a u du rein, la copule phosphate de ce dbriv6 s'6ch,ange avec u n e intensit6 b i e n plus grande que celle observ6e duns le tissu h6pafique (graphique IV). Cette forte radioactivit6 localis6e duns la tache c o r r e s p o n d a n t au DPG des extraits de rein, p o u v a i t ~tre le fair d ' u n e c o n t a m i n a t i o n de cette fraction par un eompos6 tr6s radioactif. Cependant, aprbs 61ution de cette zone puts coc h r o m a t o g r a p h i e de l'61uat avec du DPG inerte, dans les diff6rents systblnes de solvants d6finis

616

G. Z w i n g e l s t e i n ,

R . M e i s t e r et G. B r i c h o n .

p a r Slkipski et al. [16], on r e t r o u v e le r a d i o i s o t o p e localis6 an niveau de c e compos6. P o u r les autres p h o s p h a t i d e s comme la PC, PE, PS et SPH, la r a d i o a c t i v i t 6 observ6e s'6chelonne, dans les diff6rents tissus suivant un o r d r e variable. P o u r la P:C, l ' i n c o r p o r a t i o n la plus forte a lieu d a n s ]e foie, p , i s le rein, la b r a n c h i e et la muqueuse i n t e s t i n a l e ( g r a p h i q u e II). La r a d i o a c t i v i t 6

o3~p~/~g e

me p r o c h e de celle de la PC, dans la b r a n c h i e et la nmqueuse i n t e s t i n a l e celle-ci c o r r e s p o n d ~ 3 ou 4 fois la radioacfivi~6 spbcifique de la PC. I1 e n e s t de m(~rue en ce qui c o n c e r n e ]a PS, dont la r a d i o activit6 6value en f o n c t i o n du temps, suivant une cinbtique c o m p a r a b l e h celle du P l i p i d i q u e total darts la p l u p a r t des tissus ( g r a p h i q u e IVa). Darts la majorit~ des organes 6tudi6s, la r a d i o a c t i v i t 6 sp$cifique de ce p h o s p h a t i d e d e m e u r e toujours tr6s inf6-

103cpm/pg p

GRAPHIQUE IVa

GRAPHIQUE IVb ..""""'I

• Rein Foie

/ J•°'•

/ / /

•

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"

~____~__ 6

]2

/

•'

/

....... 24

a .... Variation dans le temps l'anguille. bVariation dans le temps I' anguille.

~ Intestin

•/

.

..' " 6

48 h GRAPHIQUE IV. de Ia radioactivitg sp~cifique

/

~

__--4"12

"Foie

'

/

In2 ~in

24

de la p hosphatidyl-sdrine

de la radioaclioitd spdcifique du diphosphalidyl-glycdrol

1 48 h

des tissus

de

des tissus de

La radioactivit6 spdeifique est exprimde en 103 epm par 'ttg de phosphore.

sp6cifique de la P E v a r i e aussi d ' u n e fa~on analogue clans les divers tissus ( g r a p h i q u e HI); mats ce compos6 se r6v61e p r o p o r t i o n n e l l e m e n t beaucoup pl.us r a d i o a c f i f dans la b r a n c h i e , la m u q u e u s e i n t e s t i n a l e et le rein. Darts ces t r o i s organes, la r a d i o a c t i v i t 6 sp6cifique de la P E reste b e a u c o u p plus forte que celle de la PC p e n d a n t route I'exp6r i e n c e (tableau III). Ainsi, alors que darts le foie la r a d i o a c t i v i t 6 sp6cifique de la P E a p p a r a i t comBIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 5.

r i e u r e h celle de la PC~ sauf en ce qui c o n c e r n e la b r a n c h i e off la r a d i o a c f i v i t 6 sp6cifique de la PS a p p a r a i t c o n s t a m m e n t trbs p r o c h e de celle de la 16cithine. En outre, p e n d a n t . t o u t e la dur6e de l ' e x p 6 r i e n c e , la sphingomy61ine pr6sente une r a d i o a c t i v i t 6 tr~s faible dont l'6volution dans le temps semble tr6s lente.

617

3l~tabolisme des p h o s p h g l i p i d e s de l'anguille. TABLEAU i I I .

Radioactivit~ sp6ci[ique et radioaetivit~ relative des [ractions PE et PC des tissus de l'angaille, 24 heures et 48 heures apr6s injection du traceur. Radioaetivit6 sp6eifique

Radioaetivite relative

Radioactivit6 relative PE ltadioaetivite relative PC

PE

PC

PE

PC

24 h

3220 (3070-3270)

3060 (2620-3600)

29.0 (25.6-32.8)

64.2 (61.8-67.1)

0.45 (0.39-0.54)

48 h

6O90 (5920 6820)

(6750-8150)

24.6 (24.6-24.8)

67.0 (66.5-69.3)

0.37 (0.37-0.36)

24 h

1280 (750 1620)

350 [190-690)

42.9 ( 4 0 . 8 - 45.1 )

28.7 (23.0-35.8)

1.50 (1 •61-1.81)

48 h

1560 (1210-2010)

510 (420-790)

40.1 (33.6-45• 2)

30• 1 (24.8-35.1)

I .34 (1.18-1.57)

24 h

1560 (1340-1850)

1111) (920-1560)

30.8 (25• 6 - 3 2 . 5 )

46.3 (45.7-49.8)

0.67 (0.59-0.72)

48 h

4010 (3280-4920)

