Planta (Berl.) 85, 118--125 (1969)

Ver/inderungen im Gehalt yon Abscisins/iure und Indol-3-essigsiiure sowie der Chloroplastenfarbstoffe in Pisumkeimlingendurch Gibberellins/iure ARNO TIETZ u n d K ~ L DORFFL~NG Staatsinstitut fiir Allgemeine Botanik, Hamburg Eingegangen am 18. November 1968

Changes in the Contents o/Abscisic Acid, Indoleacetic Acid, and Chloroplast Pigments in Pea Seedlin!Ts Treated with Gibberellic Acid Summary. Twelve-day old pea seedlings were treated with gibberellic acid (GAa). The hormone was applied to the apical bud in quantities of 0.05, 0.5, and 5 tzg in 5 ~1 droplets. After 2 and 4 days the contents of indoleacetic acid (IAA) and abscisic acid (ABA) of the apical parts (apical bud including the 5th internode) and of the basal parts (3rd and 4th internode and leaves) were estimated by means of paper chromatography of ether extracts and bioassay with avena eoleoptile segments. In addition, the contents of ABA were checked by spectropolarimetric measurement. Apical parts of the gibberellin treated plants contain more IAA, basal ones less IAA than the untreated controls. On the other hand, the contents of ABA are higher in basal parts and lower in apical parts. Only the seedlings treated with 5 9g GAa and analysed after 2 days do not follow this rule. Their apical parts contain not only more IAA but also more ABA than the untreated plants, and their basal parts contain more IAA than the controls. It is concluded, therefore, that GAa causes changes not only in the contents of these hormones but also in the distribution of hormones within the plant. Moreover, GAa decreases the contents of chlorophyll a and b and of the carotenoids. The changes in carotenoid contents do not seem to be related to the changes in abscisic acid contents. Einleitung A p p l i k a t i o n y o n Gibberellins/~ure ffihrt bei vielen P f l a n z e n (NITSCH, 1957; KURAISHI u n d Munr 1963, 1964; BAST1-N, 1967) ZU einem erhShten Gehalt a n Indol-3-essigs~ure (IES). Wie der h5here Gehalt b e w i r k t wird, k o n n t e bisher n i c h t eindeutig gekl~rt werden (vgl. BASTIN, 1967; OCKE~SE u n d GALSTON, 1967; A~NEV u n d MA~C~N~LL~, 1967). U n t e r s u e h u n g e n fiber die W i r k u n g v o n Gibberellins/s (GA3) auf den Gehalt endogener H e m m s t o f f e h a b e n zu unterschiedlichen Result a t e n geffihrt. Boo (1961) stellte i n Kartoffelknollen nach GAa-Behandl u n g eine A b n a h m e des Gehaltes a n ,,inhibitor fl" lest. KV~AISHI u n d

Ver~nderungen des Ahscisingehaltes usw. durch Gibberellin

119

Mur~ (1964) erhielten keine Xnderung des Kemms~offgehaltes in Di/fusaten yon Zwergerbsen nach GA3-Behandlung. GwA~ et al. (1964) untersuchten Erbsenkeimlinge aus Samen, die in GA,-L6sung eingequollen worden waren, und fanden nach 6 Tagen weniger ,,inhibitor fi" als in den Kontrollen. I m Gegensatz dazu erhielten YOSm~VgA u n d TAGAWA (1963) in etiolierten H y p o c o t y l s e g m e n t e n yon Bohnen einen h6heren Hemmstoffgehalt nach Infiltration y o n Gibberellins~ure. Die in den angeffihrten Arbeiten untersuchte ehromatographische ttemmstofffraktion, der sog. ,,inhibitor ~", enths neben physiologiseh schwach wirksamen phenolischen Substanzen das P h y t o h o r m o n Abseisins/~ure (ABS) (D6gFgLI~G, 1967; M~BOagOW, 1967). Wir untersuchten daher den EinfluB einer GAs-Behandlung bei Erbsenkeimlingen auf den Gehalt y o n Abseisinsgure u n d y o n I E S . Ferner wurde der Pigmentgehalt der Keimlinge bestimmt, da die Biosynthese y o n Abseisins~ure m6glieherweise mit den Carotinoiden in Zusammenhang steht (ADDICOTT, 1966; TAYLOR u n d SMITH, 1967; TAYLOR, 1968).

