BIOCHIMIE, 1978, 60, 473-478.

Anhydrases carboniques 6rythrocytaires bovines : 6tude comparde des activitds anhydrasiques et estdrasiques des diff6rentes formes.

(11-3-1978).

Laboratoire de Chimie biologique *, Facultd de M~decine, 27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseilt'e Cedex ~, France et E q u i p e de R e c h e r c h e 49 du C.N.R.S. associ~e dt rUnioersit~ d'Aix-Marseille II.

Rdsum~.

Summary.

L'6tude c o m p a r 6 e des activit6s e s t 6 r a s i q u e s (p-nitroph6nylac6tate, o-nitroph6nylac6tate) a p e r m i s de distincjuer trois q r o u p e s parrai les a n h y d r a s e s c a r b o n i q u e s 6 r y t h r o c y t a i r e s bovines : le p r e m i e r c o m p r e n d CI, CII (isoenzyme de CI) et CL (produit ~ artificiel ,, o b t e n u & p a r tit d e CI), le d e u x i ~ m e c o m p r e n d CI~ et CI~" qui sont r e s p e c t i v e m e n t les p r e m i e r s v a r i a n t s c o n f o r m a t i o n n e l s natif et ,, artificiel ,, de CI, enfin C I ~ , d e u x i 6 m e v a r i a n t conformationnel ,, artificiel ,, de CI.

C o m p a r a t i v e s t u d y of e s t e r a s e activities (pa n d o-nitrophenylacetate) a l l o w e d to characterize three q r o u p s of b o v i n e e r y t h r o c y t e carbonic anhydrases : the first o n e includes CI, CII (isozyme of CI) a n d CIr (~ artificial ,, p r o d u c t of CI), the s e c o n d o n e includes n a t i v e CI~ a n d ,, artificial ,, CI~', first c o n f o r m a t i o n a l v a r i a n t s of CL finally CIr. s e c o n d ,, artificial ,, conformational v a r i a n t of CI. Possible modifications of the e n z y m e site b e t w e e n the first a n d the other e n z y m e q r o u p s a r e discussed. Except CI~' of l o w e r activity, all the products h a v e identical carbonic a n h y d r a s e activity. The catalytic constants K~ ap a n d kent ap for hydrolysis of p - n i t r o p h e n y l a c e t a t e h a v e b e e n determ i n e d for all e n z y m e s ; this s t u d y confirms the lower activity of CI~'.

Jean-Marc GULI,AN , Dominique FAURE, Jean BUC et Michel CHARREL.

Les modifications 6ventuelles du site enzy. m a t i q u e entre le p r e m i e r et les d e u x i 6 m e et troisi6me q r o u p e s sont discut6es. A l'exception d e CI~' d'activit6 plus faible, t o u s l e s produits ont u n e activit6 a n h y d r a s i q u e identique. Les c o n s t a n t e s c a t a l y t i q u e s K~n ~p et kcat ap ont 6t6 d6termin6es p o u r l ' h y d r o l y s e du p-nitroph6nyla c 6 t a t e ; cette 6tude p e r m e t d ' a f f i r m e r la particularit6 d e CI~' d'activit6 plus faible. Introduction. Chez r H o m m e et chez diverses esp6ces de Mammif6res, l'anhydrase carbonique 6rythrocytaire (E.G. 4.2.1.1.) se pr6sente sous deux formes, r u n e CAI (B) de faible aetivit6 el l'autre CAII (C) de haute activit6, alors que les h6maties des Ruminants ne renferment que celle de haute activitd. Ces enzymes catalys.ent de fa~on rdversible l'hydratation de l'anhydride carboniqne F1] ainsi que l'hydratation d'ald6hydes [23 et l'hydrolyse d'esters carboxyliques. De nombreux travaux ont

(*) Service du Professeur M. Rolland. (~) A qui toule correspondance doit dtre adressde.

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6t6 r6alis6s sur les anhydrases carboniques 6rythrocy.t,aires bovi'n.esl [3, 4], hum aines [5, 6. 7~ et de divers primates [8, 9], en utilisant principalement des esters ac6tiques de phdnols. Les r6sultats obtenus sur les deux formes CAI et CAII montrent des diff6rences significatives d'activit6s anhydrasiques et est6rasiques. En ce qui concerne ces dernibres, les r6actions suivent une cin6tique michadlienne mais les constantes K~ et ken t varient d'un laboratoire h l'autre. Ces variations sont dues, selon les auteurs, aux extrapolations nkcessaires /~ l'obtention de ces param6tres el h la diversit6 des conditions exp6rimentales. Des 6tudes cin6tiques ont 6galement dr6 rdalis6es sur des mutants gdn6tiques ; elles montrent soit la similitude d'activit6 des deux formes sauvage et

J.-M. Gulian et coll.

