Klin. Wschr. 53, 1049-1056 (1975) - © by Springer-Verlag 1975

Originalien Nitroblau-Tetrazolium-Reduktionskapazit/it von neutrophilen Granulocyten C. Eschenbach, G. Seebach und St. Mfilter-Lissner Univ.-Kinderklinik Marburg a.d. Lahn (Direktor: Prof. Dr. reed. F. Linneweh)

Capacity of Nitroblue Tetrazolium-Reduction of Neutrophilic Granulocytes. Summary. A modification of the NBT-reaction is described which allows a differentiation of the NBT uptake and NBT-reduction. By means of this method it has been shown that the capacity of NBT-reduction of neutrophil granulocytes taken from hematologically healthy persons is independent of the probands' age and, moreover, of the presence of acute infections and their etiology. It has been shown, that the increase in the NBT-reduction of neutrophilic granulocytes of newborns and persons with acute bacterial infections results from an increased NBT-ingestion. To give an example of a strongly reduced capacity of NBT-reduction of the neutrophilic granulocytes 2 patients suffering from fatal granulomatous disease in childhood have been examined. Key words: NBT-Test, NBT-reduction, neutrophilic granulocytes, bacterial and viral infections, newborns. ZusammenJassung. Es wird eine Modifikation des NBT-Testes beschrieben, die eine quantitative Differenzierung der NBT-Aufnahme und NBT-Reduktion erlaubt. Mit dieser Methode wurde gezeigt, dab die NBT-Reduktionskapazit~it neutrophiler Granulocyten hfimatologisch gesunder Personen unabMngig vom Alter der Probanden und unabh/ingig yon akuten Infektionen und deren Atiologie ist. Es wurde gezeigt, dab die Erh6hung der NBT-Reduktion der neutrophilen Granulocyten von Neugeborenen und Patienten mit akutenbakteriellenInfektionendurcheineerh6hte NBT-Ingestion bedingt ist. Als Beispiel verminderter NBT-Reduktionskapazit/it der neutrophilen Granulocyten wurden 2 Patienten mit Progressiver Septischer Granulomatose untersucht. Schliisselw6rter:NBT-Test, NBT-Reduktion, Neutrophile Granulocyten, bakterielle und virale Infektionen, Neugeborene

Das Prinzip des Nitroblau-Tetrazolium-Testes beruht darauf, dal3 gelbes Nitroblau-Tetrazolium (NBT) yon phagocytierenden Leukocyten durch Ingestion und bzw. oder Diffusion aufgenommen und zu unl6slichem, lichtblauen Formazan reduziert wird. Wird in einer Zelle Formazan mikroskopisch nachgewiesen, ist gezeigt, dab diese Zelle NBT sowoht aufgenommen wie auch zu Formazan reduziert hat. Trotz vielfacher Modifikationen der Methode ist eine Trennung der Funktionen NBT-Aufnahme und NBT-Reduktion nicht m6glich. Die Negativitfit einer Zelle im NB-Test lfif3t keine Schlfisse zu, ob diese Zelle NBT aufgenommen, jedoch nicht zu Formazan reduziert hat, ob bei normaler NBT-Reduktionskapazit/it NBT durch die Zelle nicht aufgenomnaen wurde oder ob beide Funk-

