[Circulating tumor cells: a new challenge for laboratory medicine].

Synthèse Ann Biol Clin 2014 ; 72 (2) : 153-77

Les cellules tumorales circulantes : un nouveau challenge pour la biologie clinique oncologique Circulating tumor cells: a new challenge for laboratory medicine Sophie Séronie-Vivien Service de biochimie, de biologie moléculaire et de biotechnologie, Institut Claudius Regaud et Faculté des sciences pharmaceutiques, Université Paul Sabatier, Toulouse III, France

Résumé. Extrêmement rares (1 sur 106 à 107 cellules sanguines nucléées), les cellules tumorales circulantes (CTC) sont retrouvées dans les formes localisées et métastatiques de pratiquement tous les adénocarcinomes. Ce sont des cellules épithéliales dont certaines semblent avoir subi une transition épithéliomésenchymateuse au moins partielle ayant favorisé leur libération à partir de la tumeur d’origine. Leur capacité pro-macrométastatique fait encore débat d’autant qu’elles représentent des populations phénotypiquement hétérogènes, y compris chez un même sujet (présence de marqueurs de cellules souches, statut apoptotique. . .). Elles diffèrent souvent de la tumeur primitive en particulier quant aux caractéristiques modulant la sensibilité aux thérapies ciblées (expression de récepteurs hormonaux et de HER2, mutations responsables de résistances aux inhibiteurs de tyrosine-kinases). De nombreuses méthodes d’étude sont commercialisées sans être suffisamment standardisées et évaluées pour pouvoir être utilisées en clinique. Actuellement, seule la méthode CellSearch® a reçu l’agrément de la FDA dans le cadre des cancers mammaires, prostatiques et colorectaux métastatiques. C’est essentiellement elle qui a permis de mettre en évidence la valeur pronostique de la numération des CTC ainsi que sa valeur prédictive dans plusieurs localisations tumorales. D’autres travaux seront nécessaires pour déterminer si les CTC permettent de choisir de façon plus optimale le traitement, de surveiller son efficacité en temps réel et peuvent devenir un nouveau critère de jugement lors de l’évaluation de nouveaux schémas thérapeutiques. Ces études ne devront pas se limiter à leur comptage mais aussi à leur caractérisation.

doi:10.1684/abc.2014.0945

Mots clés : cellules tumorales circulantes, biomarqueur, cancer, pronostic

ˆ 2013, Article reçu le 11 aout accepte´ le 29 novembre 2013

Tirés à part : S. Séronie-Vivien

Abstract. Circulating tumor cells (CTCs) can be detected in the blood of patients with nearly all types of locally and metastatic adenocarcinomas. CTCs are epithelial cells whose release from a primitive tumor or a metastatic localization may be mediated by an epithelial-mesenchymal transition. Their pro-metastatic potential is still under debate because their phenotypes may be very heterogeneous, even within the same patient (expression of stem-cells markers, apoptotic status. . .). They often exhibit discrepancies with the primitive tumor, especially concerning the molecular basis of sensitivity/resistance to targeted therapies (expression of HER2 and hormone receptors, mutations responsible for resistance to tyrosine-kinase inhibitors). Many methods for CTCs analysis are commercially available but very few are evaluated and standardized enough for clinical applications. The CellSearch® device is the only one which is validated by the FDA for managing metastatic breast, prostate and colo-rectal cancer. It was used in most of the studies having demonstrated the prognostic and predictive value of CTCs in many tumoral localizations. Other studies are wanted to assess the ability of CTCs to optimize the therapeutic choices, to monitor drug efficiency in real-time as well as to become a surrogate end-point for evaluation of new therapies. Beyond CTCs enumeration, their biological features will need to be investigated. Key words: circulating tumor cells, biomarker, cancer, prognostic

Pour citer cet article : Séronie-Vivien S. Les cellules tumorales circulantes : un nouveau challenge pour la biologie clinique oncologique. Ann Biol Clin 2014 ; 72(2) : 153-77 doi:10.1684/abc.2014.0945

153

Synthèse La présence de cellules tumorales dans la circulation sanguine de patients atteints de cancer est attestée depuis la première observation microscopique en 1869 [1]. Fréquemment nommé « carcinocythémie », ce phénomène ne fut par la suite observé que lorsque les cellules tumorales circulantes (CTC) étaient suffisamment nombreuses pour être détectables sur un frottis sanguin. Ainsi, une vingtaine seulement de cas de carcinocythémie étaient rapportés dans la littérature en 2001 [2]. Aujourd’hui, on sait que les CTC, quasi absentes chez les sujets sains ou porteurs de pathologies non malignes, sont présentes dans le sang de patients cancéreux avec une fréquence et une quantité très variables. Elles sont toutefois toujours très minoritaires parmi les cellules nucléées du sang (1 sur 106 à 107 ). L’apparition de la RT-PCR a permis d’obtenir la sensibilité suffisante pour détecter les CTC en ciblant des ARN messagers (ARNm) spécifiques de cellules épithéliales (cytokératines : CK) ou de tissus tumoraux (PSA, tyrosinase. . .). Cependant, ces méthodes se sont révélées peu reproductibles et produisaient des faux positifs. Il a fallu attendre les années 2000 pour voir apparaître des méthodes réalisant un enrichissement en cellules tumorales préalable à leur analyse antigénique ou moléculaire. Ce sont elles qui ont permis de prouver l’intérêt clinique des CTC. Cet article propose, non pas une revue exhaustive de la littérature, mais un état des lieux des connaissances acquises récemment sur les caractéristiques biologiques des CTC et leur rôle potentiel dans le processus métastatique ainsi que des principales méthodes permettant de les détecter et de les caractériser. Nous n’aborderons volontairement ni le sujet des cellules tumorales disséminées dans les tissus (DTC), ni celui des ADN circulants. Enfin, nous ferons un point sur l’état d’avancement des travaux clinico-biologiques qui font tous espérer d’être à la veille de la validation d’un nouveau marqueur tumoral sanguin performant dans toutes les étapes de la prise en charge des cancers suivant le diagnostic.

Biologie des CTC Origine et devenir Les CTC sont des cellules non hématopoïétiques présentes dans le sang. Elles ne sont pas les seules à partager cette définition puisque des cellules endothéliales et des cellules épithéliales bénignes peuvent circuler en petit nombre. Cependant, on considère qu’en pratique, chez un sujet porteur d’une tumeur, toutes les cellules épithéliales sanguines sont des CTC même si cela ne préjuge en rien de leur potentiel métastatique. Les CTC sont retrouvées chez des patients porteurs de maladies métastatiques mais également de cancers localisés, ce 154

qui confirme que la dissémination tumorale peut être un évènement précoce dans l’oncogenèse. Le pourcentage de ces patients ainsi que le nombre de CTC/mL de sang sont variables en fonction du stade de la maladie mais aussi des localisations tumorales et des méthodes mises en œuvre (tableaux 1 et 2). Une fois libérées du site tumoral primitif ou secondaire (macrométastase ou DTC c’est-à-dire micrométastases), les CTC se déversent dans le sang et/ou la lymphe (intravasation). Certaines d’entre elles sont déjà mortes ou en cours d’apoptose ; un grand nombre meurt rapidement, détruites par le cisaillement dû au flux sanguin ou éliminées par le système immunitaire. Seule une petite proportion aura les capacités nécessaires pour ensemencer des tissus distants ou la tumeur primitive (extravasation) et peut-être s’y adapter pour donner lieu à un développement métastatique. Caractéristiques morphologiques, phénotypiques et génotypiques Morphologie Les CTC ont une morphologie épithéliale et se distinguent des leucocytes par une taille et une surface membranaire totale supérieures ainsi que par une structure chromatinienne moins condensée. Le rapport nucléo-cytoplasmique est décrit en moyenne à 0,8 [3]. En fait, leur morphologie peut varier en fonction de la pathologie, de son stade ou des traitements entrepris préalablement ou au moment de leur analyse. De plus, des microembols de CTC (≥ 3 cellules) ont été mis en évidence dans plusieurs études [2, 4-7] sans qu’il semble s’agir d’artefacts. Leur présence doit être considérée avec intérêt car les cellules les composant ne semblent pas en cycle, contrairement à une fraction des CTC isolées [5, 7], ce qui pourrait les rendre plus chimiorésistantes. Phénotype Nature histologique Les CTC sont classiquement définies comme des cellules porteuses d’antigènes (Ag) épithéliaux (EpCAM, CK). Or, leur intravasation dans la circulation nécessite des modifications de phénotype importantes allant dans le sens d’une transition épithélio-mésenchymateuse (EMT en anglais). Ce programme de différentiation, physiologique car indispensable à la morphogenèse (type I) et à la cicatrisation (type II), apparaît également fondamental dans le processus métastatique (type III : pour revue, voir [8]). Déclenché dans ce cas par des signaux moléculaires émis par le microenvironnement tumoral, en particulier le TGF-␤, il est régulé par un jeu complexe de facteurs de transcription. Il consiste, entre autres, en l’acquisition de capacités protéolytiques et de la motilité nécessaires aux cellules d’un épithélium tumoral pour se libérer des Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 2, mars-avril 2014

Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 2, mars-avril 2014

Sein métastatique

Localisation tumorale

n = 267 Avant 1◦ , 2◦ , et 3◦ ou 4◦ cycles de CT en première ligne métastatique

n = 185 Avant nouveau traitement n = 517 Avant nouveau traitement

Cell-Search® ≥ 5/7,5 mL ET AdnaTest®

Cell-Search® ≥ 5/7,5 mL

Müller, 2012 [106]

Giordano, 2012 [75]

n = 185 Avant-première ligne de traitement métastatique


Dawood, 2008 [69]


n = 177 Avant nouveau traitement et à la première visite de suivi (S3-S4)


Cristofanilli, 2004 [59]

Pierga, 2012 [76]

Nb de patients Contexte de l’étude

Méthode Marqueurs(s) ou seuil

Référence

40 % plus élevé si RE+/HER2-

CellSearch : 50 % Adna : 40 %

Baseline : 44 % Pré C2 : 18 % Pré C3-C4 : 0 ; 4 ; 0-141

38,4 %

Baseline : 49 % S3-S4 : 30 %

% de patients CTC-positifs

ND

ND

Médiane ; moyenne ; intervalle (/7,5 mL) Baseline : 3 ; 81 ; 0-3 369 Pré C2 : 0 ; 6 ; 0-202 Pré C3-C4 : 0 ; 4 ; 0-141

ND

Intervalle en baseline 2-23 168/7,5 mL

Nombre de CTC

Suivi médian : 24,6 mois Valeur pronostique de la numération baseline des CTC confirmée sur la population totale, mais pas chez les patientes HER2+

Suivi médian : ND La corrélation CTC/SG retrouvée avec la méthode CS (18,1 vs 27 mois) ne l’est pas avec la méthode Adna

Suivi médian : 14,9 mois Valeur pronostique : baseline-survie SSP : RR = 1,9 ; SG : RR = 2,4 Valeur predictive : C2, C3, C4/baseline-survie Différences significatives de SSP et de SG entre patients +/+, +/- et -/-

Suivi médian : 9,2 mois Valeur pronostique : baseline-survie SG : 15 vs 28,3 mois √ ; RR = 3,64 Survie plus longue le statut hormonal ou HER2, le site métastatique, la ligne de traitement métastatique

Suivi minimal : 9 mois Valeur pronostique : baseline-survie SSP : 2,7 vs 7 mois ; RR = 1,76 ; SG : 10,1 vs > 18 mois ; RR Se confirme à S3-S4 Valeur prédictive : évolution baseline/S3S4-survie La SSP et la SG des patients +/- (n = 33) sont identiques à celles des patients -/- (n = 81) La SSP et la SG des patients -/+ (n = 5) sont identiques à celles des patients +/+ (n = 44)

Valeur pronostique et prédictive

Tableau 1. Études princeps ayant évalué la valeur pronostique (et éventuellement prédictive) des CTC dans les cancers du sein, de la prostate et colorectaux.

