Planta (Berl.) 84, 348--352 (1969)

Die Zellwandzusammensetzung von Hypokotylen des Selffkeimlings (Sinapis alba L.) bei Wachstumshemmung durch Inhibitoren oder Phytochrom A. hi. STm~.~ Botanisehes Institut der Universitgt Freiburg i. Br. Eingegangen am 11. November 1968

Cell-Wall Composition during Inhibition o] Hypocotyl Elongation in the Mustard Seedling (Sinapis alba L.) by Inhibitors or Phytochrome Summary. During inhibition of hypoeotyl elongation in the mustard seedling by actinomycin D, hydroxyproline, and continuous far-red via phytochrome 730 the synthesis of cell-wall carbohydrates is impaired in the same manner. Independent of the treatment 12 hrs after its beginning at a relative inhibition of hypocotyl elongation of 80--90 % the relative inhibition of the cell-wall carbohydrate content is uniformly about 30--35 %. No significant quantitative nor apparent qualitative differences in the sugar and uronie acid content of the pectic, hemiceltulosic, and ~-cellu]osie cell-wall fraction could be detected. EinleRung Die ttemmung des Hypokotylwachstums durch Antimetaboliten scheint im Falle yon Cycloheximid und Chloramphenicol primgr unabhgngig yon der Synthese an Zellwandkohlenhydraten zu sein. I m Falle von Hydroxyprolin und Actinomycin D hingegen wurde bei einer relariven Hypokotylhemmung yon etwa 70 % auch eine relative Hemmung der Synthese yon Zellwandkohlenhydraten yon etwa 20% gefunden. Somit konnte nicht ausgeschlossen werden, dab die Hemmung des Hypokotylwachstums in diesen F~llen auch auf einer Hemmung der Synthese nur einer bestimmten am Aufbau der Zellwand beteiligten Kohlenhydratfraktion beruhen k5nnte (ST]~I~E~, 1968b). Bei der im Dunkelrot durch Phytochrom 730 bewirkten ttemmung des ttypokotylwachstums yon 75 % wurde eberdalls eine Hemmung der Zellwandkohlenhydratsynthese yon etwa 20% gefunden. Auf Grund der dabei auftretenden kurzen lag-Phasen konnte jedoch wahrscheinlich gemacht werden, dab in diesem Fall die ttemmung der Syntheserate yon Zellwandkohlenhydraten an der ttypokotylhemmung primer nicht beteiligt ist ( S T ] ~ , 1968 a). I n der vorliegenden Arbeit soll nun durch einen Vergleich der Fraktionen der Pectine, Hemicellulose und ~-Cellulose untersucht werden, ob w~hrend

Zellwandzusammense~zung bei Wachstumshemmung

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d e r t { e m m u n g des H y p o k o t y l w a c h s t u m s d u r c h A c t i n o m y c i n D, H y d r o x y prolin u n d D u n k e l r o t die Z e l l w a n d k o h l e n h y d r a t s y n t h e s e allgemein g e h e m m t wird, o d e r a b e r ob i n n e r h a l b dieser F r a k t i o n e n U n t e r s c h i e d e a u f t r e t e n . E i n e U b e r e i n s t i m m u n g in d e r W i r k u n g s w e i s e k S n n t e als ein H i n w e i s daffir angesehen werden, dal] bei der H e m m u n g des H y p o k o t y l w a c h s t u m s letztlich die gleichen Stoffwechselprozesse w i r k s a m werden. F e r n e r k S n n t e b e i einer U b e r e i n s t i m m u n g a n g e n o m m e n werden, dal~ wahrscheinlich auch i m FaUe v o n A c t i n o m y c i n D u n d H y d r o x y p r o l i n eine I { e m m u n g der Z e l l w a n d k o h l e n h y d r a t s y n t h e s e a n d e r R e g u l a t i o n des H y p o k o t y l l i i n g e n w a c h s t u m s primiir n i c h t b e t e i l i g t ist.