tionen gest6rt sind. Entsprechend erlaubt eine fiber die Norm hinausgehende Steigerung der Positivit/it keine Aussage fiber deren Ursache. Um eine Differenzierung von NBT-Aufnahme und NBT-Reduktion zu erm6glichen, wird folgende Modifikation des NBT-Testes beschrieben: NBT wird an hitzget6tete Bakterien gekoppelt und Leukocyten zur Ingestion angeboten. Erfolgt die Reduktion des NBT zu Formazan, erscheinen die ingestierten Bakterien lichtblau gef~irbt, bleibt die Reduktion des NBT aus, sind die NBT-tragenden Bakterien lichtmikroskopisch ebenfalls sicher zu identifizieren, sie sind grau-braun. Damit wird erm6glicht, das Angebot von NBT quantitativ auf die phagocytierenden Leukocyten zu beziehen, somit auch das Angebot zu variieren und Korrelationen yon NBT-Angebot und NBT-Reduktion einerseits und NBT-Ingestion und NBT-Reduktion andererseits vorzunehmen. Mit der beschriebenen Methode konnte gezeigt werden, dab neutrophile Granulocyten (NG) hfimatologisch gesunder Patienten fiber identische NBT-Reduktionskapazit~iten verffigen, also keine Abh/ingigkeit der NBT-Reduktionskapazit~it yon der Atiologie akuter Infektionen und dem Alter der Probanden besteht, wfihrend bei der Progressiven Septischen Granulomatose erwartungsgemfil3 - bei normaler Ingestionskapazit/it - die NBT-Reduktionskapazit/it der Neutrophilen Granulocyten vermindert ist.

Untersuchungsmaterial Die Einteilung erfotgte in 5 Untersuchungsgruppen: A. Gesunde Kontrollpersonen (n = 10), B. Patienten mit akuten, bakteriell bedingten Infektionen (n = 10), C. Patienten mit akuten, viral bedingten Infektionen (n= 10), D. gesunde, reife Neugeborene gesunder Mfitter (n= 10) und E. 2 Patienten mit Progressiver Septischer Granulomatose. Als Kriterien ftir die Auswahl der Probanden der Untersuchungsgruppen A - C wurden anamnestische Angaben, Befunde klinischer Untersuchungen und Ergebnisse yon Laboratoriumsuntersuchungen (Blutsenkungsgeschwindigkeit, Leukocytenzahl, Differentialblutbild, Befunde des Lumballiquors, Urinbefunde, ~viesero-

1050

C. Eschenbach et al. : NBT-Reduktionskapazitfit yon neutrophilen Granulocyten

logische Untersuchungsergebnisse) herangezogen. In keiner Gruppe wurden Personen aufgenommen, die im Laufe eines Monats vor der Untersuchung einer Impfung unterzogen worden waren. Auch Patienten mit chronisch-entzfindlichen Prozessen wurden ausgeschlossen. In der Untersuchungsgruppe D wurden Neugeborene zusammengefal3t, deren Mfitter zum Zeitpunkt der Geburt frei yon Infektionen waren, deren Schwangerschafts- und Geburtsverlauf komplikationslos waren, deren Geburtsgewicht zwischen 2900 und 3600 g tagen und deren Apgar-Indices 10 betrugen. Nicht aufgenommen wurden Neugeborene, bei denen intrauterine Infektionen oder Fruchtwasseraspirationen bestanden. Ebenfalls ausgeschlossen wurden Neugeborene, deren Mtitter an endokrinen St6rungen litten. 2 Patienten mit Progressiver Septischer Granulomatose ~ wurden in der Untersuchungsgruppe E aufgenommen. Die Diagnose beider Patienten wurde in einer ausw/irtigen Klinik gestellt. Untersucht wurden: H-D.S., 13 Jahre, m/innlich; R.S. 16 Jahre, weiblich und vier klinisch gesunde Geschwister im Alter von 5, 9, 10 und 15 Jahren, die Eltern dieser Kinder konnten nicht untersucht werden (wahrscheinlich autosomat-rezessive Form der Progressiven Septischen Granulomatose).