2380 (1920-345( 9

35.6 (34.0-38.6)

47.3 (46.2-48.8)

0.75 (0.69-0• 84)

24 h

280 (230-320)

98 (97-100)

34.3 (31.4-37.3)

29.6 (27.5-31.5)

1.16 (0.95-1.31)

48 h

640 (490-790)

(160-330)

40.2 (36.6-45.1)

34.3 (29.6-43.7)

1.18 (0.81-1.48)

Foie

Branehie

Rein

Intestin

7230

230

R a d i o a e t i v i t 6 sp6eifique : en e p m / u g de P ; r a d i o a c t i v i t 6 r e l a t i v e : en e p m p o u r cent des e p m d u P lipidique. C h a q u e v a l e u r r e p r 6 s e n t e la m o y e n n e de 3 h 5 a n i m a u x . E n t r e p a r e n t h b s e s les v a l e m ' s e x t r 4 m e s p o u r c h a q u e point• RAS RAS

PI PC

RAS RAS GRAPHIQUE

GRAPHIQUE

Va

100 50

DPG PC Vb

i00 •

10

50

Branchie

• ..•

I0 ..

.~.

Intestin

.~. . Branchie

5

".. • " "''" •..

Rein •

•

. .

°

•

.

. • • ,

~

"" •..

Intestin

1

Foie

Foie

6

12

24

48 h

6

12

24

48 h

GRAPHIQUE V.

Comparaison des variations de la radioaclivit~ spdcifique du phosphatidgl-inositol et du diphosphatidglgh.lcdrol gt celles de la phosphatidgl-choline, pour chaque tissu de l'anguille d'eau douce. a - - V a r i a t i o n du r a p p o r t e n t r e la r a d i o a c t i v i t 6 sp6eifique du p h o s p h a t i d y l - i n o s i t o l et eelle de la p h o s phatidyl-eholine. b - - V a r i a t i o n du r a p p o r t e n t r e la r a d i o a c t i v i t 6 sp6eifique du d i p h o s p h a t i d y l - g l y c 6 r o l et eelle de la p h o s p h a t i d y l - c h o l ine.

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 5.

43

G. Z w i n g e l s t e i n , R . M e i s l e r el G. B r i c h c n .

618

Ainsi, sp~ci,fi~quement dans les organes effect.eurs de l'osmor6gulation (branchie, rein, inlestin) de l'anguille adapt~e ",i l'eau douce, le m~tabolisme relatif de la copule phosphate de eertains phospholipides tels le PI et le I)PG s'effectue avec n n e intensit& a p p a r e n t e plus grande que celle mesur~e au n i v e a u du tissu h6patique. Dans le but de pr~ciser ce ph6nom~ne, nous avons regroup6 dans le g r a p h i q u e V l e s v a r i a t i o n s d a n s - l e :temps du rapport existant entre la radioactivit5 sp~cifique de c h a c u n de ces deux p h o s p h a t i d e s (PI et DPG) et celle de la PC de chaque organe.

Les seules diff6rences s t a t i s t i q u e m e n t significatives (P --~ 0,01) c o n c e r n e n l deux des c o n s t i t u a n t s nfineurs : la sphingomy61ine et la p h o s p h a t i d y l s6rine, plus a b o n d a n t s dans les .trois organes effecteurs de Fosmor6gulation. Ainsi, la c o n c e n t r a t i o n relative de la sphingomy&line (d6finie p a r le rapport c o n c e n t r a t i o n .tissulaire de SPH sur concent r a t i o n de PC) est 6gale h e n v i r o n 0,2 p o u r la branchi.e (0,2.1), le rein (0,24) et la m u q u e n s e intestinale (0,17) et h 0,1 pour le foie ('0,11) et te muscle (0,10). Donc b i e n sup6rieure dans les tissus off les ~changes d'eau et Wions sont importants.

A t o u s l e s temps de l'exp~ri.ence, ces r a p p o r t s ont dans les .organes osmor~gulateurs une valeur bien sup~rieure h celle observ~e dans le foie.

I1 en est de m6me en ee qui c o n c e r n e la phosp h a t i d y l s~rin.e dont la c o n e e n l r a t i o n relative p a r r a p p o r t h la P'C passe d'.une valeur proche de 0,1 dans les organes effeeteurs de l'osmor6gulation (branchi.e 0,10 - - r e i n 0,096 - - m u q u e u s e intestinale 0,08) h n n e vale:ur moiti~ p o u r le tissu h~patique (0,'043) et m u s c u l a i r e (0,047). Ces c o n c e n t r a tions relatives b i e n partieulibres, observ6es dans le cas de eer.tains p h o s p h o l i p i d e s des tissus h fonetion osmor6gulatrice d6velopp~e, sugg~renl une relation possible entre ces d.eux faits. Dans la plupart des m e m b r a n e s biologiques une disposition asym~trique des p h o s p h o l i p i d e s a 6t6 mise en ~vidence [26, 271. La eouehe e x t e r n e a p p a r a i t comme p r i n c i p a l e m e n t eonstitu&e de lipides phosphor6s h choline E28~ alors que la couehe i n t e r n e semble trbs riche en PE ,et PS [29], compos~s dont on connait r i m p o r t a n c e pour le m a i n t i e n de l'activit6 de plusieurs enzymes m e m b r a n a i r e s li6es au transport des ions [30]. Ces observations d e m a n d e n t done h 8tre .approfondies, notamm.ent par l'analyse des p h o s p h o l i p i d e s eonstitutifs des p r i n c i p a l e s structures des esp&ces cellulaires pr6sentes dans ces divers organes.

