Planta (Berl.)130, 105-111 (1976)
Pl~H~) 9 by Springer-Verlag 1976
Bindung von Indolylessigs iure und Phenoxyessigs iure an Fraktionen aus Epikotylen und Wurzeln von Pisum sativum L.* ** Rosemarie D61lst~idt, Klaus Hirschberg, Eckart Winkler und Gerhard Hiibner Akademieder Wissenschaftender DDR, Zentralinstitutfar lsotopen-und Strahlenforschung, Permoserstr. 15, DDR-705 Leipzig,GermanDemocraticRepublic
Binding of Indole Acetic Acid and 2-Methyl-4-Chlorophenoxy Acetic Acid to Fractions from Epicotyles and Roots of Pisum sativum L. Summary. The binding behaviour of 3-indoleacetic acid (IAA) and of (2-methyl-4-chlorophenoxy) acetic acid (MCPA), (2-chlorophenoxy) acetic acid (2-C1-PA) and (4-chlorophenoxy) acetic acid (4-C1-PA) in subcellular fractions of P i s u m epicotyls and roots, which are rich in plasma membranes, has been investigated. Binding parameters are determined by means of centrifugation experiments or equilibrium dialysis using 14C-labelled auxins. The experiments prove the existence of saturable (specific) binding sites and the reversibility of auxin binding. For the binding of IAA and MCPA to the particle fraction the binding constant K > 106 M-1 and the number of the binding sites n - R > 10-1~ M per mg pellet-protein have been estimated. In displacement experiments MCPA or 4-C1-PA displace IAA, whereas IAA can not displace phenoxyacetic derivatives. These results indicate that with concentrations in the range of herbicide action phenoxyacetic acids bind to a site of the auxin receptor which is not identical with the binding site of IAA. In this way the binding affinity of receptor for IAA is decreased allosterically, which results in an apparent displacement of IAA.
Einleitung Die Wirkungsmechanismen yon Auxin und auxinanalogen Verbindungen in pflanzlichen Zellen sind Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Es ist jedoch bisher nicht gelungen, die Prim~irreaktionen bei * Herrn Prof.Dr. K. MothesanlfiBlichder 75. Wiederkehrseines Geburtstages gewidmet ** Abk~rzungen: IAA: fl-Indolylessigs~iure;MCPA: (2-Methyl4-chlorphenoxy)-essigs/iure;2-C1-PA:(2-Chlorphenoxy)-essigsfiure; 4-CI-PA: (4-Chlorphenoxy)-essigs/iure;Tris: Trishydroxyaminomethan; HSA: Humanserumalbumin
der Regulation des Stoffwechsels und des Wachstums der Zelle exakt zu erfassen. Auch Einzelreaktionen in der Wirkkette dieser Phytohormone sind noch weitgehend unklar. Neue Impulse zur Aufkl~irung ihrer molekularen Wirkungsmechanismen gehen von Untersuchungen aus, die analog zu tierischen Systemen die Existenz spezifischer Rezeptoren in der Pflanzenzelle postulieren, die an Membranen oder Zellorganelle gebunden oder m6glicherweise auch im Cytosol vorkommen und Wirkstoffe binden (Lembi und Morr6, 1971 ; Yamada et al., 1971 ; Hertel et al., 1972; Thomson et al., 1973 und 1974). Dabei wird dem Konzept der reversiblen Bindung an den Rezeptor der Vorzug gegeben. Eine beobachtete nichtreversible Bindung an Proteine steht offenbar nicht mit dem Wirkungsmechanismus, sondern mit einer spezifischen Entgiftungsreaktion in Zusammenhang (Zemskaya et al., 1971). Mit der vorliegenden Arbeit werden Untersuchungen der Bindung von IAA und Phenoxyessigs~iureabk6mmlingen an subzellul~ire Fraktionen aus Epikotylen und Wurzeln von P i s u m sativum L. beschrieben, welche das Ziel hatten, Bindungsstellen hoher Affinit~it nachzuweisen und zu charakterisieren. In in vitro-Experimenten wurde durch Lembi und Morr6 (1971), Hertel et al. (1972) und Thomson et al. (1973) bereits nachgewiesen, dab Auxine eine spezifische Bindung mit Plasmamembranen aus Maiskoleoptilen eingehen. Die Autoren schlossen von diesem Befund auf die Lokalisation des Prim~irrezeptors fiir Wuchsstoffe im Plasmalemma. Analogien zu zahlreichen Hormon-Rezeptorstudien an tierischen Geweben, die gleichfalls die Plasmamembran als Ort maximaler Wirkstoffbindung beschreiben, sind erkennbar (Cuatrecasas, 1971 ; Haour und Saxena, 1974; Lacombe und Hanoune, 1974; Verrier et al., 1974).