Untersuchungsmethode NBT-Staphylokokken-Suspension: als NBT-Tr/iger wurde Staphylococcus aureus SG 5112 verwendet; die Kultur erfolgte in Gtucose-Boullion wS.hrend 24 Std bei 37° C; anschliel3end Abt6tung der Erreger dutch Erw~irmung der Kultur auf 65° C ffir die Dauer von 30 min; Zahl der abget6teten Erreger: 101~- 10~Z/ml; bis zur Verwendung wurde die Bakterien-Suspension in Polystyrolr6hrchen von 8 ml Volumen in gefrorenem Zustand (Temperatur - 1 4 ° C) gelagert. Nach raschem Tauen im Wasserbad von 3 0 - 35 ° C folg~e zweimalige Waschung der Staphylokokken durch Zentrifugation und Resuspension in phosphatgepufferter NaC1-L6sung bei Raumtemperatur; nach einer weiteren Zentrifugation wurden die Staphylokokken in NBT-L6sung suspendiert. Herstellung der NBT-L6sung: 20 mg Nitroblau-Tetrazolium (Serva, Heidelberg) werden unter Erwfirmung auf 37° C in 3 ml phosphatgepufferter NaC1-L6sung gel6st, anschlieBend Filtration der L6sung. Wit verwendeten f~r das Sediment von 16 ml Staphylokokken-Suspension lml NBTL6sung. Die Inhibierung der Erreger mit NBT erfolgte durch Inkubation wfihrend 60 rain bei 37° C. Die Zahl der NBT-Staphylokokken/Volumeneinheit wurde durch Verdiinnung eines Teiles der Suspension mit NaC1-L6sung im Verh~iltnis 1:20 in einer NeubauerZghlkammer bestimmt. Die. angewendeten NBT-Staphylokokken(NBT-Staph-)Suspensionen enthielten 2 - 4 x 10 9 NBT-Staph/ml Suspension.

Blutentnahme Den Patienten der Untersuchungsgruppen A, B, C und E wurden ca. 6 1ilt Venenblut entnommen und in Polystyrolr6hrchen mit 0,2 mg Heparin (Hoffmann-La Roche, Grenzach/Baden, ca. 160 IE/ rag) vermischt. In der Untersuchungsgruppe D wurde Nabelgeffigblut verwendet, das aus dem maternen Stumpf der frisch durchschnittenen Nabelschnur gewonnen wurde. 1 Die Autoren danken Herrn Dr. med. W. Duckert, Chefarzt der P/idiatrischen Abteilung des Kreiskrankenhauses Reutlingen, die Untersuchung der Patienten mit Progressiver Septischer Granulomatose erm6glicht zu haben. 2 Wir danken Herrn Prof. Dr. med. W. Schiff, Hygiene-Institut der Universit/it Marburg, ffir die Herstellung und fJberlassung der Staphylokokken-Suspensionen.

Relation der NBT-Staph/NG: um eine unterschiedliches Angebot der NBT-Staph/NG im Ansatz berechnen zu k6nnen, wurde vor Untersuchungsbeginn im Blur der Patienten der Untersuchungsgruppen A, B, C und E die absolute Zahl der NG/ml bestimmt. Da ein entsprechendes Vorgehen in der Untersuchungsgruppe D nicht m6glich war, wurde in dieser Gruppe eine Zahl von 5 x 106/ml angenommen. Unter Zugrundelegung von 1 ml Vollblut ffir jeden Ansatz, der jeweils bestimmten bzw. in der Gruppe D angenommenen Zahl der NG/1 ml Vollblut und der bestimmten Zahl der NBTStaph/1 ml NBT-Staph-Suspension wurde ffir jeden Ansatz die zu verwendenden Volumina der NBT-Staph-Suspension elxechnet, um folgende Relationen der NBT-Staph des Angebotes pro NG des zu untersuchenden Blutes zu erreichen: 6, 12, 25, 50 und 100: 1. Da in der Gruppe D die Zahl der NG Niufig vonder angenommenen Zahl yon 5 x 106/ml stark abwich, wurden in dieser Gruppe zusfitzlich die Relationen 3 und 200 NBT-Staph/NG berechnet.

Ansdtze Die ffir jeden Ansatz errechnete Menge der NBT-Staph-Suspension wurde in Polystyrolr6hrchen pipettiert und dutch Zusatz yon gepufferter NaC1-L6sung bis zu einem Gesamtvolumen yon 0,5 ml ergS.nzt. Unmittelbar nach der Blutentnahme wurde jedem vorbereiteten Inkubationsansatz 1 ml heparinisiertes Blut zugesetzt. WS.hrend der 30 rain dauernden Inkubation bei 37°C wurde jedes Inkubationsr6hrchen um die L~ingsachse mit einer Geschwindigkeit von 5 0 - 6 0 U/rain rotiert. Anschliegend wurden yon dem Blut jedes Ansatzes mehrere gleichm~iBige, dfinne Ausstrichpriiparate angefertigt, luftgetrocknet und ungef/irbt mit Eukitt eingedeckt. In dem ffir die Ansfitze nicht verwendeten Blut wurde nochmals die Zahl der NG :ml bestimmt. Diese Werte wurden zur endgiiltigen Berechnung der Relation NBT Staph/NG herangezogen.