DISCUSSION.

1. - - Composition des tissus en phospholipides. De cette Oude comparative des lipides phosphor6s pr6sents dans les divers organes de Fang.uille d'ean douee, plusieurs r e m a r q u e s p e u v e n t 6tre formul~es. D ' u n e part les r~sullats rassembl6s dans le tableau I ayant trait h la rfipartition des phosphatides de la b r a n c h i e et du foie sont, dans leur ensemble, ,e.n accord avec les donn6es de la liltfirature relatives h cette esp~ce [9] et ~ d'autres [23, 24~. Une lbgbr.e divergence existe cep,endant dans les taux de P~C rapp.ort~s dans cette p u b l i c a t i o n et ceux p r 6 c 6 d e m m e n t cit6s [9]. C.elle-ci pent ~tre due en partie h l'influence exerc6e sur le taux des c o n s t i t u a n t s cellulaires p a r des faeteurs 6cologiqtms tels que la saison ou la temp6rature du m i l i e u de vie el .en p a r t i e aux m6thod.es analytiques diff~rentes employ6es lots de ces deux experiences. D.ans le p r e c e d e n t travail [9], la n~c.essitfi de p r e p a r e r des quantit6s i m p o r t a n t e s de ehaque p h o s p h a t i d e afin d'en effectuer u n e identification pr6eise, nous av.ait amen6s h p r a t i q u e r un.e s6par.ation pr~alable des p h o s p h a t i d e s h choline, p a r ch:romatographie sur c o l o n n e d'acide silicique. Ce.tte .operation supplSlnentaire e n t r a i n a i t u n e 16g~re sous-estimalion de la c o n c e n t r a t i o n e n PC. p a r suite d ' u n e r6tention partielle de ee compos6 sur l ' a d s o r b a n t . D ' a u l r e part, l o r s q u ' o n d6taille la c o m p o s i t i o n des p h o s p h o l i p i d e s de l'anguille, on d6c~l,e u n e s i m i l i t u d e assez g r a n d e p o u r tous l.es tissus darts les p r o p o r t i o n s des p h o s p h a t i d e s les plus abondants : la p h o s p h a t i d y l choline (de 52 fi 59 p. cent du phosphore lipidique) et la p h o s p h a t i d y l 6thanol a m i n e (de 21 h 25 p. cent du p h o s p h o r e l i p i d i q u e total).

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2. - - I n c o r p o r a t i o n lipidique.

du .3~p dans le p h o s p h o r e

L'anguille 6tant u n p o i k i l o t h e r m e dont la telnp6rature p a r d~finifion varie avec celle du milieu, ce facteur va t e n d r e /I modifier le d~rouleme,nt de certains processus physiologique. Ainsi dans notre expbri.ence, la d i s t r i b u t i o n du 32p o r t h o p h o s p h a t e dans les divers tissus de l'anguille a p p a r a i t cornme tr~s lente p a r r a p p o r t h celI.e obs.erv~e chez l ' h o m 6 o t h e r m e et ceci, sans doute, du fait de la tempbrature du milieu de vie proehe de 15°C [251. De la l e n t e u r de ces 6changes va d6couler u n 6talement dans le t.emps de l ' a p p o r t de radio-isotope au tissu. E n contre partie, ceci va d&terminer u n accroissement progressif de la radioaclivit6 sp6cifique du phosphor.e i n a r g a n i q u e et du p h o s p h o r e organique acido-soluble tissulaire se p r o l o n g e a n t sur un laps de temps bien sup~rieur h celui cons-

M ~ t a b o l i s m e des p h o s p h o l i p i d e s tat6 chez l'hom6otherme (graphique Ia). P a r suite, l ' i n c o r p o r a t i o n du r a d i o p h o s p h o r e dans les lipides de l'anguille aura lieu s u i v a n t u n e cin6tique p r o p r e /t l'esp6ce. E n t r e autre, la radioactivit~ spficifique du p h o s p h o r e lipid,ique des diff6rents tissus crolt d ' u n e m a n i 6 r e r6guli6re d u r a n t les 48 heures s u i v a n t l'injection, sans pr6senter a p p a r e l n m e n t de m a x i n m m (graphique Ib). Une ln6me cin6tique a d'ailleurs 6t6 observ6e chez Carassius auratus [23], .off l ' i n c o r p o r a t i o n du 32p dans les divers p h o s p h a t i d e s de la b r a n c h i e et du foie a p p a r a i t comme croissante p e n d a n t 48 heures. Ceci doit do.nc r6sulter de la s u p e r p o s i t i o n de deux ph6nom6nes. D ' u n e p a r t les 6changes du phosphate au niveau des tissus doivent 6tre relativement lents p u i s q u ' a u cours de notre exp6rience (temp6rature voisine de 15°C), darts la p l u p a r t des organes, l'6quilibre entre la radioactivit6 du Pi tissulaire et plasmatique n'est pas encore atteint apr6s 24 heures [25!. D'autre part, la synth6se des p h o s p h o l i p i d e s serait peu active, car la radioactivit6 sp6cifique du P l i p i d i q u e est en g6n6ral, suir a n t le tissu, de 50 h 100 fois plus faible que celle du Pi tissulaire apr6s 12 heures d ' i n c o r p o r a t i o n et .encore de 3 ~ 10 fois plus faible apr6s 48 heures. Dans de telles conditions, nous a11ons d6celer au niveau de certains p h o s p h a t i d e s des p a r t i c u l a r i t 6 s m6taboliques qui, chez Fhom6otherme, du fair de leur bri6vet6, sont difficilement analysables. Ainsi observe-t-on le marquage i n i t i a l tr6s i n t e n s e de l'acide p h o s p h a t i d i q u e dont la radioaclivit6 se r6v~le d'embl6e (6 h e a r e s apr6s i n j e c t i o n du tra~eur) tr~s importante, bi.en sup6rieure ~ celle de tous les autres p h o s p h a t i d e s pr6sents dans les lipides tissulaires. Cette cin6tique rapide r6sulte sans doute de l'6change lui m6me rapide du phosphate .entre tes p r 6 c u r s e u r s phosphor6s de l'acide p h o s p h a t i d i q u e et u n ¢ pool >> phosphate dont la radioactivit6 s'accroit tr6s r i t e apr6s l ' i n j e c t i o n du t r a c e u r et p r o b a b l e n l e n t en relation 6troite avec te plasma sanguin.

