Annales de pathologie (2013) 33, 375—385

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MISE AU POINT

Effets secondaires carcinogènes et résistances aux thérapies ciblées anti-BRAF Cellular and molecular mechanisms of carcinogenic side effects and resistance to BRAF inhibitors in metastatic melanoma with BRAFV600 mutation: State of the knowledge Mathieu Capovilla Service de pathologie, centre Franc¸ois-Baclesse, 3, avenue Général-Harris, BP 5026, 14076 Caen cedex 05, France Accepté pour publication le 4 septembre 2013 Disponible sur Internet le 31 octobre 2013

MOTS CLÉS Mélanome métastatique ; Mutation BRAFV600 ; Thérapie ciblée ; Carcinogenèse ; Résistance

Résumé Le mélanome cutané fait partie des tumeurs malignes dont le potentiel métastatique est le plus important. Si le pronostic des mélanomes traités par exérèse précoce est favorable, le pronostic des mélanomes métastatiques reste sombre. L’essor de la caractérisation moléculaire des cancers, avec notamment la découverte des mutations du gène BRAF dans le mélanome métastatique, a permis le développement récent de thérapies ciblées inhibant spécifiquement la protéine BRAF mutée. Ces thérapies ciblées, ayant fait l’objet de plusieurs essais cliniques aux résultats favorables, constituent actuellement un espoir pour les patients. Cependant, la modulation pharmacologique de la voie de transduction du signal par les MAP kinases est à l’origine d’effets secondaires notamment carcinologiques paradoxaux cliniquement potentiellement délétères. L’efficacité de ces nouvelles thérapies ciblées est également limitée par l’apparition quasi inéluctable de résistances secondaires après une phase initiale de réponse tumorale. Les mécanismes cellulaires et moléculaires de ces toxicités et de ces résistances aux thérapies ciblées anti-BRAF restent mal connus et font actuellement l’objet de nombreux travaux de recherche fondamentale et clinique dans le but d’améliorer le confort et la survie des patients. Cette mise au point correspond à une revue de la littérature concernant les mécanismes de survenue de ces effets indésirables carcinologiques et des résistances cellulaires aux thérapies ciblées anti-BRAF, dépendants majoritairement de la modulation pharmacologique des voies de signalisation cellulaire impliquées dans la mélanomagenèse. © 2013 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés

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KEYWORDS Metastatic melanoma; BRAFV600 mutation; Targeted therapy; Carcinogenesis; Resistance

M. Capovilla

Summary Cutaneous melanoma is a malignant tumor with a high metastatic potential. If an early treatment is associated with a favorable outcome, the prognosis of metastatic melanoma remains poor. Advances in molecular characterization of cancers, notably the discovery of BRAF gene mutations in metastatic melanoma, allowed to the recent development of targeted therapies against mutated BRAF protein. Despite high tumor response rates observed in clinical trials, these new drugs are associated with frequent secondary tumor resistance occurrence and paradoxical carcinogenic side effects. The cellular and molecular mechanisms of these carcinogenic side effects and secondary resistance are not yet fully elucidated and are actually intensely studied. This review of the literature focus on the mechanisms of these carcinogenic side effects and on the tumor resistance associated with anti-BRAF targeted therapies. © 2013 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

Le mélanome est une tumeur maligne cutanéo-muqueuse dérivée des mélanocytes issus embryologiquement des crêtes neurales. L’histoire naturelle et le pronostic dépendent de multiples critères histologiques, notamment de l’épaisseur de l’envahissement tumoral selon Breslow. Si l’évolution des mélanomes cutanés traités par exérèse précoce est favorable, le pronostic des mélanomes au stade métastatique est sombre avec seulement 30 % de survie à un an. L’essor de la caractérisation moléculaire des cancers associé au développement de la recherche pharmaceutique a permis la synthèse de molécules inhibant les enzymes cellulaires dérégulées lors de la tumorogenèse et ciblant spécifiquement les cellules tumorales, à l’origine du concept de thérapie ciblée. Les mélanomes métastatiques présentant fréquemment des mutations du gène BRAF, le développement récent d’inhibiteurs spécifiques ayant fait l’objet d’essais cliniques de phases 1 à 3 constitue actuellement un grand intérêt médico-scientifique et un espoir pour les patients. Ces thérapies ciblées ont montré un potentiel d’amélioration de la survie sans progression et de la survie globale par rapport aux traitements classiques antérieurs dans les essais de phase 3. Ces traitements présentent cependant des limites du fait de la survenue d’effets indésirables cutanés notamment carcinologiques, d’une réponse tumorale majoritairement partielle, de l’existence de résistances innées et de la survenue quasi inéluctable de résistances secondaires se traduisant par une durée de réponse moyenne de 6,7 mois. Ces mécanismes de résistance secondaire font actuellement l’objet de nombreuses études fondamentales dans le but de proposer des alternatives thérapeutiques aux patients dont les tumeurs sont en échappement. Cette mise au point correspond à une revue de la littérature concernant les mécanismes de survenue des effets indésirables carcinologiques et de résistance cellulaire aux thérapies ciblées anti-BRAF, dépendants majoritairement de la modulation pharmacologique des voies de signalisation cellulaire impliquées dans la mélanomagenèse.

BRAF et mélanome La mise en évidence de mutations du gène BRAF dans le mélanome résulte de l’étude génétique somatique réalisée par l’équipe de l’institut Sanger en 2002 à partir de lignées cellulaires tumorales et d’échantillons tumoraux [1,2]. RAF est une sérine/thréonine kinase régulée par RAS comportant 3 isoformes (ARAF, BRAF et CRAF) codés par

3 gènes. Environ 30 mutations de BRAF ont été identifiées mais la plus fréquente, représentant 90 % des cas, implique une transversion T→A en position 1799 du gène aboutissant au niveau protéique à la substitution d’une valine par un acide glutamique en position 600 (V600E) [3]. Ces mutations entraînent une modification conformationnelle du domaine d’activation kinase conférant à la protéine anormale une activité kinase constitutive augmentée, responsable de l’activation dérégulée de la voie de signalisation RAS-RAF-MEK-ERK (MAP kinases) stimulant la transformation de mélanocytes immortalisés in vitro [4,5] (Fig. 1).