Auswertung Die Auswertung der Priiparate erfotgte mit einem Phasenkontrastmikroskop bei einer Vergr6Berung von 1 : 800. Vom Ausstrichende beginnend wurden an beiden seitlichen R~indern der Pr~iparateje 50 unbeschadigte, unausgewfihlte NG beurteilt. Sic sind durch die Zellgr613e, die Kernform und die Granulastruktur von den ebenfalls phagocytierenden Monocyten und eosinophilen Granulocyten wie von den nichtphagocytierenden Lymphocyten abzugrenzen. Ingestierte, jedoch nicht reduzierte NBT-Staph erscheinen ats graubraune, reduzierte NBT-Staph als lichtblaue his dunkelblaue EinschliJsse, deren Mehrzahl hei lichtmikroskopischer Betrachtung nicht von einer Membran umschlossen ist, die teilweise jedoch auch innerhalb von Vacuolen gelegen sind. In jedem einzelnen NG wurden bewertet: die Gesamtzahl der ingestierten NBT-Staph und die Zahl der reduzierten NBT-Staph. Aus den gewonnenen Ergebnissen lassen sich folgende Werte fiir jeden A n satz - fiir jede gew~ihlte Relation NBT-Staph]NG jedes Versuches - errechnen: 1. der Ingestionsindex=Zahl der dutch 100 N G ingestierten NBT-Staph (NBT~-Staph/100 NG), 2. der Anteil der ingestierenden NG=prozentualer Anteil der an der Ingestion beteiligten NG (NG-%), 3. der Reduktionsindex= Zahl der durch 100 NG reduzierten NBT-Staph bezogen auf die durch 100 NG ingestierteu NBT-Staph (% tier ingestierten NBT-Staph), ffir jede untersuchte Person: 4. das erfordertiche Angebot von NBT-Staph/NG, um einen definierten Ingestionsindex zu erreichen (NBT-Staph/NGd~f.i~g~_

sdonsir~dex)~

5. der Anteil der ingestierenden NG bei einem definierten Inge-

stionsindex (NG-%aef.Ing,stio~slndex)und

C. Eschenbach et al. : NBT-Reduktionskapazitiit von neutrophilen Granulocyten 6. der Reduktionsindex bei einem definierten Ingestionsindex (% der ingestierten NBT-Staphaef. tr~gestionsindex). Um innerhalb jeder Untersuchungsgruppe und f/Jr die Untersuchungsgruppen untereinander vergleichbare Werte zu erhalten,wurden die Ergebnisse der errechneten Werte 1 . - 3 . f/Jr die Relation des Angebotes yon 60, 40, 20 und 10 NBT-Staph/NG numerisch interpoliert. Die Werte 4. - 6 . wurden jeweils f/Jr die Ingestionsindices 4000, 7000, 1000 und 1300 NBT-Staph/100 NG berechnet. Die Berechnung der Signifikanz der Differenzen der Ergebnisse zwischen der Untersuchungsgruppe A einerseits und den Untersuchungsgruppen B - D andererseits wurden mit Hilfe des t-Testes vorgenommen. Die Ergebnisse der Untersuchungsgruppe E wurden einzeln betrachtet und nicht auf Signifikanz gepriift.