474

m u t 6 e [10, 11, 12, 13] soit d e s d i f f 6 r e n c e s d ' a c t i vit6 [14, 15]. L ' a n h y d r a s e c a r b o n i q u e CAII o u CI d e b c e u f est a c c o m p a g n 6 e d e f o r m e s m i n o r i t a i r e s ddsig n d e s p a r CI~ et CI~, d a n s l ' o r d r e d e l e u r m o b i lit6 6 1 e c t r o p h o r 6 t i q u e a n o d i q u e c r o i s s a n t e . E l l e peut donner naissance, en milieu alealin, des constituants 61ectrophor6tiques stables plus r a p i d e s d 6 s i g n 6 s p a r CI~" et CI ~' i d e n t i q u e s a u x c o n s t i t u a n t s n a t u r e l s c o r r e s p o n d a n t s [16]. Dans l'6tat actuel de nos connaissances, ces prod u i t s d 6 r i v 6 s , n a t i f s o u ¢ a r t i f i c i e l s ~>, se d i f f d r e n c i e n t d e la f o r m e CI p a r l e u r m o b i l i t 6 d l e e t r o p h o r 6 t i q u e , l e u r 61ution c h r o m a t o g r a p h i q u e et l e u r n o m b r e d e v i s c o s i t d l i m i t e [16]. Darts ce t r a v a i l , s o n t e x p o s 6 s les r 6 s u l t a t s d e l ' d t u d e c o m p a r 6 e d e s a c t i v i t 6 s a n h y d r a s i q u e s et est6rasiques effectude sur ces diffdrentes formes de l'anhydrase carbonique drythrocytaire bovine, a i n s i q u e s u r u n e i s o e n z y m e C I I se d i f f 6 r e n e i a n t d e l a f o r m e CI p a r u n e m u t a t i o n A r g ---> G i n e n p o s i t i o n 56 [16].

Matdriel

I.-

PtI~PARATION DES DIFF~RENTES FORMES ENZYMATIQUES.

ELECTROPHORI~SE SUll AC]ETATE DE CELLULOSE.

L'dlectrophor6se a dtd effeetude en t a m p o n vdronal sodique D,02 M, pH 9.2 en cuve Beckman sur b a n d e Beckman ; la m i g r a t i o n est de 45 m i n u t e s sous e n v i r o n 30 v / c m ; les c o n s t i t n a n t s sont rdv~lds p a r le rouge Ponceau. I[I.-

ELECTROFOCALISATION

sun

PLAQUE.

L'dleetrofocalisation des protdines a dtd rdalisde sur des plaques PAG-plate LKB, pH 3,5-9,5, h l'aide d ' u n appareil Multiphor LKB ~117. La r d p a r t i t i o n des protdines en fonetion de l e n r pH~ ndeessite u n e m i g r a t i o n d ' e n v i r o n 135 minutes. Les protdines sont alors rdvdl~es p a r prdeipitation h l'aide d ' u n e solution d'acide triehloraedtique h 12 p. cent (P/V) et d'aeide sulfosalieylique h 3,5 p. cent (P/V) puis eolordes p a r u n e solution de Bleu b r i l l a n t de Coumassie ; enfin, la p l a q u e est ddeolor~e p a r u n mdlange eau-dthanot-aeide acdtique 8/3./1 ( v / v / v ) . IV.-