Figure 1. Voie des MAP kinases. La voie des MAPK, activée par la liaison d’un facteur de croissance à son récepteur membranaire, est constituée d’une cascade de trois kinases (RAF, MEK et ERK) physiologiquement régulée par RAS (voie de gauche). En présence d’une mutation de BRAF, la voie des MAPK est constitutivement et fortement activée indépendamment de RAS (voie centrale). Le ciblage de la protéine BRAF mutée par le vémurafénib permet l’inhibition de la voie de transduction (voie de droite). R-TK : récepteur à activité tyrosine kinase ; MAPK : mitogen-activated protein kinase ; MEK : mitogen-extracellular-signal regulated kinase ; ERK : extracellular signal-regulated kinase. MAP kinase pathway. The MAPK pathway, activated upon ligation of tyrosine kinases receptors, consists of a 3-kinases cascade (RAF, MEK and ERK) physiologically regulated by RAS (left pathway). The occurrence of a BRAF mutation constitutively activates the MAPK pathway independently of RAS requirement (middle pathway). Targeting mutated BRAF protein with vemurafenib inhibits the MAPK pathway (right pathway).

Effets secondaires carcinogènes et résistances aux thérapies ciblées anti-BRAF La fréquence estimée des mutations de BRAF serait de 33 à 47 % des mélanomes primitifs et de 41 à 55 % des mélanomes métastatiques [6]. Une étude par CGH-array des différents types clinico-pathologiques de mélanomes a montré que les mutations de BRAF étaient plus fréquentes dans les mélanomes développés sur zones avec exposition solaire intermittente [7]. Les mélanomes primitifs BRAF mutés présenteraient des caractéristiques anatomo-cliniques particulières dont un jeune âge au diagnostic, l’absence de dommages actiniques, un nombre élevé de nævi mélanocytaires et des spécificités histologiques (mélanocytes épithélioïdes, charge mélanique importante et nombreuses ascensions pagétoïdes) [6]. La mutation BRAFV600E semble représenter environ 80 % des cas de mélanomes BRAF mutés selon les séries [3]. Cette mutation BRAFV600E semble également présente dans plus de 80 % des nævi mélanocytaires acquis, suggérant que cette anomalie et l’activation de la voie des MAP kinases constitueraient une étape précoce critique dans l’initiation de la néoplasie mélanocytaire [8]. Cependant, l’expression de BRAFV600E dans les cellules næviques bénignes aboutit à leur sénescence [9], suggérant que la présence d’une mutation BRAFV600E serait insuffisante pour l’induction de mélanomes. La transformation des mélanocytes nécessiterait des modifications génétiques et/ou épigénétiques additionnelles à la mutation BRAFV600E , telles qu’une inactivation des gènes CDKN2A et PTEN ou une activation et/ou une amplification des gènes NRAS, KIT, CCND1, CDK4 et MITF [7,10—13]. Les nouvelles techniques de séquenc ¸age génomique pourraient permettre l’identification de nouvelles mutations géniques améliorant la compréhension des mécanismes de la néoplasie mélanocytaire et pouvant éventuellement constituer des cibles thérapeutiques ultérieures [14]. Plusieurs travaux ont soulevé l’hypothèse d’une hétérogénéité tumorale à type de polyclonalité des mutations de BRAF dans les nævi mélanocytaires acquis [15] et dans les mélanomes primitifs [10] et métastatiques [16]. Les mélanomes pourraient ainsi être constitués d’un mélange de sous-populations cellulaires BRAF sauvages et BRAF mutées, chacune ayant une capacité d’évolution métastatique. Cette hétérogénéité intratumorale et entre les différents sites métastatiques pourrait nécessiter, de fac ¸on similaire au modèle du cancer du sein, l’analyse de l’ADN tumoral circulant provenant de la globalité des sites tumoraux afin de détecter des cibles éventuelles et adapter la prescription de thérapies ciblées adaptées [17]. L’ensemble de ces constatations et hypothèses nécessite cependant confirmation et analyses complémentaires avant d’être validées en pratique clinique. Les méthodes de référence de détection des mutations du gène BRAF restent des techniques de biologie moléculaire. Cependant, la mise au point récente d’un anticorps spécifique de la protéine BRAFV600E (clone VE1, Spring Bioscience® ) pourrait représenter à court terme une alternative intéressante pour la mise en évidence de cette mutation par technique d’immuno-histochimie standard [18,19] (Fig. 2). Si le pronostic des mélanomes traités précocement est favorable, le mélanome en phase métastatique est une maladie agressive au pronostic sombre avec seulement 33 % de survie à 1 an en raison de l’inefficacité des traitements « classiques » de type interleukine 2 et dacarbazine. L’immunothérapie par anticorps anti CTLA-4 (ipililumab), approuvée en 2011 aux États-Unis, a été le premier traitement à démontrer une prolongation significative de la

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Figure 2. Mélanome avec mutation BRAFV600E : marquage immuno-histochimique avec l’anticorps anti-BRAFV600E (clone VE1, Spring Bioscience® ) : seules les cellules tumorales sont intensément marquées (obj × 20) (iconographie du service de pathologie du CHU de Rouen). Melanoma with BRAF V600E mutation: immunohistochemical staining with anti-BRAFV600E antibody (clone VE1, Spring Bioscience® ): only tumor cells are intensely labeled (obj × 20). (courtesy of the pathology department of Rouen university hospital).

survie [20]. L’observation de la fréquence élevée des mutations de BRAF dans les mélanomes métastatiques a été à l’origine d’essais cliniques testant des inhibiteurs de RAF à large spectre, notamment le sorafénib [21—23]. Ces premiers essais ayant été décevants, de nouvelles molécules ciblant plus spécifiquement la protéine BRAF mutée, dont le chef de file est le PLX4032/vémurafénib/Zelboraf® , ont été développées. Cette nouvelle thérapie ciblée a obtenu l’AMM en France en 2012 pour le traitement des mélanomes métastatiques avec mutation BRAFV600 après publication des résultats d’essais thérapeutiques de phases 1 à 3 très favorables en comparaison aux traitements classiques [24—28].