de l ' a n g u i l l e .

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une biosynth6se des p h o s p h o l i p i d e s p r o p r e s 'h c h a c u n d'eux, mats surtout diff6rente de celle du tissu h6patique. Cependant, si dans c h a c u n de ces organes le r e n o u v e l t e m e n t du group.e phosphate de la p l u p a r t des p h o s p h a t i d e s s'effectue d ' u n e manibre pratiqu.ement i n d 6 p e n d a n t e , il n ' e n est pas de m6me en ce qui c o n c e r n e la PE et la PC dont les c.in6tiques de marquage sont tr6s parall61es, b i e n que d'intensit6s variables, dans tous les tissos (tableau III). Ce fait s'accorde p a r f a i t e m e n t avec le sch6ma de biosynthbse des p h o s p h o l i p i d e s dans lequel la majeuve partie de la PC et de la PE se forme s u i v a n t des processus analogues, au cours desquels la base activ6e sous forme de CDPcholine ou GD,P-6thanolamine se greffe sur un diglyc6ride pour c o n d u i r e aux p h o s p h a t i d e s corr e s p o n d a n t s [31]. D u r a n t cette s6quence, l'activation de la choline s'effectue en deux 6tapes successives. P e n d a n t la premiere, un r a d i c a l phosphate p r o v e n a n t de I'ATP v i e n t est6rifier la fonction alcool de la base pour d o n n e r la p h o s p h o r y l choline ou 6thanolamine. Au cours de la deuxi6me 6tape s~ p r o d u i t le transfert d ' u n groupe cytidylyl phosphate du CTP vers ces deux mol6cules pour cr6er la CDP-choline et la CDP&thanolamine. Dans de tell.es conditions, au niveau d ' u n m6me tissu, la radioactivit6 sp6cifique des nucl6otides triphosphor6s, d o n n e u r s de phosphate, restera semblable p o u r les deux p h o s p h a t i d e s et la quantit6 de radioactivit6 i n c o r p o r 6 e dans c h a c u n de ces compos6s sera p r o p o r t i o n n e l l e ~ leur vitesse relative de synth6se. De lh, aux diff6rents temps d'exp6rience, les valeurs du r a p p o r t de la radioactivit6 totale de la P E sur cetle de la P.C, p o u r u n m~me poids de tissu, f o u r n i r o n t nne e s t i m a t i o n du r a p p o r t des vitesses relatives de renouvellem e n t de leur copule phosphate.

3. - - Incorporation du ~2p dons les diff~rents phosphatides.

Au cours de notre e x p e r i m e n t a t i o n , les valeurs calcul6es de ee r a p p o r t d e m e u r e n t h peu pr6s constantes entre la 12" et la 48" heure apv6s injection du traceur. Elles sont ~gales /l 0,41 ± 0,03 (10 valeurs) pour te foie, h 0,70 ± 0,04 (11 valeurs) p o u r le rein, h 1,07 +_ 0,18 (10 valeurs) p o u r la nmqueuse intestinale et h 1,68 _+ 0,35 (11 valeurs) p o u r la b r a n c h i e .

Chez les a n i m a u x supSrieurs, chaque tissu pr6sente u n m6tabolisme caract6ristique e n r a p p o r t avec son r61e physiologique. Chez l'anguille, antmat off les 6changes d'eau et d'ions sont tr6s intenses et tr6s variables s n i v a n t le m,ilieu [5], cette diff6renciation m~tabolique des organes devient p a r t i c u l i ~ r e m e n t nette dans le cas du r e n o u v e l l e m e n t de la copule phosphate de ses lipides phosphor6s. Ainsi, chez cette esp~ce, les organes effecteurs de l'osmor6gulation p r 6 s e n t e n t

A la temp6rature de 15°C, il s ' i n c o r p o r e done chez l'anguilte d'eau douee e n v i r o n deux fois plus de mol6cules de 32PO 4 dans la PC que dans la PE du foie, 1,5 fois plus dans le r e i n et u n e quantit6 5gale p o u r la PC et la PE de la n m q u e u s e intestinale. Cependant, dans la b r a n c h i e , le phosphate semble s ' i n c o r p o r e r deux fois plus r i t e dans le PE que dans la PC. Ceci peut r6sulter, dans cet organe, soit d ' u n e vitesse accrue d'6change de la copule phosphate de la PE p a r r a p p o r t h la PC,