Le ddtail de la p r e p a r a t i o n des p r o d u i t s > CI ~ et CI~' a 6td o b t e n u d a n s les m ~ m e s c o n d i t i o n s e x p ~ r i m e n t a l e s r n a i s a v e c u n g r a d i e n t l i n d a i r e d e NaCI e n t r e 0 et 0,1)5 M ; la p r e m i e r e f r a c t i o n 61ude, d 6 s i g n d e p a r CI (CIr), est a s s i m i l d e h P e n z y m e CI. L ' d l e c t r o p h o r ~ s e s u r a c d t a t e d e c e l l u l o s e (fig. 1) met en 6vidence : 1) l ' h o m o g 6 n 6 i t d d e s d i f f 6 r e n t e s p r o t d i n e s , 2) l ' i d e n t i t d d e v i t e s s e d e m i g r a t i o n 6 1 e c t r o p h o r 6 t i q u e d e CI et CI r d ' u n e p a r t et d e C I [ e t CI~' d'autre part, Si l ' 6 1 e e t r o f o c a l i s a t i o n (fig. 2) c o n f i r m e I ' h o m o g 6 n 6 i t 6 d e s p r o t d i n e s C I et CIr, il n ' e n est p a s de m & n e d e s e n z y m e s CI[ n a t i v e , CI~" et CI~' ~. E n effet, o n o b s e r v e q u e CI~' se cornp o s e d e d e u x b a n d e s et q u e CI~y et CI~" ' h e6t6

Activitds enzymatiques des anhydrases carboniques bovines. des t r o i s b a n d e s d6sign6es p a r 1, 2 et 3 q u i l e u r s o n t p r o p r e s , c o m p o r l e n t des f r a c t i o n s m i n o r i t a i r e s p r o v e n a n t r e s p e c t i v e m e n t de CI et Cir.

1 2 3 4 5 6 7

475

le t a b l e a u I ; elles r e p r 6 s e n t e n t la m o y e n n e d ' a u m a i n s c i n q d 6 t e r m i n a t i o n s . L a c o m p a r a i s o n de ces v a l e u r s m o n t r e l ' a n a l o g i e d ' a c t i v i t 6 a n h y d r a s i q u e des d i v e r s p r o d u i t s ; s e u l e la f o r m e C I~" se d i f f 6 r e n c i e p a r u n e a c t i v i t 6 a n h y d r a s i q u e sp6cifique p l u s faible. TABLEAU I.

Activitd anhgdrasique carbonique sp~ci[ique en U/mg.

Io

c,

cJ~

cn

cJ;

c~;'

cff

19.300

19.100

18.990

18.400

18.000

12.800

I I I - - Activitds estdrasiques. FIG. 1. - - Electrophor~se comparative sur acdtate de cellulose ; tampon vdronal sodique 0,02 M, pH 9,2 ;

cuve et bande Beckman : migration de 45 minutes sous 30 v / c m ; coloration par le rouge Ponceau. Extrait 6thanol-chloroforme (piste 1 ) ; enzyme CI (piste 2 ) ; enzyme CI~ (piste 3)'; produits obtenus en milieu alcalin ~ partir de CI (piste 4) ; enzyme CI~ (piste 5) ; enzymes CI~' (piste 6) et C(.~' (piste 71.

Les v i l e s s e s d ' h y d r o l y s e d u p - N P A s o n t obten u e s a v e c u n e r e p r o d u c t i b i l i t 6 de ~ 4 p. cent. Nous avons choisi un temps d'hydrolyse d'une m i n u t e afin de d i m i n u e r l ' i n f l u e n c e de l ' i o n ac6tate eL du p - n i t r o p h 6 n o l lib~r~s, ces p r o d u i t s 6tant des i n h i b i l e u r s de la r 6 a c t i o n [7]. Les r e p r 6 s e n t a t i o n s v = f(-~-~) el(~-~-) = f ( ~ - ) 6rant l i n 6 a i r e s darts nos c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n tales, on p e u t a d m e t t r e q u e la r 6 a c t i o n ob5it h u n e c i n ~ t i q u e ruicha61ienne, en a c c o r d a v e c les r6sultats p r 6 c 6 d e m m e n t o b t e n u s p o u r l ' a n h y d r a s e c a r b o n i q u e 6 r y t h r o c y t a i r e b o v i n e CI [3, 4]. Cette 6tude c i n 6 t i q u e , h l'6tat s t a t i o n n a i r e , de l ' h y d r o l y s e du p - N P A a p e r m i s de d 6 t e r m i n e r les constantes enzymatiques apparentes K~ap et v. kcat ap des f o r m e s OI, CI,., CII, C I ] , CI~' et C I .~.