Konzeption der Bindungsversuche Bei der Annahme einer reversiblen Bindung an einen Rezeptor R mit n gleichwertigen und unabh/ingigen
106
R. D611stidt et al. : Bindung von IAA an Fraktionen
B i n d u n g s s t e l l e n ergibt sich i m F a l l e der schrittweisen A n l a g e r u n g des Wirkstoffes fiir die K o n z e n t r a t i o n des gebundenen Liganden L b (Steinhardt und Reynolds, 1969):
nRKLy Lb ----1 + H i e r bezeichnet K die B i n d u n g s k o n s t a n t e u n d LI die K o n z e n t r a t i o n des freien L i g a n d e n . In d e r Praxis m u g n e b e n d e r i n t e r e s s i e r e n d e n W i r k s t o f f - R e z e p t o r - W e c h s e l w i r k u n g n o c h m i t einer W i r k s t o f f a n l a g e r u n g a n v e r s c h i e d e n e 16sliche P r o t e i n e u n d a n d e r e Z e l l b e s t a n d t e i l e gerechnet werden. A u f G r u n d d e r Vielzahl y o n M e m b r a n - u n d P r o t e i n s t r u k t u r e n in e i n e r subzellul/iren F r a k t i o n ist m i t einer sehr h o h e n Z a h l v o n d e r a r t i g e n B i n d u n g s s t e l l e n zu rechnen, die sich im u n t e r s u c h t e n K o n z e n t r a t i o n s b e r e i c h n i c h t shttigen lassen (Hertel et al., 1972). Dieser B i n d u n g s a n t e i l w i r d d u r c h den S u m m a n d e n C LI b e r i i c k s i c h t i g t :
nRKLf
Lb-I+KL
(11
w o b e i C eine ftir die jeweiligen V e r s u c h s b e d i n g u n g e n giiltige K o n s t a n t e darstellt. D e m n a c h ergibt sich die K o n z e n t r a t i o n des g e b u n d e n e n L i g a n d e n als S u m m e einer ,,spezifischen" u n d einer ,,unspezifischen" Bindung. D i e Existenz einer spezifischen B i n d u n g ist d u r c h Verdr~ingung des g e b u n d e n e n r a d i o a k t i v m a r k i e r t e n Wirkstoffes d u r c h Z u g a b e v o n u n m a r k i e r t e m W i r k s t o f f n a c h w e i s b a r . F a r d i e Verdr~ingung eines L i g a n d e n L A d u r c h einen zweiten L i g a n d e n L B gilt allgemein:
nRKA LAI t- CLAf. LAb= 1 + K A LAf + K B LBf
(2)
I m F a l l e d e r Verdr~ingung eines r a d i o a k t i v m a r k i e r t e n Wirkstoffes L*A d u r c h Z u g a b e des gleichen u n m a r k i e r ten L i g a n d e n L B vereinfacht sich (2) zu
nRKL*f t- C L * s . l~b-- 1 + K ( I ~ f + LBfl
(3)
D a r a u s resultiert fiir die spezifische B i n d u n g bei einer K o n z e n t r a t i o n L* ~ 1/K (wobei bei den v o r l i e g e n d e n V e r s u c h e n L* ~ L * z galt):
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I + K L , A~ (4)
D u r c h A u s g l e i c h s r e c h n u n g ( M e t h o d e d e r kleinsten Q u a d r a t e ) lassen sich die B i n d u n g s k a p a z i t i i t n R sowie K u n d C absch~itzen. D a s v e r w e n d e t e R e c h e n p r o g r a m m (Winkler, 1974) b a s i e r t a u f d e m A l g o r i t h m u s yon Gauss-Newton.
Material und Methoden Anzucht des Pflanzenmaterials Samen von Pisum sativum L. convar, speciosum (Dierb.) Alef. cv. ,,Poneka" wurden 15 hunter fliegendem Leitungswasser gequollen und fiir 80-90 h a u f feuchtes Filterpapier zum Keimen ausgelegt. Die Keimlinge wuchsen bei 85 bis 90 ~iger Luftfeuchtigkeit, 24 ~ und zweistfindiger Rotlichteinwirkung (Filter-Nr. 104, VEB Carl Zeiss Jena) pro Nacht im Dunkelraum. Bei einer Epikotyllhnge yon 3 - 4 cm erfolgte die Aufarbeitung des Pflanzenmaterials.
Pr~paration der Partikelfi'aktion 100 g Epikotyle bzw. Wurzeln wurden in 150 ml Extraktionsmedium (0,6M Saccharose, 80mM Tris, 14raM Mercapto~thanol, 0,1~o Oxytetracyclin und 0,14% Streptomycin) bei einem pH-Wert yon 8,5 im M6rser homogenisiert. Der Extrakt wurde durch feinmaschige Nylongaze gepregt, mittels Essigs~iure auf einen pH-Wert yon 6,3 eingestellt und 20 rain bei 2000 x g in einer Kiihlzentrifuge zentrifugiert. Aus dem l~berstand wurde durch 30minutige Zentrifugation bei 100000 x g die Partikelfraktion erhalten. Alle Arbeitsschritte erfolgten bei 4 ~
Chemikalien 3-Indolyl[2-1*C]essigs/iure wurde mit einer spezifischen Aktivitht yon 54 mCi/mmol (Radiochemical Centre Amersham) eingesetzt. Die Phenoxyessigshuren (MCPA) sowie (2-C1-PA) und (4-C1-PA) wurden nach Hayes und Branch (1943) aus den Phenolen synthetisiert. Die Darstellung der entsprechenden 14C-markierten Phenoxyessigsfiuren erfolgte dutch Umsetzung yon 100gmol [2-14C] Chloressigsgure (Isocommerz GmbH, Berlin-Buch) mit vierfachem Chlorkresol- bzw. ChlorphenoRiberschuB in Natronlauge. Die markierten Wirkstoffe wurden durch Sgulen- und Diinnschichtchromatographie gereinigt und auf radiochemische Reinheit geprtift. Die spezifische Aktivit~it von MCPA betrug 23,2 mCi/mmol, die von 2- bzw. 4-CI-PA 39,5 mCi/mmol. Eine sterile Aufbewahrung siimtlicher Wirkstoffstamml6sungen erwies sich als unbedingt erforderlich, da andernfalls der radioaktive Wirkstoff yon Mikroorganismen rasch aufgenommen und mit diesen in die Partikelfraktionen eingebracht wird, wodurch sich zu hohe Werte fiir die Bindung ergeben.