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G. Z w i n g e l s t e i n , R. Meister el G. Brichcn.

soil d ' u n e p a r t i c i p a t i o n plus i m p o r t a n t e d'autres m 6 c a n i s m e s d.ans la f o r m a t i o n de ces deux phosphatides. Ainsi, ta deuxi~me vote d'e synthbse de la PC, par m 6 t h y l a t i o n s successives de la PE, gr~ce h la S-ad6nosyl m 6 t h i o n i n e comme d o n n e u r d.e m6thyl [32] .et qui a 6t6 d6cel6e dans u n g r a n d n o l n b r e de tissus d'hom6othermes [33], sera4t peu active dans la p l u p a r t des organes de l'anguille, sauf peut 6tre en ce qui c o n c e r n e la b r a n c h i e . A son n i v e a u en effet, la radioactivit6 sp6cifique de la P E (~em.eure t o u j o u r s tr~s sup.6rieure h celle de la PC (RAS PE/RA, S ~PIE ~ 3) (tableau III), ce qui n'exclut pas la p a r t i c i p a t i o n d ' u n e telle r6action dans la f o r m a t i o n d ' u n e p a r t i m p o r t a n t e de la PC b r a n chiale. Les diff6rences lnarqu~es observ~es dans la composition en acides g.ras de ces deux types 4e phosp h o l i p i d e s seraient i m p u t a b l e s h l'existence de processus de t r a n s f e r l s sur ceux-ci de groupes acyl-sp6cifiques. C.ette troisi~me vote d.e synth~se p r o c u r e aux ceIlules le m o y e n de modifier la r 6 p a r t i t i o n &es acides gras pr6sents dans les diff6rents p h o s p h a l i d e s constitutifs de leurs structures m e m b r a n a i r e s . Ce processus m6tabolique d e m a n d e l ' h y d r o l y s e partielle des diff6rents p h o s p h a t i d e s avec f o r m a t i o n de form'es lyso- suivie de leur acytation au m o y e n d'acyl-CoA de structures d6termin6es [35]. Ge type de m 6 c a n i s m e devient en p a r t i c u l i e r p r 6 p o n d 6 r a n t chez le rat lors du renouvellement 4e la f r a c t i o n des 16cithines h6p.atiques h forte t e n e u r en acides gr,as tr~s insatur~s [35]. Or, chez l'anguille, les acides gras, .est6rifiant le glyc6rol dans la PE et la PC des divers tissus, se r6vblent trbs riches .en acides docosahexaenoiques C22:6 [3.6]. E n outre, l'existence de lysol6c,ithine et la pr6sence de phospholipase A dans certains tissus de l'anguille [37] r e n d e n t plausibles le d6r o u l e m e n t d ' u n tel in6canisme dont la n6cessit6 peut de plus se faire jour, lorsque l ' a n i m a l se trouve soumis h de fortes v a r i a t i o n s d,e la temp6rature du mil.ieu [38]. A c5t6 de ces p h o s p h o l i p i d e s majeurs, la sphingomy61ine fail preuve d ' u n e activit6 m~tabolique a p p a r e n t e r e l a t i v e m e n t faible dans t o u s l e s tissus de l'anguille. Mats ,il n ' e n est pas de m6me p o u r la p h o s p h a t i d y l s6rine, puisque 4ans la b r a n c h i e la radioactivit6 de ce p h o s p h a t i d e reste i6gbrement plus 61ev6e que cell.e de la PC. Ce ph~nom~ne localis~ h cet organe est peut ~tre e n r e l a t i o n avec le r61e de ce p h o s p h a t i d e dans l'activit~ de quelques enzymes n~cessaires aux 6changes respiratoires et m i n 6 r a u x [39]. ,Le I)PG, surtout localis6 au n i v e a u de la mitoc h o n d r i e [40], se m a r q u e d ' u n e m a n i ~ r e relative-