Effets secondaires carcinologiques des molécules anti-BRAFV600E Un effet inattendu des molécules anti-BRAFV600E consiste en l’activation paradoxale de la voie des MAP kinases en présence d’une mutation de RAS. Partant du fait que la protéine mutée BRAFV600E tend à l’homodimérisation et que l’activité de ce dimère est inhibée par les molécules anti-BRAFV600E , plusieurs modèles ont été proposés pour expliquer ce phénomène (Fig. 3). L’un de ces modèles serait qu’en présence d’une mutation oncogénique de RAS surajoutée à la mutation BRAFV600 , la protéine BRAFV600E liée à l’inhibiteur formerait un hétérodimère avec CRAF. La transduction du signal serait alors médiée par CRAF via la protéine RAS mutée malgré la liaison de la protéine BRAFV600E à son inhibiteur. Un autre modèle serait qu’en présence d’une mutation oncogénique de RAS isolée, le signal médié par la protéine RAS mutée soit préférentiellement transmis via CRAF. Les molécules anti-BRAFV600 se lieraient à la protéine BRAF sauvage maintenue dans un état conformationnel inactif au niveau du cytoplasme, favorisant son recrutement à la membrane plasmique où elle agirait comme cofacteur de transactivation du signal par CRAF [29,30]. Ces deux modèles ont en commun le fait que l’activation paradoxale de la voie des MAP kinases (responsable d’effets indésirables et de résistances au traitement) serait principalement médiée par CRAF.

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Figure 3. En présence d’une mutation isolée de RAS, la voie des MAPK serait activée principalement par CRAF (voie de gauche). Deux modèles sont proposés pour expliquer l’activation paradoxale de la voie des MAPK dans les cellules RAS mutées exposées au vémurafénib. Dans les cellules avec mutation de BRAF, la liaison de la protéine BRAF mutée et de l’inhibiteur à CRAF permettrait la transactivation de CRAF (voie centrale). Dans les cellules sans mutation de BRAF, la liaison de l’inhibiteur à la protéine BRAF native permettrait son recrutement au complexe RAS muté-CRAF et favoriserait la transactivation de CRAF (voie de droite). Signalling occurs predominantly through CRAF with the occurrence of an isolated RAS mutation (left pathway). Two models are proposed to explain the paradoxical activation of MAPK in RAS mutant cells exposed to vemurafenib. When BRAF and RAS are mutated, the binding of both CRAF and inhibited BRAF may result in transactivation of CRAF (middle pathway). When BRAF is not mutated, binding of vemurafenib to native BRAF may recruit it to the RAS—CRAF complex, where it acts as a scaffold for CRAF transactivation resulting in the activation of MAPK signalling (right pathway).

Carcinomes épidermoïdes/kératoacanthomes cutanés

M. Capovilla Des expériences de mutagenèse cutanée sur un modèle murin ont révélé que les thérapies anti-BRAFV600 seraient insuffisantes pour agir comme agent carcinogène et initier la promotion tumorale mais accélèreraient la progression de lésions tumorales pré-cliniques. Cet effet accélérateur sur la progression tumorale des molécules anti-BRAFV600 se manifesterait donc consécutivement aux altérations induites par d’autres facteurs pro-carcinogènes et impliquerait l’activation de la voie des MAP kinases du fait de l’effet inhibiteur des molécules anti-MEK. Ce modèle de toxicité est paradoxal par le fait qu’il représente l’effet opposé au bénéfice attendu d’une thérapie ciblée [37]. Les carcinomes épidermoïdes cutanés induits semblent dans tous les cas bien différenciés, ne récidivant pas après exérèse chirurgicale et n’ayant pas montré d’extension métastatique, témoignant vraisemblablement d’un faible potentiel évolutif. Il existerait également des observations de régression tumorale spontanée à l’arrêt du traitement ciblé, pouvant résulter d’une induction de la sénescence cellulaire ou du développement d’une réponse immunitaire spécifique. L’accélération du développement de ces tumeurs épithéliales cutanées par les traitements anti-BRAFV600 pose la question de leur potentiel pro-oncogénique éventuel sur d’autres types tumoraux en particulier des organes profonds, RAS étant reconnu muté dans environ 30 % des cancers et au niveau de nombreuses lésions pré-néoplasiques notamment les adénomes colorectaux. Ces éventuelles progressions de cancers des organes profonds pourraient ne pas avoir été détectées du fait de la faible durée de traitement dans les études (6 à 9 mois) pouvant être insuffisante à leur manifestation. Ces lésions pourraient également éventuellement avoir été confondues avec une réévolution ou une progression du mélanome sous traitement du fait de l’absence de données concernant d’éventuelles vérifications anatomiques des patients décédés au cours des essais cliniques.

Tumeurs mélaniques Les thérapies ciblées ont globalement en commun l’apparition d’une toxicité cutanée majoritairement bénigne (photosensibilité, rash maculo-papuleux hyperkératosiques, érythro-dysesthésie palmo-plantaire dans le cas des anti-BRAFV600 ) [31—35]. Les thérapies ciblées anti-BRAFV600 entraînent l’apparition de carcinomes épidermoïdes cutanés chez 15 à 30 % des patients après 8 à 12 semaines (au plus tôt après 3 semaines) de traitement. Ces observations ont abouti au concept qu’une thérapie ciblée bloquant une voie oncogénique dans un type cellulaire tumoral peut promouvoir la tumorogenèse dans un autre type cellulaire par activation paradoxale de la voie des MAP kinases dans des cellules BRAF sauvages avec RAS muté et/ou activé. Des mutations activatrices de RAS probablement induites par l’exposition aux rayonnements ultraviolets ayant été décrites dans les kératoses actiniques [36], une thérapie ciblée anti-BRAFV600 pourrait accélérer la progression de ces lésions pré-néoplasiques en carcinome épidermoïde. Deux études de génotypage de carcinomes épidermoïdes cutanés ont montré une sur représentation des mutations de HRAS dans les cas survenus sous thérapie ciblée antiBRAFV600 [33,37]. Cette sur représentation des mutations de HRAS chez les patients traités par anti-BRAFV600 pourrait confirmer cet effet pro-prolifératif de la thérapie ciblée sur les kératinocytes RAS mutés dans un contexte d’exposition solaire chronique.