Dichtegradientenzentrifugation 9,5 ml einer Saccharosel6sung mit linearem Gradienten (5- 50 Saccharose) wurden mit 0,5 ml einer feindispersen Aufschl/immung von 100 mg des 100000 x g Pellets (AufschI~immungin Tris/AcetatPuffer, pH 6,3, mit einer Konzentration yon 10-7M [14C]MCPA) iiberschichtet. Nach 3stiindiger Zentrifugation (8x 10ml Rotor VAC 601, VEB Zentrifugenbau, Leipzig-Engelsdorf) bei 150000 x g und 5 ~ wurden Fraktionen/~ 10 Tropfen in Szintillationskfivetten aufgefangen und nach jeder Fraktion 2 Tropfen zm" refraktometrischen Dichtebestimmung des Gradienten entnommen. Die ~r Messung tier Proben erfolgte in DioxanszintillatorlSsung am TriCarb Szintillationsspektrometer (Packard Instr. Comp., Chicago). Zur Proteingehaltsbestimmung der Fraktionen wurde ein Parallelansatz aus dem gleichen Zentrifugationsexperiment analog aufgetrennt. Die EiweiBbestimmung erfolgte nach Lowry et al. (1951) unter Zusatz von 1 ~ Natriumdodecylsulfat und Verwendung einer HSA-Eichkurve als Bezugsstandard. Trennungen im Gradienten unter Erhaltung der Wirkstoff-Receptorbindung wurden auf [14C] MCPA (10-s M)-haltigem Saccharosegradienten durchgef~hrt.
R. D/511st~idtet al.: Bindung yon IAA an Fraktionen Dichtegradiententrennungen zum Nachweis von Receptorproteinen in der Cytosolfraktion erfolgten ebenfalls auf einem [14C]MCPA (10-SM)-haltigen Saccharosegradienten (0 30%). Far diese Versuche wurden 0,5 ml des 100000 x g-Uberstandes mit radioaktivem Wirkstoff (Endkonzentration 10 -v M) versetzt, auf 9,5 ml der Saccharoseli3sung (linearer Gradient 0 - 3 0 %) geschichtet und bei 5 ~ 20 h bei 150000 x g zentrifugiert. Aktivit~its- und Proteinbestimmungen in den Fraktionen erfolgten in der angegebenen Weise.
Sedimentationsexperimente Der bei 2000 x g vorzentrifugierte Zellextrakt wurde mit den radioaktiv markierten Wirkstoffen IAA (5 x 10-9M bis 10- 8 M), MCPA, 4-C1-PA oder 2-C1-PA (5 x 10-aM bis 10-7M) inkubiert. Zur Ermittlung des Anteils der spezifischen Bindung und zur Untersuchung kompetitiver Bindungseffekte wurden gleichartigen Parallelans~tzen zus~itzlich die jeweiligen unmarkierten Wirkstoffe in Konzentrationsabstufungen von 10 -7 M bis 10-4M zugesetzt. Aus jeweils 5 ml des Inkubationsansatzes wurde der sedimentierbare, gebundene Anteil des radioaktiven Wirkstoffes durch 30minutige Zentrifugation (3 x5 ml Swing out-Rotor, VAC601) bei 100000 x g und 4 ~ abgetrennt. Nach sorgf~ltigem Abgiegen des Uberstands und Entfernen des Fliissigkeitsfilms v o n d e r Zentrifugenbecherwandung wurdeu die Pellets in Dioxan-Szintillator16sung nach Bray aufgenommen und die 14C-Aktivit~ten am Fliissigkeitsszintillationsspektrometer bestimmt. Zu jeder Konzentration wurden mindestens drei Einzelbestimmungen durchgeftihrt. Uber die Pelletgewichte, ihren durchschnittlichen Trockengewichtsanteil (10-11%) und die Aktivitit des IJberstandes des Bindungsansatzes wurde die in der Restfhissigkeit des Pellets gel6ste Aktivitfit berechnet. Dieser Betrag wurde zur Korrektur auf den tats~chlichen Bindungsbetrag jedes Einzelp.e!lets vom jeweiligen Megwert abgezogen. Zur Ermittlung der Uberstandsaktivit~it kamen Probenmengen yon jeweils 0,3 ml zur Messung. Die Bestimmung des pH-Optimums der spezifischen Bindung flit IAA und die Phenoxyessigs~iuren erfolgte im pH-Bereich von 4,5 - 8,0.