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inent peu i n t e n s e dans la p l u p a r t des tissus de l ' a n g u i l l e (graphique IVb)'. La radioactivit6 i n c o r por6e dans ce compos6 p a r r a p p o r t h celle pr6sente dans les phospholipid.es totaux d e m e u r e en g6n6ral assez faib~e (table,au II), de l ' o r d r e de 0,8 p. cent de la radioactivit6 des p h o s p h o l i p i d e s totaux dans le fo%, de 2,8 h 3,3 p. cent dans la b r a n c h i e , de 3,9 h 4,5 p. cent dans le r e i n et de 1,8 h 2,9 p. cent dans la m u q u e u s e intestinale. Ces r6sultats c o n c o r d e n t bien avec la p l u p a r t des observations faites sur les tissus des hom6othermes. Chez ces .espbces le r e n o u v e l l e m e n t de ce compos~ se r6v~le tr~s ~lent in vivo dans le foie F~I, 47], le rein E43, 44, 45], le muscle c a r d i a q u e ~46] et in vitro dans les m i t o c h o n d r i e s du foie [42]. C e p e n d a n t notre 6tude compar6e fait apparaitre l'existence d ' u n e sp6cificit6 d.e certains tissus vis-h-vis de la synthbse du DPG. G'est ainsi que 24 h 48 heures aprbs l'injec:tion, l ' i n c o r p o r a lion d:u 32p d ans ce compos6 repr6sente de 1,4 •~ 1,2 p. cent de celle d.6cel6e dans la PC pour le foie, de 12 h 10 p. cent p o u r la b r a n c h i e , de 10 h• 9 p. cent p o u r le r e i n et de 10 h 5 p. cent p o u r la n m q u e u s e intestinale (tableau II). Ces valeurs sont en accord avec celles rapport6es d a n s la litt6rature et c o n c e r n a n t la r 6 p a r t i t i o n de la radioactivit6 dans les p h o s p h o l i p i d e s b r a n c h i a u x et h6patiques de l'anguille [9], ainsi que dans les p h o s p h a t i d e s m i t o c h o n d r i a u x de la b r a n c h i e et du foie de poisson rouge (Carassius auratus) [23]. Dans notre exp6rience, les divergences constat6es darts les intensit6s reiatives d ' i n c o r p o r a t i o n du radioisotope au n i v e a u d,e ces divers tissus ne sont pas i m p u t a b l e s h de fortes diff6rences dans les c o n c e n t r a t i o n s tissulaires du DPG (voir t a b l e a u I). Celles-c4 d6coulent plutSt, chez ce poisson, de particularit6s p r o p r e s aux organes effecteurs de l'osmor6gulation dans le r e n o u v e l l e m e n t de la copule phosphate du DPG. Ce p h 6 n o m b n e peut r6sulter : soit de l'existence clans ces tissus d'6changes locaux de phosphates plus r a p i d e s e n t r a i n a n t un a c c r o i s s e m e n t plus g r a n d de la radio activit~ sp6cifi~.que du Pi au n i v e a u des comp a r t i m e n t s off se r6alisent les diverses 6tapes de la biosynth~se d,e ce compos6 [48], soit d ' u n r e n o u v e l l e l n e n t plus i n t e n s e de l'acide p h o s p h a tidique [49] ou du GDP~4iacyl glyc6rol p,r6curseurs de ce p h o s p h a t i d e [50], soit d ' u n e partic i p a t i o n effective dans ces lissus d,e la possibilit6, existante chez les bact6ries, de synth~se du DPG par c o n d e n s a t i o n de deux mol6cu.les de PG [60, 61], i n t e r m 6 d i a i r e plus p r o c h e d.e l'acide p h o s p h a t i dique, soit d ' u n e vitesse de r e n o u v e l l e m e n t plus grand, e du DPG lui-m6me a u n i v e a u de ces tissus m 6 t a b o l i q u e m e n t trbs actifs et dont c e r t a i n e s cellutes sont p a r t i c u l i ~ r e m e n t riches .en m i t o c h o n -

Mdtabolisme des phospholipides de l'anguille. d r i e s [51]. C e p e n d a n t , l o r s q u e l ' o n c o n s i d ~ r e p a r a l l ~ l e m e n t la v a r i a t i o n de r a d i o a c t i v i t 4 du phosphatidyl inosilol, autre phosphatide ayant l ' a c i d e p h o s p h a . t i d i q n e c o m m e p r ~ c u r s e u r , Fun des d e u x p r e n f i e r s m 4 c a n i s m e s d e v i e n t p l u s p l a u sible. Le p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l q u i se m a r q u e tr6s r a p i d e m e n t d a n s b e a u c o u p de tissus d ' a n i m a u x h s a n g c h a u d [52, 53, 54] se r~vble aussi c o m m e trbs f o r t e m e n t ,radioactif d a n s les 3 o r g a n e s p r 6 c & dents. Le a2p i n c o r p o r ~ d a n s c e l u i - c i r e p r 4 s e n t e , 6 h e u r e s aprbs i n j e c t i o n d u r a d i o i s o t o p e , de 30 h 4'0 p. c e n t de la r a d i o a c t i v i t 6 t o t a l e du p h o s p h o r e l i p i d i q u e de la b r a n c h i e , de la m u q u e u s e intest i n a l e el du rein. An n i v e a u du foie, ce p o u r c e n t a g e ne d6passe pas 4,5 p. cent. I1 r e s s o r t de ces o b s e r v a t i o n s q u e la d i s s o c i a t i o n e n t r e les d i f f 6 r e n t e s v o t e s de b i o s y n t h b s e des p h o s p h a t i d e s , d e v i e n t e x t r S m e m e n t nette d a n s l es o r g a n e s effec.teurs de l ' o s m o r ~ g u l a t i o n c h e z l ' a n guille. A i n s i le P I et le D P G qui se f o r m e n t "a p a r t i r d ' u n C D P - d i g l y e ~ r i d e d6r.iv.ant de I'AP a v a n t sa d 6 p h o s p h o r y l a t i o n [55] p r ~ s e n t e n t , d a n s les tissus b r a n c h i a u x r 6 n a u x et i n t e s t i n a u x , u n e c i n 6 t i q u e de m a r q u a g e i n d 6 p e n d a n t e de celles de la PC et 4e la P E , l e s q u e l s se s y n t h 6 t i s e n t ~ p a r t i r de p r 6 c u r s e u r s p h o s p h o r ~ s de p r o v e n a n c e diff6r e n t e I56]. Ces r~sultats r e f l O e n t p r o b a b l e m e n t l ' e x i s t e n c e de p l u s i e u r s c o m p a r t i m e n t s d a n s lesq u e l s la s y n t h ~ s e de ces p r 4 c u r s e u r s s ' e f f e c t u e p a r t i r de p h o s p h a t e d o n t la v i t e s s e de r e n o u v e l l e m e n t d o l t ~tr.e v a r i a b l e s u i v a n t le tissu et l e u r l o c a l i s a t i o n c e l l u l a i r e ou i n t r a c e l l u l a i r e . C h e z le p o i s s o n , la b r a n e h i e , le r e i n et la m n q u e n s e i n l e s t i n a l e c o n s t i t u e n t des tissus off les ~ c h a n g e s e n t r e le m i l i e u anabiant et le m i l i e u i n t & r i e u r s o n t p a r t i c u l i & r e m e n t i n t e n s e s . O r g a n e ~ r61e m u l t i p l e , sp6cialis~ d a n s les 6 c h a n g e s g a z e u x m a i s aussi d a n s la r 6 g u l a t i o n de l ' 6 q u i l i b r e i o n i q u e , la b r a n c h i e , en eau d o u c e , v a ~tre le c e n t r e d ' t m e i m p o r t a n t e e n t r e e d'.eau m a i s aussi d ' u n t r a n s p o r t a c t i f de N a c l du m i l i e u ex,t ~ r i e u r v e r s le p l a s m a [57]. D a n s ce but l'~pi,th6lium b r a n c h i a l c o n > p r e n d , en p l u s des c e l l u l e s r e s p i r a t o i r e s , des cellules h m u c u s et des e e l l u l e s "h e h l o r u r e s r i c h e s e n m . i t o c h o n d r i e s et d o n t l ' i m p o r t a n e e d a n s le m a i n t i e n de la b a l a n c e h y d r o - m i n 6 r a l e d.e l ' a n i m a l a ~t6 amplem.ent d ~ m o n t r 6 e I58, 59]. D a n s le r e i n s ' e f f e c t u e de m S m e u n e i n t e n s e f i l t r a t i o n g l o m 4 r u l a i r e d ' e a u e n t r a i n a n t c h e z le p o i s s o n d u l e i e o l e u n e f o r t e e x c r e t i o n u r i n a i r e [62]. Ces m o u v e m e n t s d ' e a u s o n t a e c o m p a g n ~ s , d a n s cet o r g a n e , d ' u n e f o r t e r 6 a b s o r p t i o n des .ions m i n 6 r a u x au n i v e a u des t u b u l e s ~63]. A i n s i d a n s ces d i f f 6 r e n t s tissus v o n t d o n e e x i s t e r , "a e6t~ de s t r u c t u r e s t i s s u l a i r e s c l a s s i q u e s