V'

pH 9,5

cl2

3,5

FIG. 2. - - Electrofocalisation sur plaque (PAG-plate LKB), pH 3,5-9,5 ; migration d'environ 135 minutes ; pr6cipitation des prot6ines par une solution d'acide trichlorac6tique ~ 12 p. cent (P/V) et d'acide sulfosalicylique h 3,5 p. cent (P/V) ; coloration par le Bleu brillant de Coumassie ; d6coloration de la plaque par un m~lange eau-6thanol-acide ac~tique 8/3/1 (v/v/v).

II-

Activitd anhydrasique carbonique.

Les v a l e u r s des a c t i v i t 6 s a n h y d r a s i q u e s c a r b o n i q u e s s p 6 c i f i q u e s d 6 t e r m i n 6 e s s u r les p r o d u i t s CI, CII, GIr, CI~, C ~v' et CI~' s o n t r a p p o r t 6 e s d a n s

BIOCHIMIE, 1978, 60, n ° 5.

L ' e x t r a p o l a t i o n q u i p e r m e t d ' o b t e n i r les v a l e u r s de K~ ~p et Vmax ap p a r la m 6 t h o d e des m o i n d r e s c a r r 6 s se r6v61ant d61icate, n o u s a v o n s m i s ~ p r o fit la p r o p o r t i o n n a l i t 6 de Vm,,~ et de E o p o u r d6term i n e r ces c o n s t a n t e s a v e c p l u s de p r 6 c i s i o n . La figure 3 m o n t r e c e t t e p r o p o r t i o n n a l i t 6 p o u r l ' e n z y m e GI ; les v a l e u r s de V ~ , ~, et K~ ~p ainsi q u e la m o y e n n e d u r a p p o r t V m ~ J E o s o n t r a s s e m b l 6 e s d a n s le t a b l e a u II. Les c a l c u l s d ' e r r e u r s s u r le K map ont 6t6 effectu6s p a r o r d i n a l e u r s e l o n la m 6 t h o d e de Clel a n d [20]. Les v a l e u r s d e K map et kca tap d 6 t e r m i n 6 e s d a n s des c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n t a l e s i d e n t i q u e s s u r les e n z y m e s CI, CII, CI r, CI~, CI ~' et CI~' s o n t r a p p o r t 6 e s darts le t a b l e a u ]II. Les 6carts o b s e r v 6 s s u r les v a l e u r s du K map des d i f f 6 r e n t e s e n z y m e s ne s o n l pas s i g n i f i c a t i f s si l ' o n

J . - M . G u l i a n et coll.

476

c o n s i d 6 r e les e r r e u r s s t a n d a r d d 6 t e r m i n 6 e s s u r l ' e n z y m e C,I ( t a b l e a u II). La m f m e r e m a r q u e p e u t 6tre f a i t e p o u r les v a l e u r s du kca tap, h l ' e x c e p t i o n de la f o r m e CI~' d o n t le k c a t a p de 2A)O0, m i n -1 montre une diminution significative.

L ' e x a m e n d u t a b l e a u IV m o n t r e une a u g m e n t a tion, l o r s q u e l ' o n p a s s e des f o r m e s n a t i v e s CI et CII ou ¢ r e n a t u r 6 e >) CI,. aux p r o d u i t s de t r a n s f o r TABLEAU H I .

Constantes cin~tiques de l'hydrolyse du p-nitroph~nylac~tate par les e n z y m e s C1, CII, CI r, CI'~ , Cl i' et CI ~' . 20(

•

I{m ap

kcat ap

ttM

mia-'

14.400 16.400 17.400

2.400 2.500 2.500

18.300 18.300

2.700 2.700

18.800

2.000

st 3, •

•

®

- 100 ®

CI CII CIr C~ CI[' CI~

TABLEAU IV. 2

~/s lo -4 ~M-1

4

6

FIG. 3. - - Droites de Lineweaoer-Burk de l'hydrolyse du p-NPA par l'enzyme CI. Eo = 0,2 ~tM (droite ~ ) ;

Constantes d ' h y d r o l y s e du p-nitroph~nylac~tate et de l'o-nitroph~nylaedtate par les e n z y m e s CI, CII, CI,., CI ~, CI ~' et CI ~'.

Eo = 0,3 IxM (droite (~)) ; Eo = 0,6 t~M (droite (~)) ; Eo = 0,8 I~M ( d r o i t e @ ) ; Eo = 0,9 ~M (droite ~ ) ; Eo = 1,0 ~M (droite @).

t0 ~ × k~L~ ~M-j.min -1 p-N P A

o -N PA

1.210 -4- 12

80 ~.~ 1

1.130 1.150 1.200 1.150

75 ~ 1 75 ~___ 1 86 -¢- 1

TABLEAU II.