Cellules tumorales circulantes : vers une nouvelle gestion biologique des cancers ?

155

156

Prostate métastatique HR

Sein localisé


n = 156 Avant d’une première ligne de CT palliative puis à S4, S8 et S12

Cell-Search® ≥ 4 CTC/7,5 mL

Scher, 2009 [81]

Helo, 2009 [110] n = 76 En cours d’HT ou de CT

n = 115 Avant et après traitement néo-adjuvant (stade II et III)


Bidard, 2013 [94]

Cell-Search® ≥ 5 CTC/7,5 mL ET qRTPCR PSA + KLK2

n = 1 500 (essai Success) (N+ et tumeur de haut grade) Avant et après CT adjuvante à base de taxanes

Cell-Search® ≥ 1/23 mL

Rack, 2008 [72]

Igniatiadis, 2007 [78]

Nb de patients Contexte de l’étude n = 444 Avant CT adjuvante

Méthode Marqueurs(s) ou seuil qRT-PCR CK-19, mammaglobuline et HER2

Référence

Tableau 1. (Suite)

CellSearch : 38 % Un ARN + : 49 %

Baseline : 54 % S4 : 37 % S8 et S12 : 31 %

Avant : 23 % Après : 17,6 %

Avant : 10 % Après : 9 %

40,8 %


Médiane : 4 CTC/7,5 mL (IQ : 1-31)

Médiane/7,5 mL (IQ) M viscérales : 1 (0-5) M viscérales et osseuses : 4 (1-39) M osseuses : 8 (1-27)

ND

Moyenne ; intervalle (CTC/23 mL) Avant : 14 ; 2-827 Après : - ; 2-124

Non applicable

Nombre de CTC

Suivi médian : 14 mois Les deux méthodes sont des facteurs pronostiques indépendants de SG en univarié ; la puissance augmente si on les associe

Suivi médian : 22 mois Corrélation entre CTC et SG Baseline : RR = 1,34 ; S4 : RR = 1,57 ; S8 : RR = 1,44 ; S12 : RR = 1,46 Valeur pronostique de la valeur baseline et de la dynamique supérieure à celle du PSA

Suivi médian : 70 mois Valeur pronostique : baseline-survie SSM : RR = 2,4 ; SG : RR = 3,0 Cette corrélation semble se perdre au bout de 3-4 années de rémission Valeur prédictive après traitement-survie Ni en SSM, ni en SG

Suivi médian : 12 mois Corrélation entre CTC et présence de métastases ganglionnaires Valeur pronostique : baseline-survie Ni en SSP, ni en SG Valeur pronostique fin de traitement-survie SG et SSP plus courte si persistance de CTC à la fin de la chimiothérapie adjuvante

Suivi médian : 53,5 mois SG et SSP plus courtes mais seulement chez les patientes RE-, HER2+ et triple négatives (pas chez les patiente RE+)


Synthèse



Cell-Search® ≥ 3 mL/ 7,5 mL Avant et pendant traitement n = 467 pour étude pronostique n = 360 pour étude prédictive

Baseline : 29 % 5 % à S3-S5

Baseline : 26 % S3-S5 12 %

ND

80 %


Médiane/7,5 mL ; IQ Baseline : 7 ; 0-132 S1-S2 : 0 ; 0-197

ND

ND

Médiane : 18 CTC/7,5 mL (IQ : 1-126)

Nombre de CTC

Suivi médian : 16,8 mois Valeur pronostique : baseline-survie SSP : 8,1 vs 10,5 mois ; RR = 1,5 ; SG : 13,7 vs 22 mois ; RR = 2,2 Valeur prédictive : baseline/S1-S2-survie + ou -/+ : SSP = 3,9 mois, SG = 6,3 mois ; +/- : SSP = 7,9 mois, SG = 14,5 mois -/- : SSP = 10,5 mois, SG = 21,9 mois

Suivi médian : 11 mois Valeur pronostique : baseline-survie SSP : 4,5 vs 7,9 mois ; RR = 1,74 ; SG : 9,4 vs 18,5 mois ; RR = 2,45 Valeur prédictive : baseline/S3-S5-survie + /- : SSP = 6,2 mois, SG = 11 mois ; +/+ : SSP = 1,6 mois, SG = 3,7 mois

Suivi médian : 43 mois Valeur pronostique : baseline-survie SSP : 7 vs 44 mois ; SG : 24 vs 45 mois La survie est d’autant plus courte que le nombre de CTC en baseline est élevé Valeur prédictive : baseline-apparition d’une HR : RR = 5,9 Suivi médian : 22 mois SSP : RR = 3,24 ; SG : RR = 2,28


relatif ; SSP : survie sans progression ; SSM : survie sans métastases ; SG : survie globale.

Tous les résultats présentés sont statistiquement significatifs. CTC : cellules tumorales circulantes ; HR : hormono-résistant ; HS : hormono-sensible ; IQ : interquartile ; ND : non disponible ; RR : risque

Tol, 2010 [83]

Avant et pendant traitement n = 430 pour étude pronostique n = 319 pour étude prédictive

Cell-Search® ≥ 3 mL/ 7,5 mL

Cohen, 2008 [82]

Colorectal métastatique

n = 3 094 Méta-analyse de 36 études

Différentes techniques

Rahbari, 2010 [84]

Colorectal localisé

n = 30 Avant déprivation androgénique


ReselFolkersma, 2012 [95]

Prostate métastatique HS

Nb de patients Contexte de l’étude


Référence


Tableau 1. (Suite)


157

158

Mélanome métastatique

Poumon à petites cellules (CPPC)

Poumon non à petites cellules (CPNPC)

Localisation tumorale n = 210 Avant chirurgie

CellSearch® ≥ 1 CTC/7,5 mL ET Iset® puis ICC CK et vimentine

Hofman, 2011 [67]

n = 97 Avant chimiothérapie et après le premier cycle

n = 331 Après métastasectomie complète de mélanomes et avant traitement adjuvant n = 101 Avant et durant le traitement

CellSearch® ≥ 50 CTC/7,5 mL ET Iset®

qRT-PCR (5 marqueurs) Positif si ≥ 1 marqueur

qRT-PCR (3 marqueurs) Positif si ≥ 2 marqueur

CellSearchS® ≥ 2 CTC/7,5 mL

Hou, 2012 [5]

Koyanagi, 2010 [86]

Hoshimoto, 2012 [87]

Khoja, 2013 [98]

n = 87 En suivi d’une biochimiothérapie

n = 101 Avant 1◦ ligne métastatique

CellSearch® ≥ 2 CTC/7,5 mL pour prévalence ≥ 5 CTC/7,5 mL pour pronostic

Krebs et al., 2011 [85]

Nombre de patients Contexte de l’étude


Référence

Intervalle : 0-36/7,5 mL

Non applicable

≈ 15 %

26 %

Non applicable

Par 7,5 mL médiane : intervalle Baseline : 24 ; 0-44 896 Post-C1 : 1 ; 0-2960

Intervalle/7,5 mL IIIA : 0 ; IIIB : 0-3 IV : 0-146

Par 7 mL Moyenne : 12 en CellSearch 34 en Iset Intervalle : 1-150 dans les 2 cas

Nombre de CTC

Baseline : 76 %

43 % en CellSearch Microembols en Iset chez 32 % des patients

21 % (total) 32 % (IV) 7 % (IIIB) 0 % (IIIA)

39 % en CellSearch 50 % en Iset + double ICC 69 % en CellSearh et/ou Iset


Suivi médian : ND Valeur pronostique : baseline-SG : 2,6 vs 7,2 mois ; RR = 2,4 Valeur prédictive : dynamique CTC durant traitement/SG Patients restants ≥ 2 CTC/7,5 mL : SG = 7 mois Patients restants < 2 CTC/7,5 mL : SG = 10 mois

Suivi médian : 21,9 mois Valeur pronostique : SSM : RR 2,13

Suivi moyen : 7,4 ± 5,9 mois Valeur pronostique : baseline-survie : SSR : 4,6 vs 8,8 mois ; RR = 2,01 SG : 5,4 vs 11,5 mois ; RR = 2,45 Valeur pronostique : présence de microembols-SG : RR 2,94 Valeur prédictive postC1/baseline-SG RR = 4,1 Suivi médian : 15,4 mois Valeur prédictive de survie globale - au moins un ARNm à C3 : RR = 2,71 - augmentation du nombre d’ARNm présent entre baseline et C3 : RR = 4,33

Suivi moyen : 5,4 ± 4,1 mois Valeur pronostique : baseline-SG 4,3 vs 8,1 mois ; RR = 7,92

Suivi médian : 15 mois Valeur pronostique : baseline-SSR CellSearch : HR = 1,564 Iset : RR = 1,372 CS + Iset : RR = 1,235 L’association des deux méthodes de détection est la plus performante


Tableau 2. Etudes princeps ayant évalué la valeur pronostique (et éventuellement prédictive) des CTC dans différents types d’adénocarcinomes hors sein, prostate et colorectal.

Synthèse



Bluemke, 2009 [111]

Poveda, 2011 [112]

Gazzaniga, 2012 [102]

Schultze, 2013 [103]

Bidard, 2013 [113]

Rein métastatique

Ovaires métastatiques

Vessie non invasive

Foie

Pancréas localement avancé

Prélèvement 1 h avant la cystectomie n = 59 Tout type et ligne de traitement

n = 79 Avant et 2 mois après le début du traitement

CellSearch® ≥ 1 CTC/7,5 mL


Avant : 5 % À 2 mois : 9 %

30,5 % La fréquence augmente avec le stade

18 %

14,4 %

53 %

n = 154 Après exérèse rénale

n = 44 Avant traitement pour une rechute


Nombre de patients Contexte de l’étude

CellSearch® ≥ 1 CTC/7,5 mL

Méthode Marqueurs(s) ou seuil Ficoll puis déplétion négative anti-CD45 par Automacs® Détection par ICC CK8 et CK18 CellSearch® ≥ 2 CTC/7,5 mL

ND

1 à 5 CTC/7,5 mL

1,5/7,5 mL (1-3)

Intervalle : 2-566/7,5 mL

Moyenne : 6/16 mL (intervalle : 1-56)

Nombre de CTC

Suivi médian : ND Valeur pronostique SG : RR = 2,5

Suivi médian : ND Valeur pronostique SG : 460 vs 746 jours Corrélation entre la présence de CTC et un taux d’AFP > 400 ng/mL

Suivi médian : ND Valeur pronostique SSP : RR = 1,89 SG : RR = 2,04 Suivi : 24 mois Valeur pronostique SSP : 6,5 vs 21,7 mois

Suivi médian : 15 mois Valeur pronostique SG : RR : 2,3


progression ; SSR : survie sans récidive ; SSM : survie sans métastases ; SG : survie globale.