Gleichgewichtsdialyse Die Dialyseexperimente wurden in Teflon-Dialysezellen nach Weder und Bickel (1970) durchgefiihrt. Als Membranmaterial diente Visking-Dialysierschlauch (Visking, Union Carbide Corp., Chicago). Die Kammern wurden mit 1 ml Cytosolextrakt (7,5 mg Protein/ml) bzw. einer feindispersen Suspension yon 100 mg Pelletmaterial in 1 ml Extraktionsmedium (pH 6,3) (Receptorseite) und 1 ml einer 2 x 10 7 M ~C-Auxinl6sung in Extraktionsmedium (pH 6,3) (Ligandseite) beschickt. Zur Ermittlung des unspezifischen Bindungsanteils erhielten Vergleichsdialysen zus~itzlich auf der Ligandseite den unmarkierten Wirkstoff in einer Kouzentration von 10 .4 M. Unter st~indigem Rotieren der Dialysezellen bei Zimmertemperatur war eine Einstellung des Verteilungsgleichgewichts des Liganden nach 5 h erreicht. Zur Bestimmung der Wirkstoffkonzentration wurden aus beiden Kammern drei MeBproben/t 300 i11 entnommen und in je 10 ml Szintillatorl6sung eingebracht.
Ergebnisse und Diskussion Aus Homogenaten von Pisum-Epikotylen und -Wurzeln wurde durch differentielle Zentrifugation zwischen 2000 x g und 100000 x g eine Partikelfraktion abgetrennt, die neben Ribosomen und Fragmenten
107 Tabelle 1. Verteilung yon spezifischen Bindungsstellen fiir Auxine in Pisum-Epikotylen Wuchsstoff
IAA MCPA
membranhaltige Fraktion
16sliche Fraktion
spezif. gebundene Radioaktivit~t (cpm)
L*b. 100 L*r
spezif. gebundene Radioaktivitfit (cpm)
L*b 100 L, I
235_+35 110_+40
1,7 2,1
65_+10 30_+15
0,5 0,6
Die Gleichgewichtsdialysen wurden entweder nur mit 14C-markiertern Wirkstoff ( L * f = 2 x l 0 - T M ) oder mit einem Gemisch yon markiertem ( L ' I = 2 x 10 7 M) und inaktivem (LB= 10 .4 M) Wirkstoff durchgefiihrt Die suspendierte Pelletmenge betrug 100mg pro ml Homogenatpuffer (pH 6,3), der Proteingehalt der 16slichen Fraktion entsprach dem Proteingehalt der Pelletsuspension und lag bei 7,5 mg Protein/ml
des ER vorzugsweise Plasmamembranen enthfilt. In Gleichgewichtsdialyseexperimenten mit einer Suspension dieser membranhaltigen Partikelfraktion wurden fiir IAA und MCPA Werte der spezifischen Wirkstoffbindung gefunden, welche die der Bindung an Cytosolproteine vergleichbarer Konzentration um mehr als das Dreifache fibersteigen (Tabelle 1). Diese Dialyseexperimente best~itigen die Reversibilit~it der Auxinbindung. Der Nachweis eines Assoziations-Dissoziationsgleichgewichtes konnte noch anschaulicher bei Versuchen zur Anreicherung spezifisch bindender Zellfraktionen durch Dichtegradientenzentrifugation erbracht werden. Wurde eine mit 14CWirkstoff inkubierte Membranfraktion auf einen Saccharosegradienten geschichtet, so land w~ihrend der Sedimentation des zun~ichst gebildeten WirkstoffRezeptorkomplexes durch den Gradienten infolge des Zurfickbleibens des freien Wirkstoffs eine st~indige StiSrung des Gleichgewichtes statt. Die Diffusion des markierten Wirkstoffs in die umgebende Saccharose16sung ffihrte schlieglich zur vollst~indigen Dissoziation des Komplexes (Aktivit~itsverteilungskurve I, Abb. 1). Bei Zentrifugation der Partikel-gebundenen Wirkstofffraktion durch einen t4C-wirkstoffhaltigen Saccharosegradienten dagegen entsprachen Proteinund Aktivitiitsverteilung einander (Kurve II, Abb. 1). Unter diesen aequilibrierenden Sedimentationsbedingungen bleibt folglich der Komplex erhalten. Es gelang nicht, durch Dichtegradientenzentrifugation eine Partikelfraktion mit erh6hter Bindungskapazit~it abzutrennen. Deshalb wurde ffir alle weiteren Bindungsuntersuchungen der innerhalb yon 30 rain differentiell zwischen 2000 und 100000 x g sedimentierende Anteil des Zellrohhomogenats verwendet. Die Bestimmung der an die Membranfraktion gebundenen Wirkstoffmenge erfolgte fiber Sedimentationsexperimente. Dieses Verfahren ist der Anwendung
108
R. D/511st~idt et al.: Bindung von I A A an Fraktionen