Les effets des thérapies anti-BRAFV600 sur les lésions mélaniques pré-existantes ou leur potentiel d’induction de nouvelles lésions ont été récemment décrits. Une étude clinique a rapporté des modifications variées de l’apparence de nævi mélanocytaires à type d’involution, d’augmentation de taille et de pigmentation (induisant un aspect clinique « atypique ») et d’apparition de multiples nouveaux nævi [38]. Plusieurs études décrivant le suivi dermatologique de patients traités pour mélanome métastatique rapportent la survenue de lésions mélaniques diagnostiquées histologiquement comme des nævi mélanocytaires dysplasiques ou des mélanomes précoces [39—41]. Ces lésions mélaniques semblent apparaître entre 4 et 12 semaines de traitement en moyenne et surviendraient préférentiellement sur des sites d’exposition solaire importante. Toutes les lésions étudiées génétiquement étaient BRAF sauvages à l’inverse de nævi mélanocytaires témoins prélevés chez des patients non exposés aux molécules anti-BRAFV600 . L’absence de mutation de BRAF dans ces lésions mélaniques secondaires pourrait conforter l’hypothèse d’un modèle de prolifération induite par une activation paradoxale de la voie des MAP kinases par les molécules anti-BRAFV600 dans des cellules næviques présentant un évènement génétique associé non déterminé. La fréquence d’apparition ou de modification de lésions mélaniques est mal connue mais serait 10 fois moins

Effets secondaires carcinogènes et résistances aux thérapies ciblées anti-BRAF importante que la fréquence de survenue de carcinomes épidermoïdes cutanés selon les statistiques des centres investigateurs [40]. Cependant, les lésions mélanocytaires étant de diagnostic clinique plus difficile que les carcinomes cutanés, leur fréquence pourrait être sous-estimée. Une surveillance dermatologique attentive et régulière dont un examen en dermoscopie serait donc à envisager chez les patients exposés aux traitements anti-BRAFV600 [34].

Leucémie Un cas clinique récent a rapporté le dossier d’un patient traité par vémurafénib pour un mélanome métastatique BRAFV600K ayant présenté une progression accélérée d’une leucémie myélomonocytaire chronique NRAS mutée (mutation G12R) probablement préexistante mais infraclinique [42]. Le vémurafénib aurait entraîné dans ce cas un effet discordant associant une réponse radiologique sur les lésions de mélanome et une augmentation rapide de la leucocytose sanguine réversible à l’arrêt du traitement. Ce patient a été traité par des doses de maintenance de vémurafénib interrompues de fac ¸on séquentielle lorsque la leucocytose atteignait 100 000/mm3 . L’hypothèse d’un effet bénéfique d’un anti-MEK n’a pu être vérifiée cliniquement en raison de l’indisponibilité de ce type de traitement lors de la prise en charge de ce patient.

Conséquences et perspectives L’indication de traitement par thérapie ciblée antiBRAFV600 nécessite en premier lieu une sélection rigoureuse des patients candidats par la mise en évidence d’une mutation BRAFV600 au niveau de la tumeur cible. Les effets secondaires carcinologiques inattendus des molécules antiBRAFV600 , induisant la survenue précoce et accélérée de cancers (notamment cutanés épithéliaux), pose la question de l’indication de tels traitements chez les patients ayant un antécédent ou des facteurs de risque de néoplasie associée à une mutation ou une activation de RAS et justifie une surveillance clinique et biologique attentive au cours du traitement. La réalisation de biopsies itératives de masses tumorales évolutives accessibles afin de vérifier la persistance de la mutation cible afin d’adapter la thérapeutique est également une attitude envisageable. Ces biopsies itératives pourraient être remplacées par le développement de techniques d’analyse de l’ADN tumoral circulant, cliniquement moins invasives. Il est à noter que les tumeurs induites par ces thérapies ciblées apparaissent dans les semaines voire les jours suivant l’introduction du traitement en comparaison aux chimiothérapies classiques dont les effets carcinogènes se manifestent, en général, des années ou des décennies après le traitement [43]. Ces effets indésirables pro-néoplasiques pourraient être évités par le développement d’une nouvelle génération de molécules anti-BRAFV600 dépourvue de la propriété d’activation paradoxale de la voie des MAP kinases dans les cellules BRAF sauvages/RAS mutées.

Mécanismes de résistance aux molécules anti-BRAFV600 L’ère actuelle des thérapies ciblées fait face à des problématiques semblables à celles rencontrées dans les chimiothérapies classiques. En effet, les cellules tumorales exposées à une thérapie ciblée acquièrent fréquemment rapidement