Ergebnisse Die Ergebnisse der quantitativen Auswertung sind in den Abb. 1 bis 3 und in den Tabellen 1 und 2 dargestellt. Folgende Aussagen sind m6glich: 1. In den Untersuchungsgruppen A - D steigen mit zunehmendem Angebot von NBT-Staph/NG der Ingestionsindex, der Anteil der ingestierenden NG und der Reduktionsindex der NG (Abb. 1). 2. Bei gleichem Anstieg des Angebotes yon NBTStaph/NG erfolgt der Anstieg der Ingestionsindices der NG der Untersuchungsgruppen A - D unterschiedlich (Abb. 1): in den Gruppen B (akute bakterielle Infektionen) und D (gesunde Neugeborene) ist der Ingestionsindex in den gewfihlten Relationen des Angebotes gegenfiber der Gruppe A (infektfreie Personen) signifikant gesteigert, in der Untersuchungsgruppe C (akute virale Infektionen) ist der Ingestions-

index in keiner der gew/ihlten Relationen des Angebotes vonder Gruppe A signifikant abweichend (Tabelle 1). 3. Bei gleichem Anstieg des Angebotes yon NBTStaph/NG ist der Anstieg des Anteils der ingestierenden NG in den Gruppen B und D gegeniiber der Gruppe A in allen Relationen des Angebotes signifikant gesteigert. Ffir die Untersuchungsgruppe C ergibt sich gegenfiber der Gruppe A bei keiner der gewfihlten Relationen des Angebotes eine Signifikanz der Differenzen fiir diesen Parameter (Abb. 1, Tabelle 1). 4. Bei gleichem Anstieg des Angebotes von NBTStaph/NG erfolgt der Anstieg des Reduktionsindex der verschiedenen Untersuchungsgruppen unterschiedlich (Abb. 1). Gegentiber der Untersuchungsgruppe A erfolgt der Anstieg des Reduktionsindex der NG der Untersuchungsgruppen B und D in allen Relationen des Angebotes signifikant gesteigert (Abb. 1, Tabelle 1). Keine Signifikanz der Differenzen dieses Parameters 1/il3tsich im Vergleich der Gruppen A und C erreclmen. 5. Um in den Untersuchungsgruppen A - D deftnierte gleiche Ingestionsindices zu erreichen, sind unterschiedliche Angebote yon NBT-Staph/NG als Phagocytat erforderlich. In den Untersuchungsgruppen B und D ist das notwendige Angebot signifikant geringer als in den Untersuchungsgruppen A und C (Abb. 2, Tabelle 2 a). Die NG von Patienten mit akuten bakteriellen Infektionen und die gesunder Neugeborener ingestieren intensiver als die infektionsfreier Kontrollpersonen und Patienten mit akuten viralen Infektionen. Red.-;lnd. [red, l~T-Staph./100

3ngestierende I'I(3

J

0

1) 1"0 2'0 A

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6() 0 10 20 B

/,/

40

1051

60 0 10 20 C

40

ingest. NBT-Stoph,~ . - - .

,--, % 100

/

60 0 10 20 D

40

60

0

Angebot

yon NBT-Staph. / NG

Abb. 1. Abh~ingigkeit des Ingestionsindex der neutrophilen Granulocyten, des Anteils der ingestierenden neutrophilen Granulocyten und des NBT-Reduktionsindex tier neutrophiten Granulocyten von dem Angebot der NBT-Staph/NG im Inkubationsansatz hfimatologisch gesunder Personen. A infektfreie Kontrollpersonen, B Patienten mit akuten bakteriellen, C Patienten mit akuten viralen Infektionen, D gesunde Neugeborene. In der Untersuchungsgruppe B war die Errechnung der Werte bei dem Angebot yon 60 NBT-Staph/NG nicht m6glich, da die Ingestion zu intensiv war

1052

C. Eschenbach et al. : NBT-Reduktionskapazit/it von neutrophilen Granulocyten Tabelle 1: Signifikanzniveau des Ingestionsindex, des Anteils ingestierender neutrophiler Granulocyten und des Reduktionsindex der Untersuchungsgruppen B, C und D gegenfiber der Kontrollgruppe A in Abhgngigkeit yon dem Angebot der NBT-Staph/NG. t-Test. 0 : P > 5 % , x : 5 % > P > 1%, x x :1%__>P>0,1%, x x x : P < 0 , 1 %