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fi 6 c h a n g e s r e l a t i v e m e n t lents, des z o n e s /t ~changes r a p i d e s a v e c le m i l i e u int~ri.eur. A.u n i v e a u d.e c.elles-ei le a p p a r e n t des d i v e r s 61~ments c e l l u l a i r e s et, e n t r e autres, de c e r t a i n s phospholipides, apparaitra beaucoup plus distinct q u e c e l u i o b s e r v ~ d a n s les tissus h o m o l o g u e s des hom6othermes. D'autr.e p a r t , l ' a n g u i l l e p e u t s u b i r an c o u r s de sa v i e de f o r t e s v a r i a t i o n s d a n s ses c o n d i t i o n s de vie (salinitY, t e m p e r a t u r e ) sans p r 4 s e n t e r d ' a l t ~ r a t i o n s i m p o r t a n t e s de son m i l i e u i n t 4 r i e u r . C e c i est d~ /l la p r e s e n c e au n i v e a u des o r g a n e s effeet e u r s de l ' o s m o r ~ g u l a t i o n , de m ~ c a n i s m e s a p t e s h c o n t r e b a l a n c e r les effets de ces m o d i f i c a t i o n s de l ' e n v i r o n n e m e n t [64]. L ' ~ q u i p e m e n t c e l l u l a i r e de ees tissus d o l t d o n e r e e ~ l e r les p o s s i b i l i t ~ s m~tab o l i q u e s n ~ c e s s a i r e s au m a i n t i e n de l e u r efficacit~ o p t i m u m lors de tels b o u l e v e r s e m e n t s . I1 est d o n e p r o b a b l e que c e r t a i n e s des p a r t i c u l a r i t ~ s du m~tab o l i s l n e des p h o s p l m l i p i d e s , p r o p r e s h cette esp~ee et m i s e s en ~v.idence au t o u r s de c e t t e ~tude, s o i e n t en r e l a t i o n a v e c e e t t e .tr~s l a r g e l a t i t u d e de r ~ g u l a t i o n l i s s u l a i r e c a r a c t ~ r i s t i q u e de c e r t a i n s des o r g a n e s de l ' a n g u i l l e .