Methodik

Versuchsp]lanzen. Markerbsen, Sorte ,,Senator", wurden naeh 24 h Quellung in Wasser in einem Gemisch aus Vermieulit und Bimskies ausges~t. Die Anzucht erfolgte im Gew~chshaus mit zus~tzlieher Beleuehtung durch LeuehtstoffrShren (Philips TLF 65 W/34 de Luxe). 12 Tage alte Keimlinge, durchsehnitt|ich 85 ram hoch, erhielten mit einer Mikroliterspritze je 5 ~1 einer w~Brigen GA3-L6sung (0,01, 0,1 und 1 g/1 in 0,05% tween 20) zwischen die jfingsten BlOtter; das entsprieht pro Pflanze 0,05, 0,5 und 5~g GAs. Kontrollpfl~nzen wurden nur mit tween 20 behandelt. Naeh 2 bzw. 4 Tagen wurden gleiehe Mengen Frisehgewicht (meistens 30 g) yon Sprol]spitzen einschlieBlieh des 5. Internodiums und yon den ira Wachstum nicht veri~nderten SproBbasen (3. und 4. Internodium einschlieBlich der BlOtter) getrennt untersucht. ]~ezugnahme ~uf gleiche Zahl bzw. gleiches Troekengewicht (Gefriertrocknung) ffihrte zu gleichen ]~esultaten. ABS. und IES-Bestimmung. Die zerkleinerten Pflanzenteile wurden mit der 10fachen Menge ~ther bei 4~ 20 h i m Dunkeln extrahiert. Die Reinigung und papierchromatographische Trennung der Extrakte erfolgte in Anlehnung an D6~FFL~NG (1966); Lanfmittel: Isopropanol-NHa(25 %)-H20 10:1 : 1. ABS und IES werden auf diese Weise gut voneinander getrermt (Rf ABS 0,6, l~f IES 0,3). Der ABS- und IES-Gehalt wurde im biologischen Test mit Avena-Coleoptil. segmenten durch Vergleich mit der Wirkung definierter Mengen der synthetisehen Substanzen ermittelt. Quantitative A]~S-Bestimmung erfolg~e zus~tzlich mit Hilfe eines Spektropolarimeters (Cary 60) (D6~FFLING, 1967). ES ergab sieh gute Ubereinstimmung mit der biologischen Bestimmungsmethode. Eine Veffi~lschung der IES- bzw. ABS-Bestimmung im bio]ogischen Test dutch Gibberellins~ure ist ausgeschlossen. Im Atherextrakt der mit GAs behandelten Erbsenkeimlinge lassen sich zwar mit Hi]fe yon Fluorescenzreaktionen aui Diinnschichtchromatogrammen (PALEG, 1965) deutliche Gibberellinmengen naehweisen, deren Rf-Wert uuf dem Papierchromatogramm bei Verwendung des oben genannten Laufmittels 0,48 betr~gt. GAs zeigte jedoch in Kombination mit IES und ABS ira

120

A. TIETZ und K. D6R~FLI~Z(~: 7,5mm 7

-

~6,5 -

6

-

o

Y

I.I3

5,5-

I I

I

I

J

10

100

1000

P

I

10OOOjuglmI GA s

Abb. 1. Kombinationen yon IES, GAa und (:~)-ABS in ihrer Wirkung auf das Wachstum yon Avena-Coleoptilsegmenten. A 5 tzg/ml (~)-ABS + GA3; 9 5 ~zg/ml (• IES; + 5tzg (4-)-ABS+GAa+0,1~g/ml IES; [] 5 [zg/ml (:]:)-ABS + GAs+ 1 ~g/ml IES Gegensatz zu den Angaben yon T~OMAS et al. (1965) fast keine Wirkung auf das Wachstum yon Coleoptilsegmenten (Abb. 1). Bestimmung des Pigmentgehaltes. Je 1,5 g Frischgewicht yon Sprol3spitzen wurden im abgedunkelten Raum mi~ Hilfe yon fliissig#m Stickstoff und Seesand zerrieben und mit 85 % wiil~rigem Aceton quantitativ extrahiert. Zur Bestimmung der Pigmentkonzentration wurden die Extinktionen des filtrierten Extraktes bei 453, 645 mid 662,5 nm gemesson uad daraus die Konzentrationell yon Chlorophyll a und b sowie der C~rotinoide berechnet (I%(~BBELEI~,1957). Alle Ergebnisse sind durch mehrfache Wiederholungen gesichert. Ergebnisse und Diskussion