Angebot yon NBT-Staph/NG

100

80

Angebot der NBT-Staph/NG 10

E

60

40

60

Ingestionsindex



40

20

20

B

x

xxx

xxx

/

C D

0 0

0 xxx

0 xxx

0 xxx

Anteil ingestierender N G B C D

xxx 0 xxx

xxx 0 xxx

xx 0 xx

[ 0 xx

Reduktionsindex B C

xx 0

xx 0

xx 0

/ 0

xx

xx

D

x

x

0,/, 0,7 1,0 1,3 3ngest-3nd. [,103 NBT-Staph./100NG] Abb. 2. Notwendiges Angebot von NBT-Staph/NG im Inkubationsansatz, um die Ingestionsindices 0 , 4 - 0 , 7 - 1 , 0 und 1,3x103 NBT-Staph/100 NG zu erreichen. • =infektfreie Kontrollpersonen, • =Patienten mit akuten bakterielten, [] =Patienten mit akuten viralen Infektionen, [] = gesunde Neugeborene. Angabe der Mittelwerte und tier Standardabweichungen. Weiterhin sind die entsprechenden Werte yon 2 Patienten mit Progressiver Septischer Granulomatose angegeben ( - x - x - = H D . S . - o - o - =R.S.)

Tabelle2a und b. Signifikanzniveau des notwendigen Angebotes von NBT-Staph/NG zur Erreichung der Ingestionsindices 0 , 4 0 , 7 - 1 , 0 - 1 , 3 x t03 NBT-Staph/100 NG (a) und des Reduktionsindex bei den Ingestionsindices 0 , 4 - 0 , 7 - 1 , 0 - 1 , 3 NBT-Staph/ 100 NG (b) der Untersuchungsgruppen B, C und D im Vergleich zur Kontrollgruppe A. Vgl. Tabelle 1 Ingestionsindex ( x 103 NBT-Staph/100 NG) 0,4

Redukt.--3nd, [red, NBT-Stoph,/ 1;/; "~ 100 ingest. NBT-Stap~.]

J 8ot } | li

/Y

~

o

0,7 3ngest.-3nd,

1,0

1,3

B C

xxx

xxx

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0

0

0

n

D

XXX

X X X

XXX

XXX

B

0

0

0

0

C D

0 0

0 0

0 0

0 0

°

60

20

0,7

°

11o

,13

[=103 NBT-Staph./100NG]

Abb. 3. Abhiingigkeit der Reduktionsindices von den Ingestionsindices 0 , 4 - 0 , 7 - 1 , 0 und 1,3 x 103 NBT-Staph/100NG der Untersuchungsgruppen A - D und yon zwei Patienten mit Progressiver Septischer Granulomatose (vgl. Abb. 3)

6. Die Korrelation von Ingestionsindex und Reduktionsindex l~iBt keine Signifikanz der Differenzen der Reduktionsindices der Untersuchungsgruppen B - D zu A erkennen. Bei vergleichbarer Ingestion erfolgt die NBT-Reduktion der NG h/imatologisch gesunder Personen unabhfingig yon dens Vorliegen von Infektionen und der Art der die Infektion ausl6senden Erreger. Bei Zugrundelegung des Ingestionsindex zeigen ebenfalts die NG der gesunden Neugeborenen im Ve@eich zu der Untersuchungsgruppe A keine signifikanten Abweichungen des Reduktionsindex (Abb. 3, Tabelle 2 b). 7. In der Untersuchungsgruppe E gelten fiir den Ingestionsindex und den Anteil der an der Ingestion beteiligten NG das unter 1. - 5. ffir hgmatologisch gesunde Personen gesagte (Abb. 2). Erwartungsgem~il3