La composition cn phospholipides des principaux organes (branchie, rein, intestin, foic et rnuscle) de l'anguille d'cau douce a dr6 d6terrninde au moyen de la chromatographie sur touche mince. La PC, la PE et la SPH reprdsentent les constituants rnajeurs h c6t6 desquels on trouve en quantit6 rnoindre la PS, PI, DPG et AP, et en plus, dans l'intestin, de la LPC. Les proportions de PS ct SPH apparaissent plus irnportantcs dans les phospholipides extraits des organes effecteurs de l'osmordgulation tels que la branchie, le rein et l'intestin. L'dtude in vivo de la cinStique d'ineorporation du a2p dans les phospholipides, effectu6e chez l'anguille d'eau douce durant 48 henres, fait ressortir un certain hombre de points particulicrs relatifs au m6tabolisrne de ce groupe de cornpos6s dans les divers tissus analysds. Chez l'anguille d'eau douce dlevg,e ~t unc ternpdrature de 15°C, l'dchange du phosphore min6ral tissulaire est assez lent. L'activit6 spdcifique du phosphore lipidique de t o u s l e s tissus augrnente continuellernent durant les 48 heures suivant l'injection de 32p. Pendant cette p~riode expdrimentale, l'acide phosphatidique ainsi que le PI sont tr6s rapidement marqu6s dans la branchie, le rein et l'intestin, alors que l'activit6 sp6cique de la PC de ces mSrnes tissus derneurc assez faiblc. Dans ]e foie, la vitesse de forrnation de la PC apparait plus rapide que celle de la PI et de la PE. Dans la branchie ct l'intestin, la copule phosphate de la PE se renouvellc plus r i t e que celle de la PC. Chez l'anguille, poisson euryhalin, le DPG des organes effeeteurs de l'osrnor6gulation poss~de une forte radioaetivit~ sp6eifique pour chaque temps d'exp~rience. La phosphatidyl s~rine pr~sente une forte radioaetivit6 sp~eifique seulernent dans la branchie. Le marquage de la SPH n'a lieu que lentement dans les divers tissus et ne devient d6eelable qu'apr+s 24 heures.

G. Z w i n g e l s t e i n ,

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R. Meisler

Les r~sultats obtenus chez cette esp6ce sonf eomparSs avee eeux publi6s pour d'autres vert&br6s poikilot h e r m e s ou h~m6othermes. Les differences observ~es entre le r e n o u v e l l e m e n t des divers p h o s p h a t i d e s tissulaires sont diseut~s en t e n a n t eompte du seh6ma gSn6ral de la biosynth6se des p h o s p h o l i p i d e s et de leur r e l a t i o n possible avee le r61e fonetionnel de chaque tissu. BIBLIOGRAPHIE. 1. Hildtich, T. P..& ~rilliams, P. N. (1964) The chemical c o n s t i t u t i o n of natural fats, C h a p m a n and Hall, London. 2. Lovern, J. A. (1964) A. Bet). Oceanogr. Mar. Biol., :2, 169-191. 3. Hestrin-Lerner, S. & Hokin, L. E. (1964) Am. J. Physiol., 2016, 136-142. 4. Evans, D. H. (1969) J. Exp. Biol.,50, 689-704. 5. Smith, H. W. (1932) Quant. Bey. Biol., 7, 1-26. 6. Krogh, A. (1939) Osmotic regulation in aquqtic animals, Cambridge u n i v e r s i t y P r e s s , 7. Van Deenen, L. L. M. (1969) The molecular basis of membrane function, Ed. D. C. Tosteson, p. 78, Prentice Hall, New York. 8. Lennarz, W. J. (1970) Ann. Reo. Biochem., 39, 359388. 9. Zwingelstein, G., Meister, R. & Jouanneteau, J. (1973) Biochimie, 55, 1495-1497. 10. Folch, J., Lees, M. ~ Stanley Sloane, G. H. (1957) J. Biol. Chem., 226, 497-509. 11. Skioski, V. P., Peterson, R. F. & Barclay, M. (1963) J. Lipid Res., 4, 227-230. 12. Meister, R. & Zwingelstein, G. En prdparation. 13. Dittmer, J. C. ~ Lester, R. L. (1964) J. Lipid Res., 5, 126-127. 14. Bartlett, G. R. (1959) J. Biol. Chem., 2:34, 466-468. 15. Abramson, D. & Bleeher, M. (1964) J. Lipid Res., 5, 628-631. 16. Skips ki, V. P., Barclay, M. & Reiehman, E. (1967) Biochim. Bioph.tlS. Acta, 13'7, 80-89. 17. Fahmy, R. A., Niederweiser, A., Pataki, G. & Brenner, M. (1961) Helo. chim. Aeta, 44, 2022-27. 18. Vaskovsky, V. E. 3: Suppes, Z. S. (1971) J. Chromatogr., ¢)3, 455-456. I9. Skidmore, W. D. & E n t e n m a n , C. (1962) J. Lipid Res., 3, 471-475. 20. Munier, R. & Maeheboeuf, M. (1951) Bull. Soc. Chim. Biol., 33, 846-856. 21. Bate-Smith, E. C. & Westall, R. G. (1950) Biochim. Biophtcs. Aeta, 4, 427-430. 22. Martin, J. B. ,& Dory, D. M. (1949) Anal. Chem., 21, 965-972. 23. Anderson, T. R. (1970) Comp. Biochem. Physiol., 33, 663-687. 24. Thomas, A. J. ~ Patton, S. (19'72) Lipids, '7, 76-78. 25. Zwingelstein, G. (1974) Journhes d'Ecologie et d'Ichtyologie fluviale, E.D.F., Albi, Octobre 1974. 26. Shohet, S. B. (1972) N e ~ Enyl. J. Med., 286, 577583. 27. Finean, J. B. (1972) Subcell Biochem., 1. 363-373. 28. Sakagami, T., Minari, O. & Orii, T. (1965) Biochim. Biophys. Acta, 98, 111-116. 29. Bretscher, M. S. (1972) J. Mol. Biol., 7], 523-528. 30. Chapman, D. (1969) Structural and funlionnal aspects of lipoproteins in livina systems, Ed. E. Tria et A. M. Scann, Academic Press, New York, p. 36.

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