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une résistance au traitement, limitant l’efficacité thérapeutique. Ces mécanismes de résistance tendent à aboutir à l’engagement de signaux de survie redondants à ceux transmis par la voie ciblée. Les résistances aux thérapies ciblées sont souvent liées à l’acquisition de mutations géniques secondaires au niveau de la région codant le domaine catalytique entraînant une impossibilité stérique de liaison à l’inhibiteur aboutissant au maintien ou à l’augmentation de l’activité kinase (cas des protéines ABL, KIT, PDGFRA, EGFR et ALK). Ces mutations secondaires peuvent également survenir soit à un niveau adjacent au site catalytique (augmentant alors l’affinité pour l’ATP malgré la présence de l’inhibiteur) soit au niveau d’un domaine déstabilisant la conformation inactive de la protéine. Un autre mécanisme de résistance consiste en une amplification génique aboutissant à une augmentation du nombre de protéines actives (cas de BCR-ABL, KIT et EGFR). D’autres mécanismes consistent en des altérations génétiques en amont de la voie ciblée (mutation de NRAS pour la voie des MAPK) ou en l’activation de voies de signalisation alternes (récepteurs MET et IGF-1R␤ activant la voie PI3 K/AKT/mTOR) [44]. Les mécanismes de résistance acquise aux thérapies anti-BRAFV600 ne semblent pas en rapport avec une mutation secondaire de la protéine BRAFV600E mais avec l’activation de mécanismes moléculaires réactivant les différentes voies des MAP kinases et/ou la mise en œuvre de mécanismes de survie cellulaire alternes telle la voie PI3 K/AKT/mTOR [45,46] (Fig. 4). Une autre problématique concerne la résistance intrinsèque aux traitements anti-BRAFV600 , les essais cliniques validés rapportant environ 20 % de patients non répondeurs selon les critères RECIST [24,47].

Mécanismes de résistance secondaire Mutations activatrices de NRAS L’acquisition par les cellules tumorales BRAFV600E d’une mutation oncogénique de NRAS permettrait une réactivation de la voie des MAP kinases via CRAF en présence de la protéine chaperonne SHOC2 et d’inhibiteurs de BRAFV600 . Certaines études ont mis en évidence ces mutations de NRAS dans des échantillons tumoraux prélevés après traitement alors que les tumeurs initiales étaient NRAS sauvages. Les hypothèses de l’acquisition secondaire d’une mutation RAS ou de l’existence initiale de sous-populations tumorales minoritaires doublement mutées RAS et BRAF (les mutations RAS et BRAF étant habituellement mutuellement exclusives) sont controversées. La preuve de l’existence de ces populations tumorales doublement mutées RAS et BRAF serait importante sur le plan thérapeutique en raison du risque d’évolution rapide de telles lignées lors de l’induction du traitement anti-BRAFV600E [30,48—54].

Augmentation de l’expression de BRAFV600E par amplification génique Une étude de deux lignées cellulaires de cancer colorectal BRAFV600E résistantes aux traitements anti-MEK et anti-BRAF a identifié une augmentation de l’expression de la protéine BRAFV600E résultant d’une amplification sélective de l’ordre de 10 à 25 copies de l’allèle muté du gène BRAF [55]. Cette amplification de BRAFV600E , mise en évidence par FISH, a ensuite été observée dans des sous-populations tumorales minoritaires (représentant 3 à 4 % des cellules) au niveau des lignées cellulaires parentales et d’un cas de cancer colorectal naïfs de traitement. Au niveau des lignées

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Figure 4. Mécanismes hypothétiques de résistance acquise au vémurafénib. 1 : mutations de RAS ; 2 : amplification de BRAFV600 : 3 : variants d’épissage de BRAFV600 ; 4 : amplification de CRAF ; 5 : mutations activatrices de MEK ; 6 : activation de récepteurs à tyrosine kinase (PDGFR␤, IGF-1R, FGFR3) et de la voie PI3 K/AKT/mTOR ; 7 : réactivation d’ERK par COT (Cancer Osaka Thyroid kinase) ; 8 : modifications chromatiniennes épigénétiques ; 9 : sécrétion d’HGF par les cellules stromales ; 10 : modulations du système immunitaire. Hypothetical mechanisms of acquired vemurafenib resistance. 1: RAS mutations; 2: amplification of BRAFV600 ; 3: splice variants of BRAFV600 ; 4: amplification of CRAF; 5: MEK activating mutations; 6: tyrosine kinase receptors (PDGFR␤, IGF-1R, FGFR3) and PI3 K/AKT/mTOR pathway activation; 7: ERK reactivation by COT (Cancer Osaka Thyroid kinase); 8: epigenetic chromatin modifications; 9: HGF secretion by stromal cells; 10: immune system modulation.

cellulaires, l’augmentation d’expression de BRAFV600E aboutit à une hyperactivation de MEK et d’ERK responsable d’une limitation de l’effet des traitements anti MEK ; cette activité thérapeutique est en revanche restaurée par l’introduction d’un cotraitement par anti-BRAFV600 à faible dose, suggérant qu’une telle association thérapeutique pourrait permettre de prévenir le développement de ce type de résistance [55]. Une autre étude a rapporté des gains de matériel génétique correspondant à la région du gène BRAFV600E dans les tumeurs de 4 patients atteints de mélanomes devenus résistants au vémurafénib. Ces amplifications de BRAFV600E variaient d’un facteur 2 à 14 par rapport aux tumeurs naïves correspondantes en analyse par séquenc ¸age massif d’exons et RT-PCR quantitative [56]. Au contraire de la résistance liée à une mutation de NRAS, le mécanisme de résistance lié à l’amplification de BRAFV600E serait indépendant de CRAF et correspondrait à une accumulation de la protéine BRAFV600E pouvant théoriquement être saturée par une escalade de dose d’anti-BRAFV600 et inhibée par un anti-MEK (type AZD6244/sélumétinib).