Constantes cin~tiques de l'hydrolyse du p-nitroph~nylacdtate par l ' e n z y m e CL E.

Vm~

~M

I~M. min-I

0,2 0,3 0,6 0,8 0,9 1,0

539 754 1.382 1.898 2. 038 2.166

K~

ttM 15.086 14.462 14.364 14.539 14. 360 13. 764

___+ 5.958 +___ 4.254 -4- 4.830 -4- 3.529 -t- 1. 677 + 1. 886

VmBx

Eo min-I

2. 386

(a =

191)

La v i t e s s e de la r 6 a c t i o n p e u t 6tre c o n s i d 6 r 6 e d a n s nos c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n t a l e s (Km > S o > Eo) c o m m e p r o p o r t i o n n e l l e a u x c o n c e n t r a t i o n s du s u b s t r a t S O et de l ' e n z y m e E o. Cette v i t e s s e est -d6finie p a r v = ken z (Eo) (So). Les v a l e u r s des ken z a i n s i d 6 t e r m i n 6 e s , o b t e n u e s ap.r6s h y d r o l y s e du p-N'PA el de l ' o - n i t r o p h 6 n y l ac6tate (o-NPA) s o n t r a p p o r t 6 e s darts le t a b l e a u IV.

BIOCHIMIE, 1978, 60, n ° 5.

CI CII

CIr CI[ CI~' CI~"

~___11 ___+12 ~__ 12 -¢- 12

900 -t-

9

85 ~+ 1 90 -t- 1

m a t i o n s CI~, CI~' et CI~', de l ' a c t i v i t 6 vis-h-vis de I ' o - N P A ; les v a l e u r s des ken Z p o u r le p - N P A p e u v e n t ~tre c o n s i d 6 r 6 e s c o m m e c o n s t a n t e s p o u r t o u s l e s p r o d u i t s /~ l ' e x c e p t i o n de CI~' d ' a c t i v i t 6 p l u s faible. O n p e u t n o t e r q u e l ' h y d r o l y s e du p - N P A est de 1,0 /t 15 l o i s p l u s r a p i d e q u e celle de I'o-NPA. La v a r i a t i o n d u r a p p o r t kCnzp-NPA/ kenzo'N~PA ( t a b l e a u V) p e r m e t de d i s t i n g u e r 3 groupes d'enzymes : - - CI, CII et CI r p o u r l e s q u e l l e s le r a p p o r t est tr6s p e u d i f f 6 r e n t de 1'5, --CIi et C I [ ' p o u r p r o c h e de 14, --

l e s q u e l l e s le r a p p o r t

CII' p o u r l a q u e l l e le r a p p o r t est 6gal ~ 10.

est

Activit~s e n z y m a t i q u e s des a n h y d r a s e s carboniqttes bovines. La eonstante catalytique kenz de la r6aetion d ' h y d r o l y s e du p-N;PA p a r les enzymes CI, CI r, CI~, C/~ et CI~" a 6t6 d6termin6e p o u r des valeurs de pH comprises entre 6 et 8 et ses variations sont repr6sent6es dans la figure 4. TABLEAU V,

Rapports des eonstantes de l'hydrolyse du p-nitrophdnylacdtate et de o-nttrophenylacetate. ke~p-N PA/kenzo-NPA CI CII CI,

15,1 15,1 15,3

ci~

13,9

CI~" Cl~'

13,5 10,0

l 2

3

1606 .7 E=

"T,

500

7

0

pH

Fro. 4. - - Courbes des aetivitds est~rasiques en [onction du pH. Substrat p-NPA, 2704,22 I~M ; tampon

Tris-H2SO4, 0,05 M en T r i s ; concentrations enzymatiques 0,5 ~M. • • enzyme Cl I © © enzyme Clr eourbe 1

1

• A

• enzyme CI~ ] A enzyme CI~' ~ eourbe 2

[]

[] enzyme CI~' eourbe 3

Les courbes obtenues p o u r c h a c u n e des a n h y drases c a r b o n i q u e s ont u n e forme sigmoidale. On peut noter que :

BIOCHIMIE, 1978, 60, n o 5.