der Gleichgewichtsdialyse zur Ermittlung von Bindungsdaten yon Partikelfraktionen tiberlegen. Die Sedimentationsmethode erfordert einen geringeren Zeitaufwand gestattet deshalb den Nachweis schnell denaturierbarer Bindungsproteine und umgeht die Schwierigkeiten und Fehlerquellen, die sich aus der Ablagerung yon Partikeln auf der Dialysemembran ergeben. g/cm ~
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Abb. 1. Saccharosegradientenzentrifugation einer Auxin-inkubierten Partikelfraktion aus P i s u m - E p i k o t y l e n . - 100 mg des 100000 x g Pellets wurden in 0,5 ml einer gepufferten 10 7 M [14C]MCPAL6sung dispergiert und auf einem Saccharosegradienten (9,5 ml, 5 - 50 ~o) 3 h bei 150000 x g zentrifugiert. Bei Verwendung eines reinen Saccharosegradienten wird der gebundene Wirkstoff w~ihrend der Sedimentation vom Protein getrennt (Aktivit~itsverteilungskurve I, - . . . . . ); enth~ilt der Saccharosegradient [ 1 4 C ] M C P A in einer Konzentration yon 10 8 M, bleibt die Wirkstoffbindung an die Pelletfraktion erhalten (Verteilungskurve II, - . . . . ). Der Proteinverteilungspeak (. . . . . . . . ) beider Gradienten ist identisch, wenn eine Normierung der Fraktion des Versuchs II auf den Dichtegradienten yon I ( ) erfolgt
Die Einstellung des Bindungsgleichgewichtes im Inkubationsansatz ~rfolgt so schnell, dab es nicht gelingt, die zeitliche )knderung der Wirkstoffanlagerung w~ihrend der Inkubation zu verfolgen. Uber einen Zeitraum von 3 h blieb der Anteil gebundenen Wirkstoffs konstant, danach begann die Bindungskapazit~it der Pelletfraktion abzusinken. Die total gebundene Radioaktivit~it steigt mit sinkendem pH-Wert, das Maximum der spezifischen Bindung liegt dagegen zwischen 6,0 und 6,5, da mit abnehmender Dissoziation der Wuchsstoffe unspezifische Anlagerungen stark zunehmen. Bei Bindungsexperimenten zeigen voneinander unabh~ingige Versuchsserien starke Streuungen. Eine Sicherung der Bindungsdaten erfolgte deshalb durch drei- bis ftinffache Wiederholung jedes Einzelexperiments. Durch Abtrennung der Membranfraktion vom Uberstand vor Durchfiihrung der Bindungsexperimente l~ii3t sich die Streuung herabsetzen. Wir fanden diese Verbesserung des Tests, die auch Hertel (1974) im Zusammenhang mit Untersuchungen zur Naphthylessigsiiure-Bindung an Partikelfraktionen aus Maiskoleoptilen beschreibt, nach Abschlul3 vorliegender Experimente bei Versuchen zur Isolierung yon Auxin-bindenden Proteinen aus der Pelletfraktion. Tabelle 2 enth~ilt die im Sedimentationsexperiment gemessenen Bindungsbetriige yon IAA und Phenoxyessigs~iureabk/Smmlingen. Diese bei P i s u m gefundenen Werte entsprechen recht gut den yon Hertel et a1.(1972) beschriebenen spezifischen Anlagerungen yon IAA an Membranfraktionen aus Maiskoleoptilen. Die Abbildungen 2 - 4 enthalten die Versuchsergebnisse, die bei der Untersuchung des kompetitiven Einflusses der vier Auxine auf die Wirkstoff-Proteinbindung erhalten wurden. Ftir die IAA- und MCPA-Anlagerung an P i s u m Partikelfraktionen aus Wurzeln und Epikotylen wurden aus den Resultaten der Abbildungen 2 - 4 die Bin-
Tabelle 2. Bindung yon Auxinen an Membranfraktionen aus Epikotyl- u n d Wurzelabschnitten von P i s u m sativum L. Auxin
IAA MCPA 4-C1-PA 2-C1-PA
Epikotyl gebundene AktivitS.t
L*A~b' 100 L*y
bei 14C-Auxininkubation (cpm)
unter Zusatz inaktiven Auxins (cpm)
520 370 606 762
438 291 483 784
0,2 0,3 0,3 0,0
Wurzel gebundene Aktivit~it
L*Ab 100 L, I
bei 14C-Auxininkubation (cpm)
unter Zusatz inaktiven Auxins (cpm)
1224 331 795 815
1110 253 750 815
0,4 0,3 0,1 0,0
[ 1 4 C] I A A wurde in einer Konzentration v on L *Aj" = 5 • 10- 8 M eingesetzt, die Konzentration der zugesetzten inaktiven I A A betrug L 8 = 10- s M ; die Konzentrationen der Phenoxyessigs~iuren betrugen L*AI=10-TM und L B = 1 0 -4 m. Die Streuung der angegebenen Mittelwerte liegt innerhalb der Fehlerbreite der AktivitMsmessung yon 2,5
R. D6llst~idt et al.: Bindung von I A A an Fraktionen