Variants d’épissage de BRAFV600E Une étude portant sur des lignées cellulaires résistantes au vémurafénib générées à partir d’un mélanome BRAFV600E a montré la présence de variants de la protéine BRAFV600E caractérisés par un poids moléculaire plus faible [57]. À l’électrophorèse des protéines, ces lignées résistantes présentaient une bande supplémentaire à 61 kDa (p61 BRAFV600E ) en plus de la bande à 90 kDa correspondant à la protéine BRAFV600E native de la souche parentale. Ces variants, caractérisés par une perte des régions codées par les exons 4 à 8 (comportant notamment le domaine de liaison

à RAS), présenteraient un taux de dimérisation important en présence de bas niveaux d’activité de RAS, responsable d’une activation d’ERK résistante aux anti-BRAFV600 . L’analyse ultérieure de mélanomes de 19 patients présentant une résistance acquise aux anti-BRAFV600 montrait la présence de variants d’épissage dans 6 tumeurs (correspondant à des délétions des exons 4 à 10, 4 à 8, 2 à 8 et 2 à 10). L’analyse des souches tumorales naïves de traitement correspondantes n’ont pas permis de mettre en évidence ces variants de BRAFV600E , n’excluant cependant pas la présence de clones minoritaires pré-existants non détectables par les techniques usuelles. Ces variants d’épissage semblent conserver le cadre de lecture et intéressent l’allèle BRAF muté, suggérant une modification épigénétique affectant spécifiquement l’épissage des ARNm BRAFV600E sans perte de fidélité globale des mécanismes d’épissage [57]. Les tumeurs avec ce mécanisme de résistance pourraient conserver une sensibilité aux anti-MEK.

Augmentation de l’expression de CRAF L’étude in vitro d’une lignée cellulaire de mélanome BRAFV600E devenue résistante à un inhibiteur de RAF (AZ628) a montré une réactivation d’ERK médiée par une augmentation de l’expression de CRAF [58]. Cette hyper expression de CRAF semble liée à des mécanismes de régulation posttranscriptionnelle étant donné l’absence d’amplification du gène CRAF détectable par FISH et d’augmentation de la transcription des ARNm CRAF détectable par RT-PCR quantitative. Ce mécanisme de résistance pourrait être présent au niveau de tumeurs naïves de traitement sous la forme de sous-populations minoritaires représentant de l’ordre

Effets secondaires carcinogènes et résistances aux thérapies ciblées anti-BRAF de 1/10 000e de la population tumorale initiale. Ces souspopulations cellulaires seraient en revanche sensibles à la tanespimycine, un dérivé de la geldanamycine inhibant la protéine chaperon HSP90 agissant par activation de la dégradation de CRAF et constituant une éventuelle future voie thérapeutique.

Mutations activatrices de MEK Les mutations activatrices de MEK seraient peu fréquentes dans le mélanome ; des mutations d’ERK n’ayant quant à elles pas été identifiées. Une analyse par séquenc ¸age massif des exons de 138 oncogènes et anti-oncogènes des échantillons d’un mélanome initialement répondeur puis réfractaire à 4 mois au traitement par anti-BRAFV600 a mis en évidence la présence d’une mutation C121S du gène MEK1 [44]. Cette mutation, soit acquise secondairement soit présente à un niveau indétectable dans la tumeur initiale, confèrerait une résistance aux traitements anti-BRAFV600 et anti-MEK en cours de développement. La détection de telles mutations pourrait nécessiter l’établissement d’un profil génomique tumoral exhaustif avant de débuter un traitement ciblé adapté aux anomalies moléculaires présentes [44,59].

Activation de récepteurs tyrosine kinase (PDGFR␤, IGF-1R, FGFR3) et de la voie de signalisation PI3 K/AKT/mTOR Les mélanomes sont initialement dépendants de la voie des MAP kinases pour la survie et la croissance cellulaire. Le traitement par anti-BRAFV600 semble induire l’apparition de résistances par un mécanisme d’activation alterne de la voie PI3 K/AKT/mTOR en aval des récepteurs au PDGF␤ et à l’IGF1 [49,60] ou par une réactivation de la voie des MAP kinases en aval du récepteur au FGF [61]. L’activation de la voie de signalisation PI3 K/AKT/mTOR favoriserait la survie cellulaire en coopération avec la voie des MAP kinases, réactivée par recrutement de CRAF [49,60]. Le contournement de ce mécanisme de résistance nécessiterait de cibler les différentes voies de signalisation (MAP kinases et PI3 K/AKT/mTOR) par des thérapies ciblées combinées.

Réactivation d’ERK médiée par COT (Cancer Osaka Thyroid kinase) La protéine COT (MAP3K8) est une sérine/thréonine kinase semblable à CRAF activant ERK par une voie dépendante de MEK mais indépendamment de RAS et RAF à l’état cellulaire de base. La protéine BRAFV600E semble agir comme antagoniste de l’expression de COT par altération de la stabilité protéique ; de ce fait, un traitement par anti-BRAFV600E potentialiserait la prolifération de cellules tumorales exprimant COT. Des expériences sur lignées cellulaires ont démontré que l’expression de COT pouvait conférer une résistance de novo aux anti-BRAFV600E [62]. Le ciblage spécifique de COT et/ou de MEK pourrait supprimer l’activation de la voie MEK/ERK dans les cellules tumorales exprimant COT.

Modifications chromatiniennes épigénétiques et concept de cellules souches Des études in vitro récentes ont identifié la présence, au sein de la masse de cellules tumorales constituant un mélanome, de sous-populations mélanocytaires caractérisées par un temps de cycle cellulaire lent, une