Tous les résultats présentés sont statistiquement significatifs. CTC : cellules tumorales circulantes ; CS : CellSearch ; ICC : immunocytochimie ; ND : non disponible ; RR : risque relatif ; SSP : survie sans

Référence


Tableau 2. (Suite)


159

Synthèse jonctions intercellulaires et de l’interaction avec la membrane basale. Ceci se traduit par : 1) une régulation négative de protéines épithéliales en particulier des CK (cytosquelette) et de la E-cadhérine (adhésion) ; 2) une régulation positive de protéines mésenchymateuses telles la N-cadhérine (adhésion), la vimentine (filaments intermédiaires), la fibronectine (matrice extra-cellulaire) [8]. Dans les cellules tumorales, ces modifications s’accompagnent de l’apparition d’une population possédant des caractéristiques de cellules souches ainsi qu’une résistance accrue à l’apoptose [8, 9]. Par conséquent, le processus d’EMT est triplement dangereux puisqu’il permet aux cellules tumorales d’acquérir : 1) des capacités de motilité, d’invasion et de résistance ; 2) une capacité d’auto-renouvellement ; 3) une résistance aux traitements cytotoxiques. La traduction clinique de ces évènements est la corrélation entre la présence immunohistochimique de marqueurs d’EMT dans les tumeurs et un pronostic défavorable [8]. De nombreuses études ont montré qu’une fraction des CTC exprime des marqueurs d’EMT [10-15]. Dans ces conditions, on peut s’étonner que la valeur pronostique de la détection de CTC ait été validée si largement (tableaux 1 et 2) avec des méthodes ayant utilisé uniquement des marqueurs épithéliaux (Ag ou ARNm) pour la captation/et ou la détection de ces cellules. En fait, il a été démontré dans des cancers du sein et de prostate hormono-résistants que plus des trois-quarts des CTC expriment à la fois des marqueurs épithéliaux et mésenchymateux [12]. Il a également été proposé que les CTC capables d’avoir quitté la tumeur puissent entraîner à leur suite des cellules n’ayant pas subi l’EMT et présentant donc des caractéristiques purement épithéliales [16]. Caractéristiques de cellules souches La compréhension des mécanismes de l’oncogenèse durant les dix dernières années a mis en évidence le rôle d’une sous-population de cellules cancéreuses, minoritaire au sein de la tumeur et présentant des caractéristiques fonctionnelles (auto-renouvellement, différenciation en tous les types cellulaires constituant la tumeur) et antigéniques de cellules souches. Ces cellules souches cancéreuses (CSC) sont à l’origine de l’initiation tumorale ainsi que du développement de macrométastases, même si elles nécessitent pour cela d’établir des interrelations complexes avec le microenvironnement (pour une revue sur l’oncogenèse, voir [17]). En faisant le lien entre la capacité tumorigène des CSC et la valeur pronostique des CTC, il était logique de se poser la question suivante : les CTC sont-elles des CSC ? La réponse est venue d’études effectuées en oncologie mammaire. En 2009, une équipe allemande [10] a été la première à démontrer l’expression dans des CTC issues de cancers du sein métastatiques, non seulement de transcrits spéci160

fiques d’un processus d’EMT (Akt2, PI3a, TWIST), mais d’un marqueur précédemment décrit comme étant exprimé dans les cellules souches mammaires normales et tumorales, l’aldéhyde-déshydrogénase-1 (ALDH-1) [18]. Sur 226 échantillons provenant de 39 patientes, 62 % de ceux contenant des CTC étaient positifs pour au moins un marqueur d’EMT et 69 % pour ALDH-1. Une autre étude, effectuée chez 30 patientes atteintes de cancer du sein métastatique, a montré que dans 35 % des cas, les CTC exprimaient un phénotype tumorigène spécifique de cellules souches CD44+ /CD24-/faible ; le pourcentage médian par patient de ce phénotype au sein de la population totale de CTC était de 47,8 % (intervalle : 8,3 à 100 %) [19]. Enfin, chez 197 patients porteurs d’un cancer colorectal (CCR) de stade B ou C de Dukes, 29 % des 124 patients porteurs de CTC exprimaient un autre marqueur de cellules-souches, le CD133 [20]. Anomalies moléculaires De nombreuses altérations chromosomiques et géniques ont pu être mises en évidence dans les CTC. Une amplification du gène du récepteur aux androgènes, une délétion du gène suppresseur de tumeur PTEN, une aneuploïdie des chromosomes 1, 7, 8 et 17 [21, 22] ainsi que la présence du transcrit de fusion oncogénique TPMRSS2-ERG [6] ont été détectées dans les CTC issues de cancers de la prostate hormono-résistants. L’amplification du gène HER2 a été retrouvée dans les CTC de femmes porteuses d’un cancer du sein métastatique [23]. Différentes mutations activatrices du récepteur à l’EGF (EGFR) ainsi que la mutation T790M conférant une résistance aux inhibiteurs de l’EGFR de type inhibiteurs de tyrosine kinase ont été retrouvées dans les CTC de cancers du poumon non à petites cellules (CPNPC) métastatiques [24]. Enfin, des mutations activatrices de BRAF et KRAS sont retrouvées dans les CTC de mélanome [25]. Disparités entre les CTC et la tumeur primitive Des disparités génétiques (mutations, pertes d’hétérozygotie, profils transcriptionnels) entre tumeur primitive, métastases ou DTC ont été décrites dans de nombreux types de tumeurs. Par contre, les comparaisons génotypiques, transcriptionnelles et phénotypiques entre CTC et tumeur primitive sont rares. La plupart ont concerné l’expression des récepteurs hormonaux et de l’oncoprotéine HER2 dans les cancers du sein [4, 26-30]. À l’exception de la plus récente [30], toutes ont observé une tendance à la « perte » du récepteur aux œstrogènes (RE) et du récepteur à la progestérone (RP) et au « gain » de HER2 dans les CTC par rapport à la tumeur primitive (tableau 3). De plus, la fréquence d’une triple négativité (RE, RP et HER2-négatives), facteur bien connu d’agressivité, était plus importante dans les CTC que dans les tumeurs primitives. Ceci laisse à penser que les CTC émanent Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 2, mars-avril 2014


Tableau 3. Discordances d’expression des récepteurs hormonaux et de HER2 entre les tumeurs primitives de sein et les CTC. Référence

Stade de la maladie

Nombre de patientes CTC-positives

Méthode

Evolution du statut RE␣/RP/HER2

% tumeur HER2+ /taux de détection de CTC HER2+ (%)

% tumeurs TN /taux de détection de CTC TN (%)

Fehm, 2009 [26]

Localisé

58

AdnaTest®

Concordance tumeur/CTC RE␣ : 29 % RP : 25 % HER2 : 53 %

16/38

15/50

Aktas, 2011 [28]

Métastatique

87

AdnaTest®

Concordance tumeur/CTC RE␣ : 41 % ; RP : 45 % Perte RE␣ : 77 % Perte RP : 87 %

ND/48

17/45

Fehm, 2010 [27]

Métastatique

CellSearch® : 127 AdnaTest® : 99

AdnaTest® CellSearch®

34/41 34/47

ND

Pestrin, 2009 [101]

Métastatique

40

CellSearch®

Gain de HER2 par les CTC : 32 % Gain de HER2 par les CTC : 49 % Gain de HER2 par les CTC : 29 % Perte de HER2 par les CTC : 42 %

30/37

ND

Bock, 2012 [4]

Métastatique

10

Isolement des CTC par gradient de concentration Triple IF microscopique (CK, RE␣, HER2)

Étude sur 92 CTC 36/33 Perte de RE␣ : 63 % Gain de HER2 : 52,2 % Discordance tumeur/CTC : 69,6 %

11/17

Ligthart, 2013 [30]

Localisé

88

CellSearch® avec fluorescence HER2 des CTC normalisée par rapport à celle des leucocytes

Pas de discordance tumeur/CTC pour l’expression de HER2

ND

ND

Ligthart, 2013 [30]

Métastatique

103

CellSearch® avec fluorescence HER2 des CTC normalisée par rapport à celle des leucocytes

Gain de HER2 par les CTC : 9 % Perte de HER2 par les CTC : 29 %

ND

ND

CK : cytokératines ; CTC : cellules tumorales circulantes ; IF : immunofluorescence ; ND : non disponible ; RE : récepteur aux œstrogènes ; RP : récepteur à la progestérone ; TN : triple-négatif = RE, RP et HER2-négatif.

d’une sous-population HER2-négative, minoritaire au sein de la tumeur mais suffisante pour induire une résistance au trastuzumab administré sur la foi de la positivité HER2 globale de la tumeur primitive. L’existence de discordances entre tumeur primitive et CTC semble être confirmée par la clinique. Les études ayant corrélé l’évolution du nombre de CTC (ou de DTC dans la moelle osseuse) à la réponse histologique lors d’un traitement néo-adjuvant mammaire ont toutes montré que les CTC ne sont pas complètement éradiquées malgré une réponse pathologique complète [31, 32]. Ceci indique que la chimiosensibilité des CTC/DTC est différente de celle Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 2, mars-avril 2014

des cellules de la tumeur primitive. Par conséquent, poser l’indication d’un traitement, en particulier d’une thérapie ciblée, sur les caractéristiques phénotypiques de la tumeur primitive n’est vraisemblablement pas optimal. Hétérogénéité inter- et intra-patient des populations de CTC S’il est actuellement démontré que le nombre de CTC au-delà d’un certain seuil est corrélé à un pronostic défavorable dans plusieurs pathologies (tableaux 1 et 2), il n’en reste pas moins que certains patients sans CTC détectables rechutent alors que d’autres restent en rémission ou 161

Synthèse voient leur maladie stabilisée malgré la présence de CTC. Ce type d’observations peut s’expliquer par un défaut de détection des CTC dans le premier cas. Cependant, ces hétérogénéités inter-patients sont sans doute surtout le fait de caractéristiques fonctionnelles et donc d’une agressivité différentes des CTC. Ces différences s’expriment en particulier par le pourcentage très variable de patients dont les CTC expriment des marqueurs EMT et/ou de cellules souches [18, 19], les récepteurs hormonaux et HER2 [4, 32], ou qui présentent une amplification (HER2, EGFR) ou des mutations (KRAS, BRAF) d’oncogènes [33, 34]. Une hétérogénéité des CTC en termes de morphologie [4] et de statut apoptique et réplicatif [5, 7, 35] a également été mis en évidence. Ce type de disparités se retrouve à l’état basal au sein de la population de CTC d’un même patient. D’autres apparaissent en cours de traitement comme dans le cas des CPNPC où la proportion de CTC porteuses de la mutation T790M assurant une résistance aux inhibiteurs de tyrosine kinases augmente tout au long du traitement [24]. Deux remarquables études d’analyse individuelle des transcriptomes de CTC d’origine prostatique [36] ou mammaire [37] ont mis en évidence leur hétérogénéité chez un même patient. Nous nous attarderons sur les principales observations de Powell et al. [37] : – les CTC se répartissent entre deux clusters aux profils d’expression très différents. Aucune cellule mammaire de lignée ne se retrouve dans l’un ou l’autre de ces clusters et toutes les cellules provenant d’une même lignée ont un profil d’expression similaire. Les CTC sont donc à la fois très différentes et beaucoup plus hétérogènes que des cellules de lignées, ce qui pose la question de la pertinence de l’utilisation de ces modèles cellulaires en particulier pour tester la réponse à des traitements in vitro ; – les CTC provenant d’une même patiente ne se regroupent dans le même cluster que dans 77 % des cas, ce qui traduit une grande hétérogénéité intra-patient. Pratiquement toutes les CTC, quel que soit le cluster, sont des cellules n’exprimant ni le RE, ni le RP, ni HER2, et ce quel que soit le statut de la tumeur primitive pour ces trois marqueurs ; – les gènes associés à la prolifération (facteurs de croissance et leurs récepteurs, protéine de transduction du signal) sont peu ou pas exprimés. Cette observation est intéressante à mettre en perspective avec les études contradictoires sur l’état prolifératif des CTC effectuées grâce à l’étude du marqueur de prolifération KI67 [5, 7, 38]. L’hétérogénéité transcriptionnelle et phénotypique des CTC chez un même patient suggère l’intérêt théorique d’associer plusieurs types de thérapeutiques ciblées afin d’obtenir un contrôle optimal des cellules susceptibles de donner naissance à un site secondaire. Cependant, de telles associations devraient prouver un bénéfice médicoéconomique fort avant de pouvoir être envisagées. 162