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Abb. 2. Bindung yon [~4C]IAA an Partikelfraktionen ans P i s u m - E p i k o t y l e n (A) nnd -Wurzeln (B) in Abh~ingigkeit von unmarkierten Auxi-
n e n . - Der vorzentrifugierte Zellextrakt aus Koleoptilen bzw. Wurzeln wurde mit ~4C-markierter I A A (10 .8 M) inkubiert. Die auf der Abszisse angegebenen Konzentrationen der inaktiven Wirkstoffe wurden in aliquoten Teilen des Inkubationsansatzes eingestellt. Der gebundene Anteil der markierten I A A wurde nach Sedimentation bei 100 000 x g bestimmt (s. Material und Methoden). Die Differenz der Kurvenanfangswerte (unbeeinflul3te ~4C-Wirkstoffbindung) erkl~irt sich aus den unterschiedlichen Bindungseigenschaften voneinander unabh~ingiger Zellaufschliisse. Jeder M e g p u n k t resultiert aus drei Einzelbestimmungen
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Abb. 3. Bindung von [ 1 4 C ] M C P A (5-10 .8 M) an Partikelfraktionen aus P i s u m - E p i k o t y l e n (A) und -Wurzeln (B). - Die Versuchsdurchfiihrung erfolgte analog zur Bestimmung der IAA-Bindung (vgl. Abb. 2)
dungskonstante K zu > 106 M -1 und die Zahl der Bindungspl~itze n-R > 10 -13 mol pro mg Pelletprotein abgeschiitzt. Da mit der zur Verftigung stehenden spezifischen Aktivit~it der Wirkstoffe nur bei Ligandkonzentrationen L f > 1/K gearbeitet werden konnte, ist eine genauere Bestimmung von K und n R nicht m6glich. Die Bindungskonstanten k/3nnen um ein bis zwei Gr613enordnungen h6her sein als der angegebene Wert. Hervorzuheben ist der Befund, dab das Verdr~ingungsexperiment das synthetische Auxin M C P A als Konkurrenten des nativen Hormons ausweist (Ver-
dr~ingung der IAA dutch MCPA), w~ihrend umgekehrt IAA nicht in der Lage ist, M C P A vom Bindungsort zu 16sen. Ein solches Verhalten im Verdr~ingungsexperiment ist zu erwarten, wenn M C P A und IAA an die gleiche Receptorregion binden, jedoch KMCPA wesentlich gr613er als KIAA ist. Da 4-C1-PA sich andererseits trotz geringerer Bindungsaffinit/it analog zum M C P A verh/ilt, ist eine Konkurrenz um den gleichen Bindungsplatz in Frage zu stellen. Die Ergebnisse lassen sich jedoch durch die Annahme erkl~iren, dal3 die Phenoxy-
110
R. D611st~idt et al. : B i n d u n g von I A A a n F r a k t i o n e n
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Pl~H~) 9 by Springer-Verlag 1976
Bindung von Indolylessigs iure und Phenoxyessigs iure an Fraktionen aus Epikotylen und Wurzeln von Pisum sativum L.* ** Rosemarie D61lst~idt, Klaus Hirschberg, Eckart Winkler und Gerhard Hiibner Akademieder Wissenschaftender DDR, Zentralinstitutfar lsotopen-und Strahlenforschung, Permoserstr. 15, DDR-705 Leipzig,GermanDemocraticRepublic
Binding of Indole Acetic Acid and 2-Methyl-4-Chlorophenoxy Acetic Acid to Fractions from Epicotyles and Roots of Pisum sativum L. Summary. The binding behaviour of 3-indoleacetic acid (IAA) and of (2-methyl-4-chlorophenoxy) acetic acid (MCPA), (2-chlorophenoxy) acetic acid (2-C1-PA) and (4-chlorophenoxy) acetic acid (4-C1-PA) in subcellular fractions of P i s u m epicotyls and roots, which are rich in plasma membranes, has been investigated. Binding parameters are determined by means of centrifugation experiments or equilibrium dialysis using 14C-labelled auxins. The experiments prove the existence of saturable (specific) binding sites and the reversibility of auxin binding. For the binding of IAA and MCPA to the particle fraction the binding constant K > 106 M-1 and the number of the binding sites n - R > 10-1~ M per mg pellet-protein have been estimated. In displacement experiments MCPA or 4-C1-PA displace IAA, whereas IAA can not displace phenoxyacetic derivatives. These results indicate that with concentrations in the range of herbicide action phenoxyacetic acids bind to a site of the auxin receptor which is not identical with the binding site of IAA. In this way the binding affinity of receptor for IAA is decreased allosterically, which results in an apparent displacement of IAA.