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faible croissance, une importante capacité d’adaptation à l’environnement et un développement de résistances aux traitements [51,63]. Cette croissance cellulaire lente rendrait ces cellules tumorales insensibles aux chimiothérapies du fait de l’absence d’entrée en cycle cellulaire et d’une résistance à l’apoptose [64,65]. Cet état de tolérance aux traitements, transitoire et réversible, serait induit par des mécanismes épigénétiques modifiant la structure chromatinienne. Ces modifications chromatiniennes épigénétiques seraient médiées par l’expression et l’activité d’histone déméthylases de type JARID1A/B caractérisant phénotypiquement ces sous-populations cellulaires résistantes [66]. JARID1B est un membre de la famille hautement conservée des jumonji/ARID1 (JARID1) histone 3K4 (H3K4) déméthylases impliquées dans le développement embryonnaire, la biologie des cellules souches et le cancer. Cette protéine, agissant comme régulateur transcriptionnel, est exprimée à l’état normal dans les tissus présentant un fort taux de renouvellement (moelle osseuse, tubes séminifères du testicule). Son expression dans les cellules embryonnaires aboutit au blocage de la différenciation terminale par l’intermédiaire de la déméthylation des histones H3K4. JARID1B appartiendrait à un complexe multimoléculaire comportant les molécules d’ADN, les histones, des facteurs de transcription (de type PAX9 et FOXG1B) et pRb qui serait stabilisée sous une forme hypophosphorylée, aboutissant à un mécanisme anti-oncogénique par ralentissement du cycle cellulaire. La protéine JARID1B est fortement exprimée dans les nævi mélanocytaires (caractérisés par une sénescence cellulaire) et serait exprimée dans 5 à 10 % des cellules tumorales constituant un mélanome. Cette hétérogénéité tumorale en rapport avec un mécanisme épigénétique actif lors du développement embryonnaire pourrait représenter un modèle dynamique de transition phénotypique continue constituant une sous-population cellulaire de maintenance équivalente aux cellules souches. Ce concept dynamique expliquerait le potentiel tumorigène de chaque cellule constituant un mélanome dans les modèles de xénogreffes, au contraire du concept de cellule souche unidirectionnelle développé dans le cancer du sein où seules les cellules souches sont capables d’initiation tumorale. Ces mécanismes dynamiques régulant la structure chromatinienne pourraient ainsi expliquer la dualité des effets anti-prolifératif immédiat et de maintenance à long terme (avec apparition de résistance aux traitements) et les constatations cliniques de récupération d’une activité de thérapies ciblées devenues inefficaces après réalisation d’une pause thérapeutique [65]. En raison de la dynamique de ces sous-populations cellulaires comparables aux cellules souches embryonnaires, la résistance aux thérapies ciblées pourrait survenir de fac ¸on instantanée (dès la première exposition) plutôt que par évolution progressive comme observée avec des chimiothérapies classiques. Une étude a montré l’effet négatif de molécules inhibitrices de la dihydroorotate déhydrogénase (DHODH) de type léflunomide sur la transcription des gènes impliqués dans le développement des crêtes neurales (sur un modèle de poisson zèbre) et la croissance de lignées de mélanomes humains [67]. En l’absence de thérapeutique dirigée contre les histone déméthylases, le léflunomide (habituellement utilisé dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde) pourrait permettre de cibler ces sous-populations cellulaires constituant un compartiment de cellules souches [68] et fait actuellement l’objet d’un essai clinique de phases I/II en association avec le vémurafénib (ClinicalTrials.gov : NCT01611675).

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Sécrétion d’HGF et/ou de FGF2 par le microenvironnement tumoral La majorité des études concernant les résistances aux traitements anti-tumoraux restent focalisées sur les mécanismes intrinsèques à la cellule tumorale. Des expériences de cocultures in vitro ont montré que les résistances médiées par le stroma seraient fréquentes, comme par exemple la résistance à la gemcitabine de lignées de cancers colorectaux et pancréatiques induite par des fibroblastes dermiques ou la résistance aux thérapies ciblées anti-HER2 du cancer du sein induite par les cellules stromales [69]. La réalisation de co-cultures de cellules stromales fibroblastiques et de lignées de mélanomes résistants au vémurafénib a permis de sélectionner les populations de cellules stromales conférant une résistance au traitement [69,70]. Cette résistance apparaît médiée par la sécrétion d’HGF (Hepatocyte Growth Factor) dans le milieu extra-cellulaire par les cellules stromales. Des études immuno-histochimiques avec un anticorps anti-HGF réalisées sur des échantillons tumoraux naïfs de traitement ont montré que la réponse au vémurafénib était moins importante lorsque l’HGF était détecté dans les cellules du stroma tumoral. De plus, cet immunomarquage anti-HGF était totalement négatif sur le stroma du mélanome d’un patient ayant présenté une réponse tumorale complète au traitement. L’étude de biopsies réalisées de fac ¸on séquentielle en cours de traitement a également montré une augmentation progressive d’HGF stromal, pouvant être à l’origine de la survenue d’une résistance. Le HGF se lie au récepteur transmembranaire MET qui possède la capacité d’activer simultanément les voies MAP kinases et PI3 K/AKT/mTOR. Cette capacité d’activation simultanée de deux voies de transduction du signal semble restreinte à MET dans les lignées de mélanome étudiées. Le mécanisme exact de la sécrétion d’HGF, soit par recrutement de fibroblastes extratumoraux soit par modification des fibroblastes stromaux résidents, reste à déterminer. De fac ¸on comparable, une étude a rapporté la stimulation par le vémurafénib de la sécrétion de FGF2 par les kératinocytes et les fibroblastes stromaux [71]. Ce facteur de croissance activerait le facteur de transcription PAX3 via la voie STAT3, favorisant l’émergence de résistances aux thérapies ciblées. De fac ¸on comparable aux modifications chromatiniennes épigénétiques, ces interactions cellules tumorales—cellules stromales pourraient conférer une résistance innée aux anti-BRAFV600E en plus de leur probable implication dans la survenue de résistances acquises. Ces mécanismes de résistance pourraient être contournés par l’instauration de traitements ciblés dirigés contre le récepteur MET ou la protéine STAT3.

Rôle de l’immunité La présence d’une mutation BRAFV600E favoriserait l’échappement des cellules de mélanome au système immunitaire par diminution de la présentation des antigènes mélanocytaires aux lymphocytes T. De ce fait, les traitements par anti-BRAFV600 et anti-MEK pourraient restaurer la présentation antigénique et ainsi favoriser la réponse immunitaire anti-tumorale [72—74]. En revanche, les anti-MEK réduiraient l’activité des lymphocytes T par inhibition d’ERK dans les cellules lymphoïdes, défavorisant la réponse immunitaire anti-tumorale. Ces effets des thérapies ciblées sur le système immunitaire et la réponse anti-tumorale seraient ainsi à explorer et à prendre en

M. Capovilla compte en cas de proposition de traitement combiné avec des immunothérapies de type ipililumab (anti-CTLA-4). Ces constatations soulignent également l’index thérapeutique plus élevé des anti-BRAFV600 par rapport aux anti-MEK du fait de l’absence d’inhibition d’ERK dans les cellules non tumorales, limitant ainsi les potentiels effets indésirables [75].