1) les v a r i a t i o n s du k~n~ p o u r les formes CI et CI~ sont i d e n t i q u e s (courbe 1), 2) les v a r i a t i o n s du ken~ p o u r les formes CI~' et CI~" sont i d e n t i q u e s (courbe 2), 3) les g r o u p e m e n t s ionis6s impliqu6s dans la r6action e n z y m a t i q u e ont des pk~ compris entre 7,0 et 7,5. Ces pk,, quoique voisins, sont 16g6rem e n t diff~rents ; les enzymes CI, CIr, CII et CIS ont u n pk~ p r o c h e de 7;5 et l ' e n z y m e CI~' a u n p k , p r o c h e de 7,1.

Discussion.

1500

-~

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Dans ce t r a v a i l c o m p a r a t i f sur les a n h y d r a s e s c a r b o n i q u e s 6 r y t h r o c y t a i r e s bovines natives et nous avons admis que, dans les c o n d i t i o n s expbrimentates utilis6es, les r6actions e n z y m a t i q u e s ob6issaient h u n sch6ma micha+lien. Cette hypoth6se peut 8tre 6tay6e par les t r a v a u x de Pocker et Stone [21] sur leurs p r 6 p a r a t i o n s d ' a n h y d r a s e s c a r b o n i q u e s 6 r y t h r o c y t a i r e s bovines. Sa validit6 ressort par ailleurs des r6sultats obtenus par Verpoorte [7] sur les a n h y d r a s e s carboniques ~ r y t h r o c y t a i r e s h u m a i n e s , d 6 n l o n t r a n t que leurs constantes e n z y m a t i q u e s K~ et keat obtenues h l'6tat stationnair,e ne diff6rent pas de celles d6termin6es h l'aide d ' u n , lequel ne per]net pas de mettre en ~vidence u n 6ventuel interm6diaire ac6tyl-enzyme, soit parce q u ' i l n'existe pas, soit parce qu'il a une existence trop br~ve. Malgr6 l'h6t6rog6n~it6 des formes CI[, CI~' et CI~" mise en 6vidence p a r l'61ectrofocalisation (fig. 2), on peut admettre que cette hypoth~se valable p o u r le m61ange l'est aussi p o u r tous les c o n s t i t u a n t s de ce m61ange. L ' e x a m e n du t a b l e a u V permet de d i s t i n g u e r ces enzymes en trois groupes : 1) CI, CI'I et CIr,

2) CI~ et CI~',

3) ci~. Dans le p r e m i e r groupe, les formes CI, CII et CI r ne se diff6rencient n i p a r leur activit6 a n h y d r a sique (tableau I), n i p a r leurs activit~s est6rasiques (tableau III et IV). On peut donc consid~rer que le d~plissement en m i l i e u alcalin puis le r 6 a r r a n gement qui a c o n d u i t ~ l ' o b t e n t i o n de la forme CI,, de m6me que la m u t a t i o n 56 Arg ~ Gln qui diff6rencie CI et CII ne modifient pas les activit6s enzymatiqu,es. 33

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J.-M. G u l i a n el coll.