Einleitung Die Wirkungsmechanismen yon Auxin und auxinanalogen Verbindungen in pflanzlichen Zellen sind Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Es ist jedoch bisher nicht gelungen, die Prim~irreaktionen bei * Herrn Prof.Dr. K. MothesanlfiBlichder 75. Wiederkehrseines Geburtstages gewidmet ** Abk~rzungen: IAA: fl-Indolylessigs~iure;MCPA: (2-Methyl4-chlorphenoxy)-essigs/iure;2-C1-PA:(2-Chlorphenoxy)-essigsfiure; 4-CI-PA: (4-Chlorphenoxy)-essigs/iure;Tris: Trishydroxyaminomethan; HSA: Humanserumalbumin
der Regulation des Stoffwechsels und des Wachstums der Zelle exakt zu erfassen. Auch Einzelreaktionen in der Wirkkette dieser Phytohormone sind noch weitgehend unklar. Neue Impulse zur Aufkl~irung ihrer molekularen Wirkungsmechanismen gehen von Untersuchungen aus, die analog zu tierischen Systemen die Existenz spezifischer Rezeptoren in der Pflanzenzelle postulieren, die an Membranen oder Zellorganelle gebunden oder m6glicherweise auch im Cytosol vorkommen und Wirkstoffe binden (Lembi und Morr6, 1971 ; Yamada et al., 1971 ; Hertel et al., 1972; Thomson et al., 1973 und 1974). Dabei wird dem Konzept der reversiblen Bindung an den Rezeptor der Vorzug gegeben. Eine beobachtete nichtreversible Bindung an Proteine steht offenbar nicht mit dem Wirkungsmechanismus, sondern mit einer spezifischen Entgiftungsreaktion in Zusammenhang (Zemskaya et al., 1971). Mit der vorliegenden Arbeit werden Untersuchungen der Bindung von IAA und Phenoxyessigs~iureabk6mmlingen an subzellul~ire Fraktionen aus Epikotylen und Wurzeln von P i s u m sativum L. beschrieben, welche das Ziel hatten, Bindungsstellen hoher Affinit~it nachzuweisen und zu charakterisieren. In in vitro-Experimenten wurde durch Lembi und Morr6 (1971), Hertel et al. (1972) und Thomson et al. (1973) bereits nachgewiesen, dab Auxine eine spezifische Bindung mit Plasmamembranen aus Maiskoleoptilen eingehen. Die Autoren schlossen von diesem Befund auf die Lokalisation des Prim~irrezeptors fiir Wuchsstoffe im Plasmalemma. Analogien zu zahlreichen Hormon-Rezeptorstudien an tierischen Geweben, die gleichfalls die Plasmamembran als Ort maximaler Wirkstoffbindung beschreiben, sind erkennbar (Cuatrecasas, 1971 ; Haour und Saxena, 1974; Lacombe und Hanoune, 1974; Verrier et al., 1974).
Konzeption der Bindungsversuche Bei der Annahme einer reversiblen Bindung an einen Rezeptor R mit n gleichwertigen und unabh/ingigen
106
R. D611stidt et al. : Bindung von IAA an Fraktionen
B i n d u n g s s t e l l e n ergibt sich i m F a l l e der schrittweisen A n l a g e r u n g des Wirkstoffes fiir die K o n z e n t r a t i o n des gebundenen Liganden L b (Steinhardt und Reynolds, 1969):
nRKLy Lb ----1 + H i e r bezeichnet K die B i n d u n g s k o n s t a n t e u n d LI die K o n z e n t r a t i o n des freien L i g a n d e n . In d e r Praxis m u g n e b e n d e r i n t e r e s s i e r e n d e n W i r k s t o f f - R e z e p t o r - W e c h s e l w i r k u n g n o c h m i t einer W i r k s t o f f a n l a g e r u n g a n v e r s c h i e d e n e 16sliche P r o t e i n e u n d a n d e r e Z e l l b e s t a n d t e i l e gerechnet werden. A u f G r u n d d e r Vielzahl y o n M e m b r a n - u n d P r o t e i n s t r u k t u r e n in e i n e r subzellul/iren F r a k t i o n ist m i t einer sehr h o h e n Z a h l v o n d e r a r t i g e n B i n d u n g s s t e l l e n zu rechnen, die sich im u n t e r s u c h t e n K o n z e n t r a t i o n s b e r e i c h n i c h t shttigen lassen (Hertel et al., 1972). Dieser B i n d u n g s a n t e i l w i r d d u r c h den S u m m a n d e n C LI b e r i i c k s i c h t i g t :
nRKLf
Lb-I+KL
(11
w o b e i C eine ftir die jeweiligen V e r s u c h s b e d i n g u n g e n giiltige K o n s t a n t e darstellt. D e m n a c h ergibt sich die K o n z e n t r a t i o n des g e b u n d e n e n L i g a n d e n als S u m m e einer ,,spezifischen" u n d einer ,,unspezifischen" Bindung. D i e Existenz einer spezifischen B i n d u n g ist d u r c h Verdr~ingung des g e b u n d e n e n r a d i o a k t i v m a r k i e r t e n Wirkstoffes d u r c h Z u g a b e v o n u n m a r k i e r t e m W i r k s t o f f n a c h w e i s b a r . F a r d i e Verdr~ingung eines L i g a n d e n L A d u r c h einen zweiten L i g a n d e n L B gilt allgemein:
nRKA LAI t- CLAf. LAb= 1 + K A LAf + K B LBf
(2)
I m F a l l e d e r Verdr~ingung eines r a d i o a k t i v m a r k i e r t e n Wirkstoffes L*A d u r c h Z u g a b e des gleichen u n m a r k i e r ten L i g a n d e n L B vereinfacht sich (2) zu
nRKL*f t- C L * s . l~b-- 1 + K ( I ~ f + LBfl
(3)
D a r a u s resultiert fiir die spezifische B i n d u n g bei einer K o n z e n t r a t i o n L* ~ 1/K (wobei bei den v o r l i e g e n d e n V e r s u c h e n L* ~ L * z galt):
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9
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I + K L , A~ (4)
D u r c h A u s g l e i c h s r e c h n u n g ( M e t h o d e d e r kleinsten Q u a d r a t e ) lassen sich die B i n d u n g s k a p a z i t i i t n R sowie K u n d C absch~itzen. D a s v e r w e n d e t e R e c h e n p r o g r a m m (Winkler, 1974) b a s i e r t a u f d e m A l g o r i t h m u s yon Gauss-Newton.