Mécanismes de résistance intrinsèque Les mécanismes de résistance intrinsèque au vémurafénib sont peu connus. Ils pourraient impliquer une surexpression de la cycline D1 favorisant l’entrée en cycle cellulaire lors de l’inhibition pharmacologique de la voie des MAP kinases [11] ou l’inactivation de PTEN activant constitutivement la voie PI3 K/AKT/mTOR favorisant la surexpression de la protéine anti-apoptotique BIM (Bcl2-interacting mediator of cell death) [60,76]. Les rôles potentiels d’un compartiment de cellules souches et des interactions entre les cellules tumorales et les cellules stromales (décrits précédemment) restent à déterminer.

Conséquences et perspectives Les mécanismes de résistance intrinsèque et secondaire aux thérapies ciblées anti-BRAFV600 semblent multiples et complexes et restent mal connus in vivo malgré les nombreuses études récemment publiées. La majorité de ces mécanismes d’échappement consiste en une inefficacité à inhiber la signalisation médiée par la voie des MAP kinases et en particulier l’effecteur ERK. Le contournement de ces résistances pourrait se concevoir par une augmentation des doses prescrites (cependant limitée par la toxicité), par le développement de nouveaux inhibiteurs ou d’inhibiteurs irréversibles ou par la combinaison d’inhibiteurs ciblant plusieurs voies de signalisation et/ou associés à l’immunothérapie [77,78]. Des observations de restauration de l’activité de thérapies ciblées après une pause thérapeutique lors de l’apparition de résistances secondaires semblent montrer l’intérêt de traitements séquentiels avec instauration de fenêtres thérapeutiques [79—81] ; cette approche reste cependant limitée par la croissance tumorale potentiellement rapide lors de l’apparition de résistances aux traitements. De nouvelles perspectives de développement pharmacologique sont à envisager au niveau du contrôle des mécanismes épigénétiques, des interactions cellules tumorales—cellules stromales et de la régulation du système immunitaire. Le diagnostic, l’étude et la prise en charge des résistances à ces thérapies ciblées pourraient nécessiter en pratique des prélèvements itératifs de tissu tumoral de bonne qualité en pré-thérapeutique et lors des reprises évolutives afin d’étudier les profils génomiques des tumeurs et ainsi de déterminer les thérapeutiques les plus adaptées aux caractéristiques tumorales à un instant donné [44]. Le probable caractère hétérogène des populations cellulaires au sein des diverses localisations tumorales pourrait nécessiter à terme le développement de méthodes d’analyse de l’ADN tumoral circulant afin de déterminer les différentes mutations présentes et leur représentativité de la population tumorale globale présente chez chaque patient [17]. Enfin, la signification de la présence d’une mutation BRAFV600 dans les mélanomes reste à déterminer. Les cas BRAF mutés semblent fortement prévalents dans la population de patients métastatique et/ou jeunes et associés à une survie inférieure chez les patients métastatiques [6].

Effets secondaires carcinogènes et résistances aux thérapies ciblées anti-BRAF Il n’a pas été démontré d’association entre la présence d’une mutation BRAFV600 et la survie sans progression après la découverte du mélanome primitif mais cette constatation est controversée. La biologie tumorale des mélanomes pourrait également être dépendante d’anomalies génétiques et/ou épigénétiques associées aux mutations de BRAF restant à découvrir et/ou à valider. En l’état actuel des connaissances, la présence d’une mutation BRAFV600 ne semble donc pas être un facteur pronostique prouvé en dehors des stades métastatiques mais constituerait plutôt un potentiel facteur prédictif de réponse aux thérapies ciblées anti-BRAFV600 [82,83].

Conclusion Les développements de thérapies ciblées anti-BRAFV600 et de nouvelles immunothérapies représentent une avancée importante dans la prise en charge des patients atteints de mélanome métastatique. Le pronostic global de ces patients reste cependant défavorable en raison de l’apparition inéluctable de résistances aux traitements. L’issue critique actuelle, source de nombreux travaux de recherche, est la caractérisation de ces mécanismes de résistance intrinsèque et secondaire aux thérapies ciblées et l’élaboration de stratégies de prise en charge des échappements thérapeutiques afin d’obtenir des réponses efficaces durables sans augmenter la toxicité ni altérer la qualité de vie des patients. La stratégie actuellement envisagée pour contrer ces résistances serait une combinaison de thérapies ciblées (anti-BRAF, anti-MEK, anti-PI3 K/AKT/mTOR et agents modifiants la structure chromatinienne éventuellement associés à l’immunothérapie) déterminée selon les caractéristiques génétiques et fonctionnelles de chaque tumeur. Les toxicités, les interactions médicamenteuses ainsi que l’efficacité de telles combinaisons de traitements restent à évaluer par les différents essais cliniques actuellement ouverts. Les anticorps spécifiques de la protéine BRAFV600E permettront aux pathologistes de mettre en évidence de fac ¸on indirecte les anomalies moléculaires cibles par technique immuno-histochimique de routine et ainsi être fortement impliqués dans les indications thérapeutiques au cours de la prise en charge des patients. Ces modalités diagnostiques et thérapeutiques émergentes complexes devront nécessairement prendre en compte le contexte économique actuel du fait du coût élevé et du caractère prolongé des traitements. Ces recherches fondamentales ne doivent cependant pas dévaloriser les actions de prévention et de dépistage des mélanomes, le traitement chirurgical des lésions précoces restant actuellement la seule modalité thérapeutique potentiellement curative.

Déclaration d’intérêts L’auteur déclare ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article.

Remerciements Professeur Jean-Christophe Sabourin (CHU de Rouen) pour la relecture critique du manuscrit et la mise à disposition de la Figure 2 et à Monsieur Gilles Girault (bibliothèque médicale du centre Franc ¸ois-Baclesse) pour son aide à la recherche bibliographique.

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