Signification biologique de la présence de CTC dans le sang La présence de cellules tumorales dans le sang soulève bien sûr la question suivante : les CTC sont-elles aptes à créer de nouveaux sites macrométastatiques ? Pour répondre à cette question, il faudrait d’abord connaître les propriétés conférant cette aptitude. Or, malgré les progrès effectués dans les dix dernières années, le problème reste incomplètement résolu [17]. Cependant, certains éléments semblent acquis. Aptitude à l’intravasation Les cellules tumorales doivent être capables de quitter leur site d’origine pour une intravasation dans le sang ou la circulation lymphatique. Ceci passe par un processus d’EMT dont nous avons vu qu’une fraction des CTC le subit, complètement ou partiellement [10-15]. Statut apoptotique Les CTC doivent survivre dans la circulation sanguine. Or, une proportion importante de CTC est apoptotique sans que cette observation puisse être imputée à des artefacts techniques [36]. Dans une étude [39] menée sur 122 patients porteurs d’un carcinome mammaire (n = 34), d’un cancer colorectal (n = 59) ou d’un cancer du rein métastatique (n = 29), des CTC exprimant le néo-épitope M30 (marqueur précoce de l’apoptose non exprimé par les cellules viables) ont été mises en évidence chez 80 à 90 % des patients porteurs de CTC, quelle que soit la localisation. Dans une autre étude incluant 56 patientes porteuses de CTC (sein localisé (n = 29) ou métastatiques (n = 27)), M30 était exprimé dans 55 % des cas, ce pourcentage étant significativement plus élevé pour les tumeurs localisées (76,6 vs 32,1 %). Enfin, sur 77 patients porteurs d’un cancer du poumon à petites cellules (CPCC) et de CTC, 57 % présentaient des cellules en apoptose (morphologie, expression de M30 et de bcl-2) [5]. La signification de cette haute fréquence de CTC apoptotiques n’est pas absolument claire. En effet, on pourrait penser que les cellules en apoptose sont incapables de donner naissance à un site métastatique. Or plusieurs études, sur le sein [39], la prostate [40] et les CPCC [5] ont associé la présence de CTC apoptotiques à un pronostic péjoratif en terme de survie. Ces observations contrintuitives pourraient s’expliquer par le fait que : 1) les tumeurs les plus agressives sont aussi celles qui présentent le plus souvent des zones de nécrose et peuvent donc relarguer des cellules en apoptose ; 2) les plus hauts niveaux de prolifération s’accompagnent des plus hauts niveaux de mort cellulaire par apoptose, la balance étant favorable à la prolifération. Aptitude à l’extravasation Les CTC doivent être capables de s’implanter dans un nouveau tissu. Ceci nécessite une plasticité épithéliale Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 2, mars-avril 2014


c’est-à-dire la capacité de subir le processus inverse de l’EMT (MET : transition mésenchymato-épithéliale) afin de reformer un épithélium tumoral capable de coopérer avec son micro-environnement. Actuellement, aucune certitude n’existe concernant cette aptitude à la plasticité des CTC. Aptitude à l’auto-renouvellement et à la prolifération L’acquisition de marqueurs de cellules-souches et donc d’auto-renouvellement par certaines CTC est, nous l’avons vu, bien établie et vraisemblablement liée au processus d’EMT, comme dans le cas des cellules souches normales et des CSC intra-tumorales [8]. Par contre, la capacité réplicative des CTC fait encore débat. Certes, en 2005, Müller et al. ont décrit l’absence d’expression de KI67 (marqueur non exprimé en phase G0 et G1 du cycle cellulaire) dans 22 CTC issues de 9 patientes atteintes de cancer du sein [41] mais depuis, des études plus robustes ont contredit ce résultat. Chez 56 patientes porteuses de CTC issues d’un cancer du sein, 55 % exprimaient KI67 au sein de ces cellules. Dans des CTC de patients atteints de CPNPC de stade IIIA à IV [7] ou de CPPC [5], l’expression de KI67 a également été mise en évidence, dans des proportions variables selon les sujets. Par contre, KI67 n’était exprimé dans aucune des cellules constituant les microembols tumoraux observés, suggérant que les CTC ainsi regroupées puissent être plus résistantes aux traitements cytotoxiques que les CTC isolées. L’étude des transcriptomes individuels a produit des résultats paradoxaux avec une faible expression des gènes associés à la prolifération dans des CTC de sein [37], alors que dans des CTC de prostate, un tiers des transcrits surexprimés étaient associés aux processus métaboliques et 10 % au cycle cellulaire, ce qui évoque un état mitotique actif [36]. Aptitude à la néoangiogenèse La capacité de développer une néoangiogenèse est indispensable à des cellules pro-métastatiques afin d’assurer l’alimentation et l’oxygénation de la tumeur en cours de constitution et d’évacuer les déchets métaboliques et le dioxyde de carbone. Cette aptitude n’a jusqu’à présent été évaluée que par des études indirectes dans les CTC. L’expression du VEGF et de son ARNm a été montrée comme faible dans une lignée cellulaire établie à partir des CTC d’un mélanome métastatique [42]. Une autre étude a corrélé la présence de CTC à des concentrations circulantes faibles d’EGF et de FGF-␤, deux autres facteurs pro-angiogéniques [43]. À l’inverse, une étude chez 34 patientes porteuses d’un cancer du sein métastatique et de CTC semble être en faveur de la capacité de ces cellules à induire de façon autocrine un signal angiogénique. En effet, l’expression de quatre protéines pro-angiogéniques Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 2, mars-avril 2014

est retrouvée dans 81 % (pFAK), 73 % (VEGF), 71 % (VEGF2) et 56 % (HIF1-␣) de l’ensemble des CTC des 34 patientes [44]. Ces résultats contradictoires nécessitent donc des études complémentaires. Dans l’état actuel des connaissances, l’hypothèse d’une capacité des CTC à induire des macrométastases ne peut donc pas être rejetée. Ce rejet est d’autant moins possible que les données cliniques semblent étayer cette hypothèse. Cependant, diverses observations posent question : – un pourcentage important de patients métastatiques, allant de 10 à 50 % en fonction des techniques, ne sont (apparemment) pas porteurs de CTC. Cette absence peut être due à l’utilisation d’un marqueur de sélection non approprié car non exprimé par les CTC comme cela sera discuté plus loin. En effet, les marqueurs d’EMT, actuellement très peu utilisés pour la détection des CTC, sont beaucoup plus fréquents chez les patients métastatiques que chez les patients dont la maladie est localisée [15]. D’autre part, l’intravasation des CTC n’est peut-être pas un phénomène constant, ni dans le temps, ni dans l’espace. Il est possible qu’un seul prélèvement, qui plus est en un site unique, ne suffise pas à les détecter dans tous les cas ; – chez 36 patientes en rémission complète de longue durée (7 à 22 ans) d’un cancer du sein localisé, 13 ont été montrées porteuses de CTC alors que dans une population contrôle de 26 femmes d’âge apparié, aucune cellule comparable n’a pu être mise en évidence [3]. De plus, cette étude a évalué la demi-vie des CTC entre 1 et 2,4 h, ce qui implique l’existence d’une source de réplication (micrométastases), compensée par une mort cellulaire de la même ampleur puisqu’aucune de ces femmes ne présente le moindre signe de rechute. Nous touchons là à l’hypothèse que les CTC pourraient n’être dans certains cas que le reflet de l’existence de micrométastases dormantes. Face à l’ensemble de ces observations et étant donné l’extrême hétérogénéité phénotypique des CTC, il est fort probable que seule une fraction d’entre elles possède un potentiel métastatique. Ceci semble confirmé par deux études récentes de xénogreffes de CTC humaines chez la souris dont l’une a été un échec [45] et l’autre une réussite [46]. Le défi va maintenant résider en la validation de marqueurs biologiques permettant de différencier les populations de CTC en fonction de leur agressivité potentielle

Méthodes de détection et d’étude Nous ne parlerons ici que des méthodes commercialisées les plus récentes, c’est-à-dire celles décrites à partir des années 2000. De plus, nous nous focaliserons sur celles qui ont permis la réalisation d’études cliniques ayant participé à la mise en évidence de l’intérêt théorique et clinique de l’étude des CTC (tableau 4). La liste des méthodes disponibles en 163

164

Immunomagnétique Sélection positive anti-EpCAM

MagSweeper® version 2

Mise en micro-culture de CTC unique pendant 24 à 48 h une sur membrane fonctionnalisée par un anticorps dirigé contre la molécule d’intérêt sein : CK19 et MUC1 prostate : PSA

Sélection par la taille et la morphologie cellulaire

Identification individuelle par immunofluorimétrie microscopique CTC = EpCAM +, CD45 -, pas de marquage par le Dapi

CTC = cellules EpCAM+

CTC+ si un des trois transcrits (EpCAM, MUC-1 et HER2) est exprimé (> 0,15 à 0,45 ng/␮L en fonction des systèmes de lecture)

Identification individuelle par immunofluorimétrie cytométrique CTC = CD45- (sélection négative) CK8+, CK18+, CK19+, DAPI +

Critères d’identification

CTC : cellules tumorales circulantes ; ICC : immunocytochimie.

N’importe quel système d’enrichissement peut être utilisé

Système microfluidique de micropuits fonctionnalisés par un anti-EpCAM

CTC-chip®

Epispot®

Immunomagnétique Sélection positive anti-EpCAM et anti-MUC-1 Pas de sélection négative

AdnaTest®

Système de filtration sous pression

Immunomagnétique Sélection positive anti-EpCAM

CellSearch®

Iset®

Sélection/ enrichissement

Nom

Mise en évidence de la présence des cellules vivantes exclusivement

Permet tout type d’analyse, antigénique (ICC) ou moléculaire (RT-PCR) Sensible : 1 CTC/mL de sang

Conserve les cellules viables et n’altère pas l’expression génique des CTC Permet l’analyse morphologique Permet d’isoler les cellules individuellement pour analyse subséquente

Méthode d’isolement la plus efficace (50 CTC/mL) Méthode simple, en un temps Méthode douce : les CTC isolées sont viables

Permet une caractérisation large en ciblant de nombreux transcrits (RE, RP, marqueurs d’EMT, de cellules souches. . .) après identification des ARN totaux comme issus de CTC RT-PCR multiplex

Seule méthode approuvée par le FDA pour application clinique sein, prostate, colorectal ; nombreuses études en cours pour obtenir l’agrément dans d’autres localisations Semi-automatisée et standardisée Pré-analytique standardisé Contrôle de qualité interne disponible Permet en suivant une analyse antigénique ou moléculaire (Fish, qRT-PCR, recherche de mutations) Permet la numération des CTC et leur étude morphologique Largement utilisée et validée

Principaux avantages

Tableau 4. Principales méthodes d’analyse des CTC utilisées dans les travaux cités dans cet article.