Material und Methode 1. Samenmaterial und Versuchsansatz. Es wurdcn Samen der Ernte 1965 mit einem Samengewicht yon 7,5--8,0 mg verwendet. Der allgemeine Versuchsansatz auf Chromatographicpapier in Keimdosen sowie die Dunkelrot-Bestrahlungsanlage ist bei MOH~ (1966) bcschrieben, die Applikation dcr InhibRorcn bei STEI~ER (1968b). Das Versuchsprogramm war: Aussaat --> 36 Std Dunkel --> Dauer-Dunkelrot, bzw. Aussaa~ --> 36 Std Dunkel --> 1 Std Dunkelinkubation mit Actinomycin D oder Hydroxyprolin -~ Dunkel. Das verwendete Dunkelrot stellt eine geringe, aber praktiseh konst~nte Konzentration an Phytochrom 730 ein (]=IARTMANN, 1967; CLARKSON und HILL~AN, 1967). Die Auswcrtung erfo]gte 48 Std nach Aussaat. Im Versuehszcitraum ist die Zunahme pro Zeitcinheit der untersuchten Parameter konstant (S~z~ER, 1968a, b). 2. Auswertung. Bei Versuchsende wurden die Hypokotyle inklusive Plumula und Petioli der Keimlinge einer Dose bci ca. --70~ eingcfroren, homogenisiert und mit 80 % _~thanol erschSpfend extrahiert. Die stSrenden Fette im Riickstand wurden mit Ather entfernt. Sod~nn wurde der Riickstand 2real insgesamt 8 Std mit kochendem Wasser, dann 2real insgesamt 3 Std bei 60~ mit 0,5% w~6riger AmmoniumoxalatlSsung yon pH 6,4 und schlielt]ich 2mal insgesamt 24 Std mit 4 N Natronlauge bci Zimmertemperatur extrahiert. So wurde eine Fraktion mit Stirke und wasser15slichen Pectinen, eiae Fraktion yon Pectinen, eine solche yon Hemicellulose und ein unl5slicher Rticks~and aus u-Cellulose gewonncn. Die quantitative Bestimmung des GeSamtzuckergeh~lts der Fraktionen erfolgte mit Anthron nach Y~MM und WILLIS (1954), die der G~lacturons~ure mit Carbazol nach DISC~E (1947). Es sind jeweils die Meltwerte ohne Korrektur angegeben. Zur chromatographischen Analyse wurden die Pectine mit dem gleichen Volumen Aeeton und die Hemicellulose nach Neutralisierung des Extrakts mi~ Essigsiure mit 10 Volumin~ Athanol gef~llt. Die Precipitate wurden 6 Std bei 100~ in 1 N Schwefelsiure hydrolysiert. Die mit Bariumcarbonat neutralisierten ttydrolysate wurden fiber Dowex 50 W entionisiert und papierchromatographisch au~ Zucker untersucht. ]~ine genaue Besehreibung des Samenmaterials sowie der Bestimmungsmethoden erfolgte an anderem 0 r t (ST~I~n~, 1968a, b). Ergebnisse Die t t e m m u n g der H y p o k o t y l l ~ n g e sowie des Gesam~zucker- u n d G a l a c t u r o n s ~ u r e g e h a l t s d e r Zellwand des H y p o k o t y l s d u r c h A c t i n o m y c i n D, t t y d r o x y p r o l i n u n d D u n k e l r o t ist in Tabelle 1 dargestellt. D e r

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A.M. ST~I~R:

Tabelle 1..Die Hemmung des Ldingeuwachstums des Hypokotyls und die Hemmung der Akkumulation yon Kohlenhydraten der Zellwand (gemessen als Gesamtzucker- und Galacturons~iuregehalt) durch Hydroxyprolin, Actinomyci~ D und durch Phytochrom 730 im Dauer-Dunkelrot. (~ ~ 3)

Hypokotyl (36 Std Dunke1-4-12 Std) L~nge (ram)

Dunkel, 36 Std Dunkel, Kontrolle Dunkelrot, 3000 erg/cm2 see L(-)Hydroxyprolin, 100 mM Actinomycin D, 10 ~g/ml

8,9 4- 0,2 18,9 4- 0,6 10,8 4- 0,1 10,0 4- 0,I 10,4 4- 0,2

Zellwand(~g/Hypoko~yl) Zucker

Urons/iure

46,2 4- 1,6 158,5 4- 2,6 124,1 4- 4,0 114,7 ~3,2 116,4 4- 3,1

31,6 4- 1,6 100,44- 2,0 78,4 4- 2,7 76,74-5,3 82,0 4- 2,1

Zucker- und Galacturons~uregehalt der Fraktion der Pectine, Hemicellulose und ~-Cellulose ist in Tabclle 2 wiedcrgcgeben. Sowohl zwischen den einzelnen Fraktionen als auch zwischen den verschieden behandel~en Hypokotylen werden keine signifikanten Unterschiede in der relativen Hemmung des Zucker- und Galaeturons/~uregehalts gefunden. Auch in der qualitativen Zusammensetzung der Fraktionen (Tabelle 3) kSnnen keine Unterschiede zwischen den Dunkelkontrollen und den behandelten Hypokotylen beobachtet werdcn. Diskussion

Bei einer Hemmung des Hypokotylwachs~ums durch Actinomycin D, Itydroxyprolin und Dunkelrot ergeben sich in der qualibativen und quantitativen Zusammcnsetzung der Kohlenhydrate der Fraktion der Pectine, tIemicellulose und g-Cellulose keine signifikanten Unterschiede; alle Zcllwandfraktionen werden offensiehtlich in ihrem Aufbau gleichermaBen gehemmt. Damit kann ausgeschlossen werden, dab die Wachstumshemmung des Hypokotyls dutch die selektive Itemmung nur einer dieser am Zellwandaufbau beteiligten Fraktionen verursacht werden kSnnte. Weiterhin ist damit nahe[iegend anzunchmen, dab unabh/~ngig vom tcilweise noch ungekl/irten molekularen Wirkungsmeehanismus der Inhibitoren und des Phytochroms im Zusammenhang mit der Hemmung des Hypokotylwachstums letztlieh die gleiehen Stoffwechselprozesse beeinfluBt werden. Ferner kann diese Analogie in der Wirkungsweise als ein Itinweis daffir angesehen werden, dab auch im Fall yon Actinomycin D und Hydroxyprolin eine allgemcine Hemmung der Zellwandkohlenhydratsynthese primhr an der Steuerung des Hypokotylwachstums nicht beteiligt isb (vgl. STnIN~, 1968a, b). Die Daten schlieBen jedoeh