C. Eschenbach et al. : NBT-Reduktionskapazit~it von neutrophilen Granulocyten

ist bei den Patienten mit Progressiver Septischer Granulomatose der Reduktionsindex in AbNingigkeit von dem Angebot des Phagocytates und in Relation zum Ingestionsindex gegenfiber h~imatologisch gesunder Personen stark vermindert (Abb. 3). Klinisch gesunde Geschwister der Patienten zeigen in allen untersuchten Parametern Werte, die denen hfimatologisch gesunder Personen mit oder ohne Infektionen entsprechen. Aus den Ergebnissen resultieren folgende Aussagen: NG yon Patienten mit akuten bakteriellen Infektionen und von Neugeborenen ingestieren NBT-Staph intensiver als die infektionsfreier Kontrollpersonen und Patienten mit akuten viralen Infektionen. Bei Zugrundelegung vergleichbarer Ingestionsindices der NG hfimatologisch gesunder Personen unterscheiden sich die NBT-Reduktionsindices der NG nicht. Die NBTReduktionskapazit~it der NG ist unabh/ingig yon dem Vorliegen akuter Infektionen und deren Genese wie yon dem Alter des Probanden. Differenzen der NBTReduktion, wie sie zur Differenzierung akuter bakterieller und viraler Infektionen beschrieben wurden, sind durch unterschiedliche Ingestion und nicht durch unterschiedliche Reduktionskapazit/iten der NG bedingt. Eine yon dem Ingestionsindex unabhfingige Verminderung der NBT-Reduktionskapazitfit der NG wird am Beispiel der Progressiven Septischen Granulomatose gezeigt: trotz intensiver Ingestion reduzieren die NG dieser Patienten NBT stark vermindert bzw. nicht. Diskussion

Erstmalig 1953 von Shaffer et al. [49] wurde der NBT-Test zur Prfifung der Digestionsfunktion yon Leukocyten herangezogen und 1966 von Baehner [4] wieder aufgenommen. Zahlreiche Modifikationen wurden seitdem beschrieben. Die Untersuchungen wurden entweder im Vollblut oder der Suspension separierter Leukocyten vorgenommen und entweder mikroskopisch oder spektrophotometrisch ausgewertet. Durch in-vitro-Stimulation der Leukocyten wurde eine deutliche Steigerung der NBT-Positivitfit erreicht. Im Vergleich zu nichtstimulierten Leukocyten [38, 31, 45] zeigen Leukocyten nach Ingestion von Latexpartikeln [56, 6, 27, 44, 25, 20], Z)anosan [33], Candida [42], Pseudomonas aeruginosa [12] oder Escherichia coti [35] signifkant h6here NBT-Positivit/it. Die M6glichkeit einer vonder Ingestion unabh~ngigen in-vitroStimulation der Leukocyten besteht in der Einwirkung von Endotoxin [39, 35, 41]. Eine natfirliche Stimulation der NG stelten oftenbar akute bakterielle Infektionen dar: NG yon Patienten mit akuten bakteriellen Infektionen reduzieren