Ne permet pas d’isoler les cellules Difficulté technique Ne peut s’appliquer qu’à l’analyse des protéines activement sécrétées

Longue à mettre en œuvre Observateur-dépendante

Plus adapté à une application de recherche fondamentale qu’à des applications cliniques

Spécificité remise en doute Production à grande échelle difficilement envisageable d’où une seconde génération : Herringborne-chip

Analyse globale des transcrits de la population de CTC RT-PCR non quantitative (risque de moindre spécificité) Pas de numération ou d’étude morphologique des CTC possibles Applications pour l’instant seulement pour le cancer du sein

Comme toutes les méthodes dont la sélection est basée sur de seuls marqueurs épithéliaux, risque de laisser échapper certaines fractions de CTC Système fermé Coût très élevé Possibilité de caractérisation protéique des CTC limitée à l’étude d’un antigène grâce au quatrième canal optique

Principales limites

[109]

[5, 7, 67]

[36]

[24, 55, 107, 108]

[27, 28, 106]

[59, 67, 82, 102-105]

Applications

Synthèse



2012 a été publiée par la Foundation of the national institute biomarkers consortium [47] et plusieurs articles de revues sont disponibles [48-51]. Principes généraux L’analyse des CTC (figure 1) nécessite de détecter une cellule parmi une à dix milliards, évènement qui suit la loi statistique de distribution de Poisson. Ceci signifie que la

limite de détection ne peut être améliorée ni en augmentant le nombre de marqueurs d’identification, ni en améliorant la technique, mais seulement en augmentant le volume de sang analysé. C’est la raison pour laquelle pratiquement toutes les méthodes d’analyse des CTC passent actuellement par une étape de sélection/enrichissement préalable. Suite à l’enrichissement, de nombreux outils sensibles et robustes sont disponibles pour les identifier et les caractériser :

SEPARATION/ENRICHISSEMENT Méthodes physiques

Filtration

Séparation immunologique

Gradient de concentration

Puces

Systèmes immunomagnétiques

Plasma Ficoll

PBMC + CTC Fe

Sélection positive (EpCAM ++)

Études antigéniques Immunofluorescence ♦♣ Immunocytochimie ♦♣ Immunodosages

Fe

Sélection négative (CD45)

Études moléculaires qRT-PCR multiplex Fish ♦ Séquençage Profils d’expression globaux ou individuels ♣

Figure 1. Principes schématisés des méthodes d’étude des cellules tumorales circulantes. : permettent la numération et l’analyse morphologique ; ♣ : permettent une analyse cellulaire individuelle.


165

Synthèse – des méthodes basées sur les caractéristiques antigéniques des CTC : immunofluorimétrie cytométrique ou microscopique, immunocytochimie (ICT), immuno-dosages ; – des méthodes basées sur les caractéristiques moléculaires des CTC : FISH, RT-PCR, RT-PCR quantitative (qRTPCR), analyse par puce du transcriptome, séquençage. À l’inverse des méthodes antigéniques et de la Fish, les méthodes étudiant l’expression des transcrits ou la séquence génomique ne permettent ni de visualiser la morphologie des CTC, ni d’évaluer leur vitalité, ni bien sûr de les compter. Il faut également distinguer les méthodes qui permettent une analyse individuelle des CTC de celles qui n’apportent que des informations globales sur la population présente dans l’échantillon sanguin. Sélection/enrichissement des échantillons Basé sur les propriétés physiques propres aux CTC Ces méthodes présentent une faible spécificité pour la sélection des CTC au sein des autres cellules mononucléées du sang. Seuls les gradients de concentration (pour les analyses moléculaires surtout) ou une filtration sont couramment réalisés. Dans ce dernier cas, on met à profit la taille supérieure des CTC par rapport aux leucocytes. Pourtant, les méthodes physiques présentent l’avantage de ne pas marquer les CTC, de les laisser le plus souvent viables voire cultivables in vitro et de ne pas assujettir leur sélection à l’expression d’un marqueur antigénique qui peut ne pas être partagée par l’ensemble des CTC. C’est pourquoi des systèmes innovants pourraient insuffler un regain d’intérêt pour ces méthodes, comme la microfiltration sur puce associant à la différence de taille la déformabilité moins importante des CTC [52], ou des systèmes d’enrichissement par di-électrophorèse mettant à profit les différences de charge électrique liées à la différence de taille et de surface/structure membranaire entre CTC et leucocytes [53]. Basé sur les propriétés biologiques propres aux CTC La majorité de ces méthodes consistent en un enrichissement immunomagnétique. Le sang est mis en présence de billes ferreuses recouvertes d’un anticorps de capture et par la suite isolées grâce au passage dans un champ magnétique. Basée sur le principe de la nature épithéliale des CTC, la sélection positive utilise un anticorps, parfois deux, dirigé(s) contre des antigènes épithéliaux. La molécule d’adhésion cellulaire épithéliale EpCAM est la cible la plus fréquente. Une sélection négative permettant d’exclure les leucocytes des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) peut également être assu166

rée grâce à des billes magnétiques fonctionnalisées par l’anticorps panleucocytaire anti-CD45. Les méthodes les plus spécifiques combinent sélection immunologique positive et négative, parfois associées à un marquage par le DAPI (4’,6’-diamidino-2-phénylindole) afin de sélectionner grâce à la morphologie nucléaire les cellules non apoptotiques. Récemment, des systèmes microfluidiques incluant des colonnes de billes magnétiques ou des microsurfaces porteuses d’un anticorps de sélection ont été développés comme système de capture (pour revue, voir [54]). Outre leur grande sensibilité, ces systèmes permettent la caractérisation subséquente des CTC qu’ils isolent intactes du sang total, sans filtration et sans marquage par un anticorps. Par contre, aucun d’entre eux n’a encore été utilisé dans de larges études cliniques. Identification et caractérisation antigéniques des CTC Après la phase d’isolement/enrichissement, quel que soit son principe, une étape d’immuno-marquage peut permettre l’identification des CTC en tant que telles. Là encore, les anticorps les plus utilisés sont dirigés contre des antigènes épithéliaux, en particulier les cytokératines fréquemment exprimées par les carcinomes humains (CK8, CK18, CK19). Le marquage, le plus souvent fluorescent, est évalué en cytométrie de flux laser ou par lecture microscopique, laquelle peut être automatisée et assurer un haut débit (dispositifs Ariol® , Ikoniscope® ). Un des intérêts de ces méthodes est de permettre la numération des CTC et d’appréhender leur morphologie ainsi que l’intensité du marquage. Leur modèle-type est le dispositif CellSearch® , semi-automatisé, mais pour lequel l’interprétation des images reste dépendante de l’observateur. On peut aussi détecter la présence de CTC en mettant en évidence la sécrétion de protéines spécifiques du tissu tumoral étudié : après un isolement/enrichissement effectué selon n’importe quelle modalité, chaque CTC isolée est cultivée pendant 24 à 48 h sur une membrane fonctionnalisée par un anticorps dirigé contre la ou les protéine(s) d’intérêt. Les complexes antigène-anticorps primaires sont alors détectés par des anticorps secondaires conjugués à un fluorochrome (méthode Epispot® ). Cette méthode, si elle permet de détecter la présence de CTC, ne permet cependant pas de les isoler. Il est également possible, une fois les CTC isolées, d’associer leur identification à une caractérisation basée sur la recherche de l’expression de protéines ; la principale application actuellement est l’étude de l’expression de HER2 [27, 32] ainsi que des récepteurs hormonaux [4] dans les CTC d’origine mammaire. Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 2, mars-avril 2014


Identification et caractérisation moléculaires des CTC Les méthodes moléculaires consistent essentiellement dans l’analyse des transcrits même si la Fish, le caryotypage ou le séquençage ont permis d’identifier les altérations du génome décrites plus haut. Analyse globale des transcrits Il s’agit de quantifier l’expression d’un ou plusieurs transcrits à partir de l’ARN total extrait d’une population de CTC préalablement isolée par un dispositif physique ou immunologique. À côté de nombreuses qRT-PCR développées par les laboratoires de recherche, la méthode commerciale la plus utilisée est la méthode AdnaTest® . Après une immunocapture magnétique grâce à un anti-EpCAM et un anti-MUC-1, elle réalise une RT-PCR (non quantitative) multiplex pour les transcrits HER2, MUC-1 et EpCAM : les échantillons positifs sont ceux pour lesquels un des trois transcrits est exprimé. Comme toutes les méthodes de RT-PCR, la méthode AdnaTest® a l’avantage majeur de pouvoir élargir sans limite théorique la caractérisation transcriptionnelle de la population de CTC une fois que les ARN totaux en ont été extraits. Cependant, l’enrichissement basé sur un anticorps anti-MUC1 en association avec l’antiEpCAM la limite aujourd’hui à l’analyse des CTC d’origine mammaire. Analyse « single-cell » des transcrits L’analyse du transcriptome de cellules isolées est une prouesse que la technologie ne nous offre que depuis peu. Deux travaux de ce type, déjà évoqués plus haut, ont été effectués sur des CTC mammaires [37] et prostatiques [36]. Dans les deux cas, le système MagSweeper® a permis l’isolement individuel de CTC viables, dont le degré d’intégrité des ARNm était acceptable, sans qu’aucune altération significative du profil transcriptionnel ait pu être mis en évidence sur des cellules de lignées avant et après leur passage dans le MagSweeper® . Dans l’étude de Cann et al., la spécificité de ce système a été améliorée par une sélection plus drastique des CTC associant à l’immunocapture antiEpCAM une sélection négative (CD45, DAPI). Suite à cet enrichissement, l’analyse transcriptionnelle individuelle a été effectuée sur puce [37] ou par séquençage du transcriptome [36]. Les avantages des méthodes individuelles par rapport aux méthodes globales sont de deux types : – elles permettent de visualiser et de compter les CTC avant extraction de leurs ARN ; – elles permettent de mettre en évidence l’hétérogénéité transcriptionnelle des CTC, y compris chez un même patient. Elles peuvent donc révéler l’existence d’une ou plusieurs sous-populations aux caractéristiques différentes en Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 2, mars-avril 2014

termes d’agressivité et dont la présence aurait probablement été diluée dans l’analyse des ARNm de la population de CTC. Limites d’utilisation Problématiques pré-analytiques Actuellement, le problème majeur est sans doute que les sites d’analyse potentiels, peu nombreux, ne sont pas les mêmes que les sites de prélèvement. Cela pose la question de la stabilité des échantillons et de leur conservation. Les méthodes CellSearch® et AdnaTest® proposent un protocole de prélèvement standardisé grâce à des tubes spécifiques permettant une conservation pendant 96 et 48 h respectivement, à température ambiante, avec transport possible des échantillons. Les autres méthodes publiées fixent sur des bases empiriques le délai entre prélèvement et analyse (et/ou extraction des acides nucléiques) à moins de 48 h et la conservation des échantillons sanguins prélevés sur EDTA à température ambiante. Le volume de sang à prélever, de par la limite que représente la loi de Poisson, doit théoriquement être relativement important. Il oscille en général entre 7,5 et 20 mL. Les méthodes microfluidiques (puces) pourraient théoriquement fonctionner avec des volumes < 1 mL mais cela n’a pour le moment pas été le cas dans les études publiées [55, 56]. Enfin, l’intravasation de CTC n’est peut-être pas, on l’a déjà dit, un phénomène continu et leur demi-vie dans la circulation est courte (1 à 2,4 h [3]). Ceci pose la question du moment du prélèvement et de la nécessité de le renouveler pour augmenter la probabilité d’en détecter. De même, en fonction de la localisation de la tumeur primitive, le choix du site de prélèvement n’est peut-être pas neutre. Problématiques biologiques Interférence des cellules hématopoïétiques, des cellules endothéliales et des cellules épithéliales non malignes L’interférence des leucocytes ne pose guère de problèmes lorsque les marqueurs utilisés sont des Ag/ARNm épithéliaux ou spécifiques de tumeur. Par contre, les cellules hématopoïétiques peuvent induire des faux positifs lorsqu’on recherche les CTC via la présence de marqueurs d’EMT (vimentine) ou de cellules souches (ALDH-1). Il est possible de s’affranchir de ces interférences en excluant les échantillons exprimant le CD45 et/ou le CD34. Des cellules endothéliales circulent chez les sujets sains mais surtout, et en plus grand nombre, chez les patients cancéreux (en raison vraisemblablement d’une néoangiogenèse tumorale). Porteuses de marqueurs mésenchymateux, elles peuvent être à l’origine de faux-positifs si des marqueurs d’EMT sont utilisés. Une sélection négative par 167

Synthèse des marqueurs de la lignée endothéliale (CD105, CD146) permet de les éviter. Dans les maladies inflammatoires bénignes de l’intestin, des CTC sont retrouvées alors qu’il n’y en a pas chez des volontaires sains [57]. Leur faible nombre et le contexte clinique doivent permettre toute mauvaise interprétation.

sité d’immunosélection, les plus onéreuses les systèmes semi-automatisés et surtout les méthodes fermées telle la méthode CellSearch® . Celle-ci nécessite de débourser environ 460 D par échantillon contre moins de 20 D pour une qRT-PCR multiplex [61].