I. Veriinderungen im ABS- und IES-Gehalt gibberellinbehandelter Keimlinge Die Wachstulnsreaktion der Erbsenkeimlinge auf zugefiihrtes Gibberellin ist a m st~rksten ausgeprs bei 0,1 g/1 GA~ ( ~ 0,5 ~g/Pflanze). ] g/1 GA~ ( z 5 ~g/Pflanze) h a t gegentiber 0,1 g/1 eine relative Wachstumsh e m m u n g zur Folge (Abb. 2), die auf das Uberschreiten des Optimums in der Dosis-Effektkurve zurtiekzuftihren ist (vgl. BI~AI~ u n d I-IEMMII~G, 1955). Die Ergebnisse der ABS- und I E S - A n a l y s e n shad, ftir Sprol~spitzen und Sproi~basen getrennt, in Abb. 3 zusammengefa~t. I n Tabelle 1 sind die I E S - und ABS-Gehalte unbehandelter Kontrollpflanzen dargestellt. GemiiB Abb. 3 n i m m t der I E S - G e h a l t in den Sproi3spitzen nach Gibberellinbehandlung, verglichen mit den unbeh~ndelten Kontrollen, zu, in den basa]en Sprol]teilen dagegen ab. Eine A u s n a h m e bildet die

Ver~nderungen des Abscisingehaltes usw. durch Gibberellin

121

250 Hohe rnm I

2001 150

-

100

-

~l

I

I

10

11

12

I

t

I

I

13

lh

15

16 Tage 17

I

A b b . 2. W a c h s t u m yon Pis?~r/~l{eill]]ingei1 ll&Ch ]~eh~ndltlng der Endkl/ospe ]]3it G ~ 3 . x K o n t r o ] l e ; 9 0,5 ~g GA3; 9 5 [~g G A 3

Tabelle L Indol-3-essigsgure- und Abscisins~uregehalt von 12 Tage altenPisumsprossen in y.g/leg Frischgewicht apikale Sprol]teile

25

basale SproBteile

13

apikale Sprollteile

8

basale SproBteile

5

IES

ABS

Versuchsserie 5 ~g nach 2 Tagen, in der auch die Sprogbasen einen um durchschnit~lich 20% erh6hten I E S - G e h a l t zeigen. Die st&rksbe Vermehrung des IES-Gehaltes in den Spitzen betrggt 150% bei 0,5 ~g GA a nach 2 Tagen und 5 ~g GA 3 nach 4 Tagen, die stgrkste Verminderung in den SproBbasen 70% nach 2 Tagen bei Anwendung yon 0,5 ~g GA a. Addiert man die in Spitzen und Basen gefundenen Mengen, so ergibt sieh bei allen Behandlungsweisen eine Steigerung des IES-Gehaltes, die maximal etwa das Doppelte des Gehaltes der unbehandelten Kontrollpflanzen erreicht, z.B. bei 5 ~g GA s nach 4 Tagen. Der AB S-Gehalt dagegen lfimmt in den SproBspitzen nach Gibberellinbehandlung ab, in den basalen Teilen zu, ausgenommen wiederum die Serie 5 >g nach 2 Tagen, die auch in den Sprogspitzen einen hSheren Gehalt aufweist. Maximal vermindert sich der A]~S-Gehalt in den Spitzen um 70% (bei Applikation yon 0,5 ~g GA~ und Analyse nach 2 Tagen). Die basalen SproBteile enthalten h6chstens etwa die zweifache ABS-Menge naeh GAa-Behandlung (5 ~g GAa, Analyse naeh 4 Tagen).