1053

NBT in signifikant h6herem Mage als die von Patienten mit akuten viralen Infektionen oder von infektfreien Kontrollpersonen. Die Differenzen der NBT-Reduktionswerte wurden zur Erkennung und zur Klfirung der Atiologie yon Infektionen herangezogen [38, 39, 31, 53, 15, 16, 26, 18, 19, 57, 21, 55, 24, 17, 51, 47, 8, 10, 50]. Leukocyten yon gesunden Neugeborenen wurden erstmalig von Park et al. [40] und Cocchi et al. [12, 13] untersucht: innerhalb der ersten 10-20 Lebenstage ist die NBT-Positivit~it von NG gegenfiber infektfreien Kontrollenjenseits des 1. Lebensmonates signifikant gesteigert. Diese Befunde wurden von mehreren Autoren bestfitigt [25, 26, 54, 29, 22, 28]. In diesen Ver6ffentlichungen sind keine Angaben fiber die Ursachen einer Steigerung der NBT-Reduktion der NG yon Neugeborenen gemacht worden. Entsprechend gesteigerte Werte des NBT-Testes wurden yon Ramsdale etal. [43] in NG w~hrend der Gravidit~t beobachtet und als Ausdruck einer immunologischen Reaktion gegen den Foetus gedeutet. Norden et al. [34] bestimmten erh6hte NBT-Reduktionswerte unter dem Einflul3 von Progesteron und Oestrogen, von Arrosmith et al. [1] wurden diese Befunde jedoch nicht bestfitigt. Die zitierten Ver6ffentlichungen zeigen fibereinstimmend, dab NG yon Patienten mit akuten bakteriellen Infektionen und yon Neugeborenen NBT intensiver reduzieren als NG yon infektfreien Kontrollpersonen und Patienten mit viralen Infektionen. Sofern mikroskopische Methoden angewendet wurden, konnte auch gezeigt werden, dab die Zahl der an der NBT-Reduktion beteiligten NG entsprechend dem h6heren NBT-Reduktionswert bei bakteriellen Infektiohen und Neugeborenen erh6ht ist. In diesen Angaben sind jedoch keine Aussagen gemacht, ob die Differenz der Ergebnisse durch eine unterschiedliche NBT-Aufnahme oder eine unterschiedliche NBT-Reduktionskapazitfit der Zellen bedingt ist. Eine Trennung dieser beiden Funktionen ist durch Methoden, die lediglich das Reduktionsprodukt Formazan beurteilen lassen - eine Aussage fiber aufgenommenes, jedoch nicht reduziertes NBT nicht oder nur bedingt zulassen nicht m6glich. Von Grush et al. [23], McCall et al. [9], Park [37], Stossel [51], Miescher [32], Nydegger et al. [35] wurden Hinweise gegeben, dab Alterationen der Zell-Membranen eine Anderung der NBT-Aufnahme und damit sekund~r der NBT-Reduktion bewirken. Die unterschiedlichen Ergebnisse des NBTTestes der Leukocyten h/imatologisch gesunder Personen k6nnen somit m6glicherweise ihre Erklfirung in der durch bestimmte Krankheiten bedingten oder in vitro experimentell erzielten unterschiedlichen NBTAufnahme finden. Vaucher et al. [53] zeigten, dal3 ge-

1054

C. Eschenbach et al. : NBT-Reduktionskapazit~it yon neutrophilen Granulocyten

steigerte NBT-Reduktionswerte bei Krankheiten mit gesteigerter Phagocytose-Aktivit/it (bakterietle Infektionen, Gewebenekrosen) beobachtet v~arden (vgl. [48]). Die yon uns beschriebene Modifikation des Testes ist dadurch charakterisiert, dab NBT an lichtmikroskopisch sichtbare Staphylokokken gekoppelt als Phagocytat verwendet wurde. Durch Bewertung der ingestierten Erreger werden - unabh/ingig vom Reduktionsgrad - quantitative Aussagen selektiv der NBTAufnahme jeder einzelnen Zelle erm6glicht. Die Ffirbung der ingestierten Bakterien - licht- bis dunkelblau bzw. grau-braun - erlaubt eine Bewertung der NBT-Reduktion. Diese Methode erm6glicht also eine getrennte Beurteilung der Ingestion und der NBT-Reduktion der NBT-Staph. Sie erm6glicht damit, dab die Relation der Zahl der NBT-Staph zur Zahl der phagocytierenden Zellen bestimmt und variiert werden kann. Damit wird die Ingestions- und NBT-Reduktionskapazit~it der phagocytierenden Zellen in Abh/ingigkeit von dem Angebot quantitativ beurteilbar. Diese M6glichkeit ist besonders dadurch gegeben, dab im Vergleich zu anderen Methoden die Konzentration des cytotoxisch wirkenden NBT auch bei hohem Angebot des Phagocytates pro phagocytierende Zelle gering ist (z.B. N G = 5 x l 0 6 / m l Vollblut, NBTStaph = 3 x 109/ml Suspension, Relation NBT-Staph: N G = 1 0 0 : I , NBT-Konzentration in 1,5ml Ansatzmenge unter Berticksichtigung des Filtrationsvorganges

[Capacity of nitroblue tetrazolium-reduction of neutrophilic granulocytes (author's transl)].

A modification of the NBT-reaction is described which allows a differentiation of the NBT uptake and NBT-reduction. By means of this method it has bee...
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