Mise en défaut de la sélection positive basée sur EpCAM L’efficacité des immunocaptures anti-EpCAM diminue avec le niveau d’expression de cet antigène cible [56, 58]. Ceci explique que, si une proportion des CTC a subi un processus d’EMT avec perte totale ou partielle des antigènes épithéliaux, l’efficacité de ces immunocaptures est moindre qu’avec les méthodes physiques. Par exemple, dans une étude portant sur les CPNPC, la méthode de filtration ISET® suivie d’une triple immunocytochimie (CK, ECAM, EGFR) a détecté des CTC chez 80 % des patients contre 23 % pour la méthode CellSearch® ; d’autre part, elle a permis de mettre en évidence un contingent de CTC n’exprimant aucun des trois Ag épithéliaux [7]. Cette insuffisance de sélection positive devrait logiquement constituer une limite importante à la valeur pronostique des CTC puisque celles qui ne sont pas détectées semblent avoir le phénotype le plus agressif. En effet, dans l’étude d’Aktas et al. [10], les ARNm d’EMT ou de cellulessouches n’étaient exprimés que chez 10 % des répondeuses au traitement alors qu’ils l’étaient chez 74 % des nonrépondeuses. Autre exemple, sur 124 patients de stade B et C de Dukes d’un cancer colorectal et porteurs de CTC, ceux dont les CTC exprimaient CD133 (n = 36) ont présenté une survie sans progression (SSP) et une survie globale (SG) plus courte que ceux dont les CTC n’exprimaient que des ARNm épithéliaux [20]. Dans la mesure où elle est la plus utilisée, la méthode CellSearch® a été la première à être critiquée en raison de l’utilisation exclusive d’un Ag épithélial. Elle vient récemment de prouver que, malgré ce défaut, elle assure à la numération des CTC une valeur pronostique telle qu’elle a été initialement décrite dans les cancers du sein [59] et ce quel que soit le sous-type moléculaire, y compris le soustype normal-like dont une étude avait montré qu’elle le détecte avec difficulté [60]. Il faudra cependant dans l’avenir développer des stratégies de sélection basées sur un panel de marqueurs antigéniques et/ou moléculaires plus large. Ceci imposera d’effectuer une sélection négative drastique pour empêcher l’interférence des leucocytes qui expriment nombre de marqueurs considérés comme des marqueurs d’agressivité dans les CTC (marqueurs mésenchymateux, CD44, ALDH-1, CD133).

Comparaison des méthodes

Coût Le coût de ces méthodes est extrêmement variable, les plus économiques étant les méthodes moléculaires sans néces168

Les performances analytiques et cliniques de la méthode CellSearch® lui valent d’être aujourd’hui la seule approuvée par la FDA pour l’utilisation en clinique. Étant pour cette raison le « gold standard » actuel malgré ses limites, c’est par rapport à elle qu’a été effectué le plus grand nombre d’études de comparaison. En termes de sensibilité de détection Méthode CellSearch® versus méthodes moléculaires Les méthodes de qRT-PCR multiplex apparaissent les plus performantes. Dans une étude sur 76 patientes atteintes de cancer du sein métastatique, la qRT-PCR multiplex donne un pourcentage de positivité (CK19 OU mammaglobulinepositif) de 61 % contre 36 % pour la méthode CellSearch® (seuil : ≥ 2 CTC/7,5 mL) [62]. Dans un autre travail effectué chez 20 patients atteints d’un cancer colorectal, la qRT-PCR est positive dans 75 % des cas contre 14,3 % pour la méthode CellSearch® (seuil : ≥ 1 CTC/7,5 mL) [63]. Outre leur haute sensibilité intrinsèque, la plus grande richesse de l’échantillon en molécules cibles peut expliquer l’avantage des qRT-PCR. En effet, alors que les méthodes CellSearch® et AdnaTest® identifient les CTC après une sélection cellulaire, les qRT-PCR sont effectuées à partir des ARN totaux extraits des PBMC isolées par un gradient de concentration. Ceci n’altère pas leur spécificité à partir du moment où un seuil d’expression suffisamment élevé est choisi mais améliore peut-être leur sensibilité de détection. De plus, la méthode CellSearch® ne compte comme CTC que les cellules morphologiquement intactes. Or, de nombreux éléments figurés exprimant des antigènes épithéliaux mais pas le CD45 circulent dans le sang des patients. Correspondant à des formes plus ou moins dégradées de CTC [40] ils peuvent néanmoins constituer une source d’ARN ou d’ADN cibles intacts lors d’analyses moléculaires. Concernant la sensibilité de la méthode AdnaTest® dans les cancers du sein, les données de confrontation avec la méthode CellSearch® sont discordantes [62, 64, 65]. Dans une étude incluant 55 patientes atteintes d’un cancer du sein métastatique, elle a été décrite comme aussi voire plus sensible en fonction du seuil de positivité choisi en CellSearch® (53 % vs 47 % si ≥ 2 CTC/7,5 mL et 36 % si ≥ 5 CTC/7,5 mL) [63]. À l’inverse, dans deux autres études dont une incluant 221 échantillons provenant de patientes métastatiques, la méthode CellSearch® s’est avérée Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 2, mars-avril 2014


significativement plus sensible que la méthode AdnaTest® , y compris pour le seuil le plus élevé de ≥ 5 CTC/7,5 mL (53% contre 40 % [27]). Méthodes moléculaires entre elles La méthode AdnaTest® , non quantitative, a été comparée à des qRT-PCR mono et multiplex dans deux études [62, 65]. Les pourcentages de positivité apparaissent extrêmement dépendants du (des) transcrit(s)-cible(s) choisi(s). Ainsi, si le pourcentage de positivité de la méthode AdnaTest® et de la qRT-PCR monoplex CK19 est comparable dans les deux cas (autour de 20 %), il est de 54 % pour la qRT-PCR monoplex si l’ARNm cible est celui de la mammaglobuline [62]. Les résultats concernant les amplifications multiplex sont contradictoires. L’étude simultanée des transcrits CK19 et mammaglobuline par qRT-PCR apporte un avantage significatif sur la méthode AdnaTest® (61% de positivité contre 22 %) [62] mais ce n’est pas le cas lorsqu’une qRT-PCR multiplex (CK19, HER2 et MAGE-A3) est comparée à la méthode AdnaTest® [65]. L’étude de Strati et al. [65] apporte une seconde information d’importance : la supériorité d’une méthode sur l’autre peut s’inverser en fonction du contexte clinique. En effet, alors que la méthode Adna détecte 16,5 % de patientes CTCpositives dans le groupe « maladie localisée » (n = 254) soit moins que la qRT-PCR (22,8 %), elle s’avère beaucoup plus sensible dans le groupe des 51 patientes métastatiques (59,4 % vs 39,2 %) [65]. Toutes les amplifications pour un patient utilisant le même échantillon d’ADNc, c’est vraisemblablement la nature des transcrits étudiés par les deux méthodes qui explique cette différence. Méthode CellSearch® et systèmes de puces Il n’existe pas de confrontation directe publiée entre la méthode CellSearch® et la CTC-chip® . Cependant, avec l’annonce en 2007 [6] d’un enrichissement en CTC viables 100 fois supérieur aux méthodes classiques (sous-entendu CellSearch® ), assorti d’un nombre de CTC/mL au moins dix fois plus élevé [66], la puce développée par Nagrath et al. est apparue comme un progrès majeur dans l’étude des CTC. De plus, l’efficacité de détection n’apparaissait pas dépendante du niveau d’expression d’EpCAM. Les auteurs ont expliqué ces remarquables performances par l’optimisation du débit au sein de la puce (1 à 2 mL/h) permettant à la fois d’augmenter la sensibilité de capture en prolongeant le contact intime de l’échantillon avec les dizaines de surface fonctionnalisées par l’anticorps antiEpCAM et de limiter les forces de cisaillement pouvant endommager les membranes. Cette puce a été utilisée avec succès pour la recherche de mutations du gène de l’EGFR dans des CTC de CPNPC [24]. La structure complexe de ce système ne permet cependant pas une production à large échelle et donc la réalisation d’études cliniques. C’est pour Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 2, mars-avril 2014

cette raison qu’une seconde-génération, la HerringborneChip® , plus facile à fabriquer, a été développée par la même équipe et utilisée pour mettre en évidence le transcrit de fusion TMPRSS2-ERG dans des CTC d’origine prostatique [6]. Paradoxalement, deux autres systèmes commerciaux de puces fonctionnalisées par un anti-EpCAM (Onco-CEE® et On-Q-ity® ) n’ont montré qu’une efficacité de détection équivalente à la méthode Cell-Search® (≥ 75 %), efficacité d’autant plus réduite que l’expression d’EpCAM est faible [56]. La spécificité de la CTC-chip de Nagrath et al. a ainsi été remise en cause par certains auteurs. Méthode CellSearch® et Iset® La méthode Iset® basée sur une filtration sélective du sang suivie d’une analyse par immunocytochimie des CTC est peu présente dans la littérature. Deux études de comparaison avec la méthode CellSearch® (seuil : ≥ 1 CTC/7,5 mL) ont cependant été publiées par la même équipe. La première a concerné les échantillons de 210 patients atteints de CPNPC avant chirurgie [67], la seconde ceux de 40 patients de stade IIIA à IV [7]. Pour les patients opérables, le pourcentage de positivité était équivalent (≈ 40 %) avec les deux méthodes en utilisant un marquage anti-CK pour la méthode Iset® [67]. Chez les patients aux maladies localement avancées ou métastatiques, le pourcentage de détection par Iset® était beaucoup plus élevé qu’avec la méthode CellSearch® (80 % vs 23 %) [7]. De plus, dans les deux cas ainsi que dans un travail sur les CPPC [5], seule la méthode Iset® a permis de détecter les microembols. Associé à sa grande souplesse puisque n’importe quelle identification antigénique peut être effectuée après la filtration, ce dernier point fait de la méthode Iset® un outil sans doute complémentaire de méthodes plus automatisées et rapides. En termes de spécificité de détection L’excellente spécificité de la méthode CellSearch® mise en évidence lors de sa validation (97,7 % : [66]) n’a jamais été remise en cause même si, évidemment, tout est une question de seuil. Pour illustration, dans l’essai Success où le seuil est fixé très bas à > 1 CTC/23 mL, le taux de faux positifs est de 4 % (3/74), trop proche sans doute du taux de positivité chez les patientes (10 % : 14/1 500). Les qRT-PCR, mono ou multiplex, sont également extrêmement spécifiques de par la possibilité de choisir un seuil d’expression et de le remonter si nécessaire pour gagner en spécificité en perdant peu de sensibilité. Ceci n’est pas possible pour la méthode AdnaTest® , non quantitative, pour laquelle on note parfois un défaut de spécificité, même si elle reste toujours supérieure à 90 % [62, 65]. Parmi les autres méthodes, on peut noter une spécificité de 100 % décrite pour la CTC-chip® [55], la méthode Iset® [67], la méthode Epispot® [57]. 169