Zucker

11,44-0,7

5,7:L0,1

31,0 4- 0,5

68,3 =~ 1,8

L6sungsmitbel

Wasser (100~ C)

Ammoniumoxalat (0,5% ; pI~ 6,4; 60 ~ C)

~atronlauge (4~, 25~ C)

R/icks~and

30,0 4- 3,4

10,4 4- 0,6

30,64-0,6

7,0•

UronsEure

Actinomycin D

64,5 4- 0,7

27,0 • 0,7

4,74-0,1

1 8 , 5 i 1,7

Zucker

29,4 4- 0,3

10,9 4- 0,3

29,64-3,2

6,84-1,5

Urons~ure

L(-)-I-Iydroxyprolin

I-Iypokotyl [36 Std Dunkel 4-12 Std]

74,5 4- 2,6

30, I j : 0,9

6,8:L0,1

13,34-0,3

Zucker

Dunkelrof~

31,0 4- 1,2

10,14- 0,6

33,24-0,7

5,14-0,3

Urons/~ure

93,5 4- 1,7

39,4 4- 0,6

9,74-0,2

15,54-0,1

Zucker

Dunkel

36,8 4- 1,2

13,5 4- 0,2

44,1~0,2

6,04-0,4

Urons~ure

Tabel|e 2. Der Kohlenhydratgehalt einzelner Zellwand/raktionen. WaseerlSsliche Fraktion: S#irke und Pectine; ammoniumoxalat-15sliehe Fraktion : Peetine; natriumhydroxid-16sliche Fraktion : ttemieellulose ; unlSslicher Rest: c~-Celluloee. Die Hemmung des Hypokotylwachstums er/olgte dutch Hydroxyprolin (100 raM), Actinomycin D (10/~g/ml) und dutch Phytoehrom 730 im Dauer-Dunkelrot (3000 erg/cm~sec). (n ~ 3; Angaben: ttg/Hypokotyl)

0~

9.

0~

N

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A.M. S r ~ I ~ R : Zellwandzusammensetzungbei Wachstumshemmung

Tabelle 3. Die Zuckerzusammensetzung einzelner Zellwand/raktionen. Ein Untemchied

in der qualitative~ und quantitativen Zuckerzusammensetzumj der Zellwandhydrolysate der verschieden behandelten Hypokotyle (vgl. Tabelle 1) konnte nicht /estgestellt werden Glucose

Pectine Hemi cellulose a-Cellulose

(+) +++++ +++§

Galacrose +

++++ (+)

Mannose -

(+) -

Arabi. nose +

++ (+)

Xylose

(+) ++§ (+)

Galacturons~ure

++++§ ++ (+)

n i c h t aus, da~ bei der H e m m u n g des H y p o k o t y l w a c h s t u m s eine kleine u n d spezifisch fiir d e n A u f b a u der Z e l l w a n d s t r u k t u r v e r a n t w o r t l i c h e F r a k t i o n y o n entscheidender B e d e u t u n g sein kSnnte. tIerrn Prof. Dr. I~I.M o ~ danke ich ffir die freund]iche Durchsicht des Manuskripts. Die Arbeit wurde durch Beihflfen der Deutschen Forschungsgemeinschaft erm5glieht. Literatur

CLX~KSO~, D. T., and W. S. HILL~AN: Stability of phytochrome concentration in dicotyledonous tissues under continuous far-red light. Planta (Bcrl.) 75, 286-290 (1967). DISOHE, Z. : A new specific color reaction of hcxuronic acids. J. biol. Chem. 167, 189--198 (1947). HA~TMA~N,•. 1VL: Phytochrome 730 (Pfr.), the effector of ~he ,,high energy photomorphogenic reaction" in the far-red region. Naturwissenschaften 54, 544 (1967). Morn% It. : Untersuchungen zur phytochrominduzierten Photomorphogenese des Senfkeimlings (Sinapis alba L.). Z. Pflanzenlohysiol. 54, 63--83 (1966). STEI~E~, A. M. : Rasch ablaufende ~nderungen im Gehalt an 15slichen Zuckern und Zellwandkohlenhydraten bei der phytochrominduzierten Photomorphogenese des Senfkeimlings (Sinapis alba L.). Planta (BEE.) 82, 223--234 (1968a). - - J m d c r u n g e n im Gehalt an 15slichen Zuekern und Zellwandkohlenhydraten wiihrend der Hemmung endogenen Zellstreckungswachstums durch Antimetaboliten. Planta (Berl.) 83, 282~294 (1968b). u E. W., and A. J. WILLIS: The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone. Biochem. J. 57, 508--514 (1954). Dr. A. M. ST~IN]~R Institut ffir Botanisehe Entwleklungsphysiologie, Universit~t Hohenheim (L. H.) 7 Stuttgart-Hohenheim, Fruwirthstr. 20