Dans le second groupe, on a d m e t l'identit6 des constituants CI~ et C I~" qui ne se d i f f 6 r e n c i e n t ni p a r les pH i des trois b a n d e s qui les c o m p o s e n t (fig. 2) ni p a r leurs activit6s a n h y d r a s i q u e s (tableau I) et est6rasiques (tableau III et IV). Les t r a v a u x de F u n a k o s h i et D e u t s c h [22] sur les a n h y d r a s e s c a r b o n i q u e s 6 r y t h r o c y t a i r e s h u m a i n e s ont m o n t r 6 que l ' e x i s t e n c e des v a r i a n t s conf.~rm.a~ion,n.el,s r6sul~le d'e d~s,amid,a,ti~ons sa]ccess.ives: qui se f.era,~ent au hasa, rd sur ~a mol6cule ; le m6me processus est admis p o u r les v a r i a n t s c o n f o r m a t i o n n e l s natifs. Cependant, la p r 6 s e n c e de t r o i s constituants p o u r le p r e m i e r v a r i a n t CI~ ou CI[' et de deux constituants p o u r le s e c o n d v a r i a n t CI~ sugg6re que les d6samidations ont lieu sur des sites pr6f6rentiels, c o m m e Font m o n t r 6 R o b i n s o n et al. sur des p e p t i d e s de synth6se [23]. Que celles-ci se p r o d u i s e n t au h a s a r d ou sur des sites pr6f6rentiels, elles e n t r a l n e n t , p o u r les a n h y d r a s e s c a r b o n i q u e s h u m a i n e s et bovines, des m o d i f i c a t i o n s de la c h a r g e nette des mol6cules et une a u g m e n t a t i o n du n o m b r e de viscosit6 limite (NYL) qui p o u r r a i t r6sulter d ' u n e 61ongation de la mol6cule. En effet, les e n z y m e s des d e u x i 6 m e et t r o i s i 6 m e groupes CI~, CI~' et CI~' ont des NVL r e s p e c t i v e m e n t 6gaux h ~5,9, c5,7 et '5~5 et des r a p p o r t s a x i a u x resp e c t i v e m e n t 6gaux h 4;9, 4,8 et 4,6 [24] ; elles p e u v e n t 6tre consid6r6es c o m m e des ellipsoides de r 6 v o l u t i o n allong6s. P a r m i celles du p r e m i e r g r o u p e OI et CII ont un 1VV,L e t un r a p p o r t axial i d e n t i q u e s [25] ; ces p a r a m 6 t r e s ont r e s p e c t i v e m e n t p o u r v a l e u r 3,6 et 2',8 [24]. Des donn6es c o m p l 6 m e n t a i r e s obtenues sur ~ r (M, Bouthier, t r a v a u x non publi6s) p e r m e t t e n t d ' a s s i m i l e r ces t r o i s e n z y m e s h des mol6cules plus compactes. L ' e n s e m b l e des r6sultats e x p 6 r i m e n t a u x i n d i q u e que le c o m p o r t e m e n t des e n z y m e s vis-h-vis des deux substrats est s i g n i f i c a t i v e m e n t diff6rent. E n effet, les activit6s e n z y m a t i q u e s (tableaux I I I et IV), dans le cas du p-NP'A, p e u v e n t 6tre consid6r6es c o m m e constantes h l ' e x c e p t i o n de la f o r m e CI~' d'activit6 plus faible, alors que dans le cas de I'o-N~PA on constate un a c c r o i s s e m e n t d'activit6 l o r s q u e l'on passe des f o r m e s CI, C I I et GIr aux p r o d u i t s de t r a n s f o r m a t i o n . Ceci se t r a d u i t p a r la d i m i n u t i o n du r a p p o r t ko~,p-N'PA/k~o-NIaA qui p e r m e t de d i s t i n g u e r les t r o i s groupes d ' e n z y m e s d6jh cit6s. Les p l ~ des deux substrats 6rant i d e n t i q u e s [7], la d i m i n u t i o n d'activit6 des enzymes vis-h-vis de I'o'I~PA ne peut 6tre due qu'~ l ' a u g m e n t a t i o n de l ' e n c o n l b r e m e n t st6rique. On peut donc c o n c l u r e que la v a r i a t i o n d'activit6 des enzymes p o u r les deux substrats est due h une m o d i f i c a t i o n progressive du site e n z y m a t i q u e du p r e m i e r au t r o i s i 6 m e BIOCH1MIE, 1978, 60, n ° 5.

groupe d'enzymes. Cette m o d i f i c a t i o n qui e n t r a i n e une d i m i n u t i o n du pk a des g r o u p e m e n t s tonisables i m p l i q u 6 s dans la r6action, de pka = 7,5 p o u r les e n z y m e s CI, CI r, C I I et C[ ~'~ pk~ = 7,1 p o u r l ' e n z y m e C I ~' (fig. 3), p o u r r a i t 6tre la cons6quence : - d'un c h a n g e m e n t de l ' e n v i r o n n e m e n t i o n i q u e au n i v e a u du site e t / ou - d'un 61argissement de ce d e r n i e r p a r suite de l'61ongation de la mol6cule p e r m e t t a n t une meilleure accessiSilit6 p a r le substrat dont l ' e n c o m b r e m e n t st6rique est le plus i m p o r t a n t . R e m e r c i e m e n t s .

Nous remercions Monsieur le Professeur J. Ricard pour les conseils qu'il nous a prodiguds et Mademoiselle C. Dalmasso pour sa collaboration.

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