Synthèse En termes de concordance Toutes les comparaisons directes ont démontré que la concordance entre les méthodes de détection et de caractérisation des CTC représente le point faible de ces nouveaux marqueurs : pour exemples, dans une étude sur 76 patientes atteintes d’un cancer du sein métastatique, seuls 10 % des échantillons étaient rendus positifs par chacune des trois méthodes mises en œuvre [62] ; chez 210 patients porteur d’un CPNPC résécable, seuls 20 % des échantillons étaient positifs en CellSearch® (≥ 1 CTC/7,5 mL) et en immunocytochimie anti-CK + anti-vimentine après filtration Iset® [67]. Étant donné la diversité des principes, des outils, des conditions pré-analytiques, cette observation n’est guère étonnante. De plus, les pourcentages de concordance sont hautement dépendants des seuils utilisés. Par exemple, si la première comparaison des méthodes CellSearch® et AdnaTest® a retrouvé une concordance médiocre (64 % sur 221 échantillons avec un seuil ≥ 5 CTC/7,5 mL [27]), une seconde [62] a obtenu un bien meilleur résultat (81 % de concordance sur 76 patients) en utilisant un seuil plus bas à ≥ 2 CTC/7,5 mL, alors qu’ils s’agissait dans les deux cas de cancers du sein métastatiques. L’étude de Strati et al. [65] a tenté de limiter l’obstacle de cette diversité en comparant les résultats obtenus pour 305 patients par trois méthodes moléculaires mises en œuvre sur le même échantillon d’ADNc, les ADNc ayant été préparés de manière identique pour tous les patients, à partir de populations cellulaires sélectionnées de la même manière (EpCAM+, MUC-1+). Les résultats n’ont pas été meilleurs : la concordance entre la méthode AdnaTest® et la qRT-PCR multiplex n’a été que de 65,3 %. Seule l’amplification de la même cible (CK19) avec les mêmes amorces et les mêmes sondes a permis d’atteindre un chiffre un peu plus élevé (72,2 %). La concordance est également insuffisante en ce qui concerne la caractérisation, en particulier l’expression de HER2, la seule caractéristique dont l’évaluation par deux méthodes a été comparée. Sur 62 échantillons identifiés HER2-positifs par la méthode CellSearch® , seule la moitié l’a été par la méthode AdnaTest® [27]. Plus inquiétant encore, lorsque la méthode AdnaTest® a été comparée à une qRT-PCR HER2, sur 60 échantillons identifiés HER2positifs par l’une ou l’autre des méthodes, seuls 2 l’ont été par les deux [65]. Il est clair que cette absence de corrélation entre méthodes empêche aujourd’hui leur généralisation et par là même l’utilisation des CTC comme biomarqueurs en pratique clinique. Une preuve indéniable est la différence de valeur pronostique des CTC en fonction de la méthode utilisée [68]. Dans une population de 221 patientes atteintes de cancer du sein métastatique, 60 % étaient CTC-positives avec la méthode CellSearch® au seuil de ≥ 5 CTC/7,5 mL. Dans 170

ce groupe, la survie globale médiane a été de 18,1 mois alors qu’elle a été de 27 mois dans le groupe CTC-négatif (p < 0,001). À l’inverse, aucune corrélation significative n’a pu être mise en évidence entre le statut CTC évalué par la méthode AdnaTest® et la survie globale. Conclusion La méthode de détection idéale des CTC devrait, outre la sensibilité, la spécificité et la robustesse indispensables, présenter trois caractéristiques : – inclure pour la sélection positive des marqueurs épithéliaux dont l’expression n’est pas réprimée lors de l’EMT et/ou des marqueurs mésenchymateux surexprimés durant ce processus ainsi que des marqueurs de cellules souches ; – permettre la caractérisation phénotypique et/ou moléculaire des CTC, si possible individuellement, afin de définir leur potentiel d’agressivité et leur comportement probable vis-à-vis des différents traitements envisageables ; – distinguer les cellules viables des cellules apoptotiques. Il est possible que ces objectifs ambitieux ne puissent être atteints avec une seule méthodologie mais nécessitent l’association de plusieurs techniques. De plus, la validation à large échelle de ces méthodes est loin d’être acquise ce qui explique qu’en 2013, sur la cinquantaine de méthodes proposées dans le commerce biotechnologique, une seule possède l’agrément de la FDA [47]. Cette validation devra inclure : 1) la standardisation de la phase pré-analytique ; 2) la standardisation des phases de sélection/enrichissement et d’identification/caractérisation ; 3) la mise en place de contrôles de qualité internes et externes, ce qui nécessitera la mise au point de suspensions cellulaires stables et transportables.

Intérêt clinique de l’étude des CTC Valeur pronostique La publication princeps de Cristofanilli et al. en 2004 a montré chez 177 patientes porteuses d’un cancer du sein métastatique qu’un nombre de CTC ≥ 5/7,5 mL de sang avant mise en place d’un traitement et à la première visite de suivi (3-5 semaines : S3-S5)) est un facteur pronostique indépendant, défavorable en termes de survie sans progression (SSP) et de survie globale (SG). Cette observation, réalisée grâce au système CellSearch® , s’est élargie à un grand nombre de localisations tumorales, les études cliniques se multipliant à vitesse exponentielle depuis quelques années. Les tableaux 1 et 2 résument les études princeps pour chaque localisation. Sans entrer dans le détail, on peut cependant mettre en avant quelques points d’intérêt particulier. Cancer du sein Avec la méthode CellSearch® et pour un seuil ≥ 5 CTC/7,5 mL, des CTC sont retrouvées chez environ la moitié des Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 2, mars-avril 2014


patientes atteintes de maladies métastatiques, avec quelques variations d’incidence en fonction des études [59, 69, 70]. On en retrouve également, en pourcentage très variable en fonction de la méthode utilisée mais toujours en quantité moindre chez des patientes atteintes de maladies localisées [71, 72], de tumeurs inflammatoires ou localement avancées [31, 73]. La première méta-analyse a été publiée récemment [74]. Retenant 69 études incluant en tout 6 825 patients, elle montre que la présence de CTC est un facteur pronostique défavorable en termes de SSP et de SG à la fois pour les cancers localisés (SSP : RR = 2,86 ; SG : RR = 2,78) et pour les cancers métastatiques (SSP : RR = 1,78 ; SG : RR = 2,33). Ces résultats sont indépendants de la méthode de détection utilisée ou du moment du prélèvement au cours de la prise en charge. Par contre, cette valeur pronostique disparaît chez les patientes porteuses d’une tumeur HER2positive et traitées par chimiothérapie + trastuzumab ou lapatinib [75]. Ceci peut s’expliquer par la grande efficacité de ces traitements qui font disparaître totalement les CTC au bout de 3 à 4 semaines [76, 77]. À noter que le risque de progression ou de décès augmente linéairement avec le nombre de CTC [70]. Pour les cancers du sein localisés, étant donné la faible quantité de CTC, des méthodes plus sensibles que celles disponibles actuellement seront vraisemblablement nécessaires pour asseoir l’intérêt pronostique avant un traitement adjuvant ou néo-adjuvant. Si cet intérêt a pu être mis en évidence grâce une qRT-PCR multiplex [78], la méthode CellSearch® est dans ce domaine prise en défaut. Pour démontrer un impact significatif sur la SSP de la présence de CTC chez des patientes atteintes de tumeurs de stade II et III, il a fallu abaisser le seuil à ≥ 1 CTC/7,5 mL, générant ainsi un taux de faux-positifs de 5,5 % [31] bien supérieur à ceux habituellement observés. Pour contourner ce problème, l’équipe de Munich a choisi d’augmenter la quantité de sang utilisée. Dans la présentation des résultats préliminaires de l’essai Success en 2010 [72] (essai non publié à ce jour : 1 500 patientes avec tumeur localisée de haut grade et/ou N+) le seuil a été positionné à ≥ 1 CTC/23 mL. Bien que modeste, une significativité de la persistance de CTC au-dessus de ce seuil en fin de traitement en terme de SSP (p = 0,04) et de SG (p = 0,03) a été montrée. Cependant, le taux de faux positifs (4 % pour 10 % de positivité chez les patientes) laisse là encore planer un doute sur l’aptitude en termes de sensibilité de la méthode CellSearch® dans ce contexte. Prostate Comme pour les cancers du sein, les études ayant établi la valeur pronostique des CTC dans les cancers de la prostate sont nombreuses et remontent pour certaines au milieu des Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 2, mars-avril 2014

années 1990 : en 2012, une revue en relevait 16 pour les tumeurs localisées et 17 pour les maladies métastatiques [79]. La richesse en études portant sur les maladies localisées, si l’on compare aux tumeurs mammaires, tient vraisemblablement à l’existence de marqueurs spécifiques d’organe (PSA, PMSA) pouvant être recherchés par les techniques les plus sensibles, à savoir des qRT-PCR. À quelques réserves près, elles ont démontré la valeur pronostique négative des CTC en termes de rechute biologique, de SSP et parfois de SG. Par exemple, après un suivi médian de 23 mois, la mise en évidence après prostatectomie radicale de CTC par une RT-PCR nichée dirigée contre le Prostate stem cell antigen (PSCA) chez 17/103 (16,5 %) patients porteurs de maladie à haut risque a démontré un risque de rechute biologique 4,5 fois plus élevé que chez les patients négatifs [80]. Pour la gestion de la maladie métastatique, le PSA sérique n’a pas la même valeur que lors des phases précoces car l’interprétation des taux est rendue difficile par les traitements androgéno-suppresseurs, l’apparition d’une androgéno-résistance et la dédifférentiation tumorale en particulier neuro-endocrine. C’est la raison pour laquelle un nouveau marqueur pronostique sanguin telles les CTC serait le bienvenu. Les études dans ce contexte sont récentes et ont pratiquement toutes utilisé un enrichissement immunomagnétique, soit le plus souvent dans le cadre de la méthode CellSearch® soit parfois pour effectuer par la suite une analyse moléculaire. Dans les cancers métastatiques hormono-résistants, avant une première ligne de chimiothérapie, les CTC représentent un facteur indépendant de risque en termes de survie supérieur au PSA et à son évolution [81]. Toujours dans les maladies métastatiques mais hormono-sensibles cette fois, le nombre de CTC avant mise en place de la déprivation androgénique a également montré sa valeur pronostique. À noter que contrairement aux maladies hormono-résistantes, ce nombre est corrélé au taux de PSA. Cancer colorectal En situation métastatique, les deux études princeps sont celles de Cohen et al. en 2008 [82] et celle de Tol et al. en 2010 [83]. Les différences de survie sont apparues hautement significatives dans les deux cas au seuil de ≥ 3 CTC/7,5 mL en CellSearch® . La valeur pronostique indépendante des CTC dans ce contexte pourrait être particulièrement utile pour identifier les patients qui bénéficieront le plus de la résection de métastases hépatiques. En situation adjuvante, une méta-analyse incluant 36 études et 3 094 patients a été publiée [84]. Elle démontre de façon beaucoup plus convaincante que dans les cancers du sein localisés la valeur pronostique indépendante des CTC que ce soit en SSP (RR = 3,24) qu’en SG (RR = 2,28). 171