122

A. TIETZ u n d K. DOI~FFLINC-: 250 -

% 200-

+

15o loo

%

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o.ospg 2d

o.osm 0,s~g z,d

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200 --

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H H

O.05pg

O,5jug

4d

2d

4d

Abb. 3. Ver~nderungen im IES-Gehalt (weil3e S~ulen) und ABS-Gehalt (schwarz~ S~ulen) yon Spro]~spitzen (obere Darstellung) und Spro~basen (untere Darstellung) nach Behandlung der Endknospen mit GAa. Kontrolle = 100% Insgesamt enthalten die Keimlinge nach Behandlung mit 0,05 und 0,5 ~g GAs weniger ABS (bis etwa 40%) als die Kontrollpflanzen, naeh Applikation yon 5 ~zg GA 3 jedoch mehr, besonders naeh 2 Tagen (38 %). Das sowohl hinsiehtlich des IES-Gehaltes als aueh des ABS-Gehaltes abweichende Ergebnis mit Keimlingen, die 5 ~g GAa erhielten nnd nach 2 Tagen untersucht wurden, 1/~gt sich mSglicherweise mit der relativen Waehstumshemmung in Zusammenhang bringen, die bei Anwendung dieser offenbar/iberoptimalen Menge auftritt. Als Folge dieses Gibberellinstol~es ist nach 2 Tagen relativ weniger IES (vergliehen mit der Behandlungsweise 0,5 ~zg GAa, Analyse naeh 2 Tagen, und 5 ~zg GAa, Analyse nach 4 Tagen) und absolut mehr ABS (vergliehen mit den Kontrollpflanzen) in den Keimlingen vorhanden. Diese Verschiebung des Hormongleiehgewiehts zugunsten des Hemmstoffes kSnnte die relative Waehstumsdepression zwanglos erkl/iren. IES und ABS werden vermutlich hauptsgchlich in den Sprogspitzen gebildet. Fiir diese Annahme sprieht der im Vergleieh zur Sprogbasis h6here Gehalt beider Substanzen in den Sprogspitzen unbehandelter Keimlinge (vgl. Tabelle 1). Wit glauben daher aus den Ergebnissen mit gibberellinbehandelten Pflanzen schlieBen zu k6nnen, dab Gibberellins/~ure nieht nur den Gehalt an IES und ABS in den Sprossen der Erbsen-

Ver~nderungen des Abscisingehaltes usw. durch Gibberellin

123

keimlinge beeinfluBt, sondern auch die Verteflung dieser Substanzen innerhalb der Sprosse. Behandlung der Endknospe mit Gibbere]lin hat demnach eine Anreicherung yon IES im apikalen Tefi zur Folge, w~hrend die Basis verarmt. ABS reiehert sieh umgekehrt in der Basis an, w~hrend die SproBspitze an Hemmstoff ~rmer wird. I I . Verdnderungen im Pigmentgehalt gibberellinbehanddter Keimlinge Die Biosynthese yon Abscisinss ist noch ungekl~rt. ADDICOTT (1966) wies auf die J~hnlichkeit im Molekfilbau yon AB S und Carotinoiden, z.B. Violaxanthin, hin und deutete an, dab ABS als Abbauprodukt der Carotinoide ents~ehen kSnnte. Experimentelle ttinweise ffir die M6glichkeit einer Umwandlung yon Carotinoiden, insbesondere Violaxanthin und Neoxanthin, durch Licht in eine Vorstufe von ABS lieferten TAYLO~ und SMITg (1967) sowie TAYLO~ (1968). Andererseits leitet G~AWBE (1967) in einem Schema fiber die Biosynthese der Isoprenoide die Abscisinsi~ure nicht yon den Carotinoiden, sondern direkt von Farnesylpyrophosphat ab. In der Literatur wird mehffach darfiber beriehtet, dab Gibberellins~ure den Carotinoidgehalt herabsetzt bzw. die Carotinoidsynthese hemmt (LEwis und CoGGI~s, 1964; MIC~EL-WoLw]~RTZ und S~O~VAL, 1963; DOSTAL und LEOPOLD,1967). Wir bestimmten daher den Gesamtearotinoidgeha]t in den gibberellinbehandelten Pflanzen, um m6gliehe Beziehungen zwischen Carotinoidgehalt und ABS-Gehalt zu finden. Da unseres Wissens fiber die Ver~nderungen des Chlorophyllgehaltes ebenfalls keine genauen Angaben vorliegen, wurde dieser mitbestimmt. Untersucht wurden Sproi]spitzen yon Keimlingen, die 2 Tage nach Applikation yon 0,5 ~g GAs (erniedrigter ABS-Gehalt) bzw. 5 9g GAs (erh6hter ABS-Geha]t) abgeschnitten worden waren. Als Bezugsgr6~e diente das Frischgewieht. Bei Bezugnahme auf das Trockengewieht, das bei gibberellinbehandelten Spro~spitzen etwa 1% niedriger ist als das der unbehandelten Kontrollen (12,5%), liegen die gefundenen Unterschiede praktisch in der gleiehen GrSl~enordnung. Tabelle 2 gibt eine ~bersicht fiber die Ergebnisse.