Synthèse Cancer du poumon Pour les CPNPC, la valeur pronostique des CTC a été démontrée par la méthode CellSearch® et la méthode Iset® , que ce soit dans le contexte adjuvant [67] ou métastatique [85]. Dans les deux situations, le pourcentage de positivité parmi les patients et le nombre de CTC augmentent avec le stade de la maladie. La première étude sur les CPPC date de 2012 [5] et contraste avec celles effectuées dans les autres localisations par le nombre très important de CTC retrouvées. Ceci est vraisemblablement le fait de la présence de la tumeur qui, dans cette maladie, est le plus souvent en place car inopérable. Le seuil pour la méthode CellSearch® a donc été fixé à 50 CTC/7,5 mL. Dans ces conditions, la valeur pronostique négative du nombre de CTC en termes de SSP et de SG, mais également celle de la présence de microembols sur la SG ont été démontrées. Mélanome Les études existantes ont concerné la situation métastatique. Deux ont utilisé une qRT-PCR multiplex ciblant des ARNm spécifiques des mélanocytes [86, 87], la troisième a utilisé la méthode CellSearch® au seuil de ≥ 2 CTC/7,5 mL. Dans les trois cas, la détection de CTC est un facteur indépendant péjoratif de SG. Autres localisations En ce qui concerne les autres localisations (rein, ovaires, vessie, foie, pancréas), les études sont très récentes et peu nombreuses mais vont toutes dans le sens d’une valeur pronostique péjorative de la présence de CTC (tableau 2). Valeur prédictive d’efficacité des traitements Cancer du sein Dans les cancers du sein localisés, la persistance de CTC en fin de traitement adjuvant [87, 88] ou une élévation importante de leur nombre pendant le traitement [90-92] est un facteur prédictif de rechute plus précoce, que le traitement soit une chimiothérapie [88, 92], une hormonothérapie [89, 90] ou un traitement de maintenance par trastuzumab [91]. Concernant les chimiothérapies néo-adjuvantes, il semble que la réduction du nombre de CTC en cours de traitement soit bien corrélée à la fonte tumorale [93], mais que leur nombre à l’issue du traitement ne le soit ni à la SSP, ni à la SG [94]. Dans le contexte métastatique, le même type de résultat a été obtenu. En première ligne, un nombre de CTC ≥ 5/7,5 mL permet d’identifier les patientes HER2-négatives qui bénéficieront le plus d’une chimiothérapie agressive ou associée à du trastuzumab [77]. La SSP et la SG sont significativement plus courtes chez les patientes qui au deuxième, troisième et quatrième cycle d’une chimiothérapie associant ou pas du trastuzumab présentent des CTC persistantes [76]. 172

Enfin, il faut noter que si le risque de rechute apparaît le même chez les patientes dont les CTC ne sont jamais détectables et chez celles dont les CTC disparaissent en cours de traitement, ce risque est considérablement augmenté chez les patientes dont les CTC persistent ou voient leur nombre augmenter (RR = 6,4 [70]). Cancers de la prostate Les données concernant la valeur prédictive des CTC sont peu nombreuses, mais il semble que leur nombre permette d’évaluer l’hormonosensibilité à venir des maladies métastatiques. Dans l’étude de Resel Folkersma et al., le risque d’apparition d’une hormono-résistance apparaît 6 fois plus élevé chez les patients possédant 4 CTC ou plus par 7,5 mL de sang avant mise en place de l’androgénothérapie [95]. Dans une étude plus large sur 80 patients, la durée médiane d’efficacité de la déprivation androgénique a été évaluée à 17 mois chez les 44 patients ≥ 5 CTC/7,5 mL contre 32 mois pour les patients en dessous du seuil avant mise en place de l’hormonothérapie [96]. Autres La valeur prédictive favorable en termes de survie de la disparition ou de la diminution du nombre de CTC lors des traitements a également été démontrée dans les cancers colorectaux métastatiques [82, 83], les CPPC [5], les CPNPC [97], les mélanomes métastatiques [86, 98] (tableau 2). En règle générale, le risque de rechute et de décès apparaît être une fonction constante du nombre de CTC. Cela pose la question de la pertinence d’utiliser une valeur discrète de seuil pour différencier les répondeurs des non-répondeurs. Prenons un patient dont le nombre de CTC passe de 100 à 10 et un autre pour lequel il passe de 6 à 4, le seuil étant fixé à ≥ 5. Lequel des deux patients bénéficie le plus du traitement ? Celui dont le nombre de CTC diminue de 90 % mais qui reste au-dessus du seuil ou celui dont le nombre de CTC ne diminue que de 33 % mais passe en deçà du seuil ? Cette interrogation est familière aux utilisateurs des marqueurs tumoraux sériques. Elle trouvera peut-être aussi sa réponse dans l’analyse de la cinétique d’évolution du contingent de CTC, même si les mécanismes de sécrétion protéique et de relargage cellulaire par un tissu tumoral n’obéissent vraisemblablement pas aux mêmes lois cinétiques. Apports des CTC à la gestion des traitements Indication des thérapies ciblées Afin de sélectionner les patients pouvant bénéficier de ces traitements et étant donné leur coût élevé, la majorité d’entre eux ne peuvent être prescrits que si l’anomalie moléculaire correspondante est mise en évidence dans la tumeur primitive (amplification de HER2 pour le trastuzumab, mutation Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 2, mars-avril 2014


activatrice d’EGFR sans mutation de RAS pour l’erlotinib ; mutation de BRAF pour le vemurafinib dans les mélanomes, etc.). Malgré cela, le taux de résistances basales ou induites reste important. La caractérisation antigénique ou moléculaire des CTC pourrait se révéler une option plus pertinente, si l’on en juge les disparités phénotypiques et/ou génotypiques entre CTC et tumeur primitive. Vers un « CTC-monitoring » des traitements ? La dynamique des CTC pourrait éventuellement permettre d’adapter le traitement sans attendre les preuves cliniques et radiologiques de progression. Ceci serait particulièrement utile dans les premières semaines d’une thérapie ciblée, afin de pouvoir décider rapidement de l’interruption d’un traitement couteux, s’il s’avère inopérant. Le fait que les thérapies ciblées induisent des diminutions drastiques du nombre de CTC lorsqu’elles sont efficaces apparaît ici comme un avantage. Plusieurs essais randomisés de large envergure sont en cours pour évaluer l’efficacité de tels « CTC-monitoring », en oncologie mammaire (pour revue, voir [99]). CTC : nouveau critère de jugement en recherche clinique ? Aujourd’hui, les essais cliniques de phase III destinés à prouver le rapport bénéfice/risque de nouveaux médicaments dans l’objectif de leur commercialisation sont extrêmement longs. Au-delà de la préparation, de la mise en place et du temps nécessaire au recrutement, c’est l’utilisation de la survie comme marqueur incontournable de bénéfice pour le patient qui en est responsable. La validation de la SSR a déjà été un progrès par rapport à l’utilisation de la seule SG et, dans certains cas comme le cancer de la prostate avec le PSA, des marqueurs biologiques peuvent être utilisés comme « surrogate endpoints » c’est-à-dire comme des critères de jugements intermédiaires. Sera-ce le cas des CTC ? L’idée est tentante mais il faudra au préalable que ce nouveau biomarqueur soit utilisé dans de larges études prospectives et randomisées testant l’efficacité de nouveaux schémas thérapeutiques, afin que sa valeur en tant que critère de jugement soit comparée à celle des critères classiques, et éventuellement validée. De nombreuses études sont en cours, et certaines ont déjà été publiées comme par exemple la phase II évaluant l’efficacité de l’association pertuzumab-erlotinib dans les CPNPC. En parallèle aux critères de jugement classiques, la diminution du nombre de CTC s’est révélée bien corrélée à la réponse en PET-Scan (p = 0,014), à la réponse selon les critères Recist (Response evaluation criteria in solid tumors ; p = 0,019) et à la survie (p = 0,05) [97]. Ann Biol Clin, vol. 72, n◦ 2, mars-avril 2014

Ouverture vers de nouvelles voies thérapeutiques L’étude intime du transcriptome des CTC pourra vraisemblablement désigner à partir des transcrits surexprimés des protéines représentant des cibles thérapeutiques potentielles. Cela a été le cas dans l’étude de Powell et al. avec le gène codant pour la protéine S100A, protéine voisine de la S100P déjà désignée comme cible thérapeutique dans les cancers du sein invasifs. D’autres exemples viendront, comme peut-être le gène WNT2, surexprimé dans les CTC issues d’un modèle murin de cancer pancréatique et participant au processus métastatique [100].

Conclusion La détection/numération et la caractérisation phénotypique des CTC sont, avec les ADN et les miRNA circulants, les tests biologiques les plus prometteurs en oncologie. L’intérêt pronostique des CTC paraît aujourd’hui ne plus faire de doute dans les localisations les plus fréquentes, au moins au stade métastatique et avec la méthode CellSearch® . Par contre, les données manquent encore pour en faire des marqueurs d’aide à la gestion des traitements (choix, suivi de l’efficacité en temps réel), ainsi qu’un critère de jugement intermédiaire pour l’évaluation du bénéfice apporté par de nouveaux schémas thérapeutiques dans le cadre d’essais cliniques, c’est-à-dire pour leur faire mériter l’appellation de « biopsie liquide » aujourd’hui consacrée par la littérature. De plus, le coût important de la méthode CellSearch® et le manque de standardisation des autres techniques commerciales apparaissent comme un obstacle supplémentaire à l’utilisation large de ce nouveau biomarqueur. De nombreuses études clinico-biologiques ont déjà été mises en route, essentiellement dans le cadre de l’oncologie mammaire, avec pour principaux objectifs : – d’évaluer l’intérêt de guider les décisions thérapeutiques sur la numération et la caractérisation des CTC ; – de comparer la valeur des CTC en tant que critère de jugement de l’efficacité thérapeutique à celle des critères de jugement classiques (réponse pathologique, iconographique, critères Recist, survie) ; – de valider de nouveaux systèmes analytiques, en particulier microfluidiques, capables de détecter les CTC les plus dangereuses et de quantifier avec précision leur degré de disparité avec la tumeur primitive. L’intérêt de l’étude des CTC ne se résumera certainement pas à cet intérêt clinique. En effet, les études moléculaires extrêmement complètes sur des cellules isolées fourniront vraisemblablement des explications précieuses sur les mécanismes invasifs et métastatiques, en particulier sur 173

Synthèse l’orchestration des différentes voies de signalisation entre les cellules tumorales et leur microenvironnement. Il apparaît effectivement de plus en plus évident que le processus métastatique ne peut parvenir à son terme de par les seules propriétés des cellules tumorales libérées dans la circulation, mais qu’il nécessite leur interaction avec de nombreux types cellulaires [17]. Ainsi, dans cette spécialité qu’est l’oncologie où l’étude tissulaire est reine, les CTC représentent peut-être pour les biologistes médicaux une nouvelle occasion, trente ans après les marqueurs tumoraux sériques, de démontrer leur expertise. Tâchons de ne pas rater le train ! Liens d’intérêts : L’auteur déclare ne pas avoir de lien d’intérêt en rapport avec cet article.

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Beyond counting: new way to use circulating tumor cells.

Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications.

Extracorporeal photo-immunotherapy for circulating tumor cells.

Circulating tumor cells captured for analysis.

[Multimorbidity: a central challenge for modern medicine].

[Circulating tumor cells: liquid biopsy].

Detection of circulating tumor cells.

Metastasis and Circulating Tumor Cells.

New applications of the acridine orange fluorescence staining method: Screening for circulating tumor cells.

Circulating tumor DNA: new horizons for improving cancer treatment.

Circulating Tumor Cells in Genitourinary Malignancies: An Evolving Path to Precision Medicine.

Rural medicine: a formidable challenge.

Nanotechnology for the detection and kill of circulating tumor cells.

Microfluidic platform for negative enrichment of circulating tumor cells.

Micro- and nanotechnology approaches for capturing circulating tumor cells.

Nanotechnology for enrichment and detection of circulating tumor cells.

Identifying cancer origin using circulating tumor cells.

Circulating tumor cells in breast cancer.

A New Cell Block Method for Multiple Immunohistochemical Analysis of Circulating Tumor Cells in Patients with Liver Cancer.

Circulating tumor cells in oral cancer.

Cold Agglutinin Disease; A Laboratory Challenge.

Circulating Tumor Cells In Colorectal Cancer.

Circulating Tumor Cells: Back to the Future.