T~belle 2. Pigmentgehalt der Sproflspitzen in mg/lO g Frischgewicht 2 Tage nach Behandlung der Endknospe mit GAs Chlorophyll

Kontrolle 0,5 ~g GAa 5,0 ~g GA3

a

b

14,05 11,42 9,89

5,28 4,25 3,63

Gesamtcarotinoide 3,72 3,13 2,66

124

A. TI~TZund K. DS~FFLIN~:

Danach enthalten mit 0,5 ~g GA s behandelte SproBspitzen rund 16% weniger Carotinoide und etwa 19 % weniger Chlorophyll a sowie b. Nach Applikation yon 5 ~g GA s verringert sich der Pigmentgehal~ noch welter : die Carotinoide um rund 28 %, Chlorophyll a u m 30 %, Chlorophyll b u m 31%. Der Pigmentgehalt verringert sich also mit ans~eigender GAs-]V[enge, wiihrend der ABS-Gehalt sich nur bei der schwiicheren GAa-Gabe verminderte. D a r i u s muB wohl geschlossen werden, dab GA s den ABSGehalt unabh~ngig yon der Carotinoidkonzentration beeinfluBt. I m fibrigen verhal~en sich Carotinoidgehalt und ABS-Gehalt in Erbsenkeimlingen etw~ wie 50 000:1, so dab ein um 30 % verringerter Carotinoidgehalt wohl schwerlich eine nennenswerte Iter~bsetzung des ABSGehaltes zur Folge haben muB. Dnrch diesen Befund wird jedoch die Hypothese, dab ABS in vivo aus Carotinoiden gebildet werden k6nnte, nicht berfihrt.

Zusammenfassung 12 Tage alte Erbsenkeimlinge erhielten ]e 5 ~l einer w~Brigen GA aL5sung (0,05, 0,5 und 5 ~g GA3) zwischen die jfingsten BlOtter. Nach 2 und 4 Tagcn wurden die SproBspitzen und die im Wachstum nicht beeinflul~ten Sprol3basen getrennt auf ihren Gehalt an Indol-3-essigsi~ure (IES) und Abscisinsi~ure (ABS) untersucht. I n SproBspitzen yon gibberellinbehandelten Keimlingen ist ein im Vergleich zu unbehandelten Kontrollpflanzen erhShter IES-Gehalt nachweisbar, wghrend die basalen SproBteile weniger I E S enthalten. Der Abscisinsguregehalt ist dagegen in den SproBspitzen gibberellinbehandelter Keimlinge verringert, in den Basen erh5ht. Eine Abweichung yon dieser Regel ergibt sich bei Keimlingen, die 2 Tage nach Applikation der ffir das Wachstum fiberoptimalen Gibberellinmenge 5 ~g untersucht wurden. Diese enthalten in apikalen und basalen Teilen sowohl mehr I E S als auch mehr ABS im Vergleich mit Kontrollpflanzen. Gibberelhns~ure bewirkt auch eine Verminderung des Chlorophyllund Carotinoidgehaltes. Ein Zus~mmenhang zwischen der Veri~nderung des Carotinoidgehaltes und des Abscisinsi~uregehaltes wurde nicht gefunden.

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