Material und Methoden Anzucht des Pflanzenmaterials Samen von Pisum sativum L. convar, speciosum (Dierb.) Alef. cv. ,,Poneka" wurden 15 hunter fliegendem Leitungswasser gequollen und fiir 80-90 h a u f feuchtes Filterpapier zum Keimen ausgelegt. Die Keimlinge wuchsen bei 85 bis 90 ~iger Luftfeuchtigkeit, 24 ~ und zweistfindiger Rotlichteinwirkung (Filter-Nr. 104, VEB Carl Zeiss Jena) pro Nacht im Dunkelraum. Bei einer Epikotyllhnge yon 3 - 4 cm erfolgte die Aufarbeitung des Pflanzenmaterials.
Pr~paration der Partikelfi'aktion 100 g Epikotyle bzw. Wurzeln wurden in 150 ml Extraktionsmedium (0,6M Saccharose, 80mM Tris, 14raM Mercapto~thanol, 0,1~o Oxytetracyclin und 0,14% Streptomycin) bei einem pH-Wert yon 8,5 im M6rser homogenisiert. Der Extrakt wurde durch feinmaschige Nylongaze gepregt, mittels Essigs~iure auf einen pH-Wert yon 6,3 eingestellt und 20 rain bei 2000 x g in einer Kiihlzentrifuge zentrifugiert. Aus dem l~berstand wurde durch 30minutige Zentrifugation bei 100000 x g die Partikelfraktion erhalten. Alle Arbeitsschritte erfolgten bei 4 ~
Chemikalien 3-Indolyl[2-1*C]essigs/iure wurde mit einer spezifischen Aktivitht yon 54 mCi/mmol (Radiochemical Centre Amersham) eingesetzt. Die Phenoxyessigshuren (MCPA) sowie (2-C1-PA) und (4-C1-PA) wurden nach Hayes und Branch (1943) aus den Phenolen synthetisiert. Die Darstellung der entsprechenden 14C-markierten Phenoxyessigsfiuren erfolgte dutch Umsetzung yon 100gmol [2-14C] Chloressigsgure (Isocommerz GmbH, Berlin-Buch) mit vierfachem Chlorkresol- bzw. ChlorphenoRiberschuB in Natronlauge. Die markierten Wirkstoffe wurden durch Sgulen- und Diinnschichtchromatographie gereinigt und auf radiochemische Reinheit geprtift. Die spezifische Aktivit~it von MCPA betrug 23,2 mCi/mmol, die von 2- bzw. 4-CI-PA 39,5 mCi/mmol. Eine sterile Aufbewahrung siimtlicher Wirkstoffstamml6sungen erwies sich als unbedingt erforderlich, da andernfalls der radioaktive Wirkstoff yon Mikroorganismen rasch aufgenommen und mit diesen in die Partikelfraktionen eingebracht wird, wodurch sich zu hohe Werte fiir die Bindung ergeben.
Dichtegradientenzentrifugation 9,5 ml einer Saccharosel6sung mit linearem Gradienten (5- 50 Saccharose) wurden mit 0,5 ml einer feindispersen Aufschl/immung von 100 mg des 100000 x g Pellets (AufschI~immungin Tris/AcetatPuffer, pH 6,3, mit einer Konzentration yon 10-7M [14C]MCPA) iiberschichtet. Nach 3stiindiger Zentrifugation (8x 10ml Rotor VAC 601, VEB Zentrifugenbau, Leipzig-Engelsdorf) bei 150000 x g und 5 ~ wurden Fraktionen/~ 10 Tropfen in Szintillationskfivetten aufgefangen und nach jeder Fraktion 2 Tropfen zm" refraktometrischen Dichtebestimmung des Gradienten entnommen. Die ~r Messung tier Proben erfolgte in DioxanszintillatorlSsung am TriCarb Szintillationsspektrometer (Packard Instr. Comp., Chicago). Zur Proteingehaltsbestimmung der Fraktionen wurde ein Parallelansatz aus dem gleichen Zentrifugationsexperiment analog aufgetrennt. Die EiweiBbestimmung erfolgte nach Lowry et al. (1951) unter Zusatz von 1 ~ Natriumdodecylsulfat und Verwendung einer HSA-Eichkurve als Bezugsstandard. Trennungen im Gradienten unter Erhaltung der Wirkstoff-Receptorbindung wurden auf [14C] MCPA (10-s M)-haltigem Saccharosegradienten durchgef~hrt.
R. D/511st~idtet al.: Bindung yon IAA an Fraktionen Dichtegradiententrennungen zum Nachweis von Receptorproteinen in der Cytosolfraktion erfolgten ebenfalls auf einem [14C]MCPA (10-SM)-haltigen Saccharosegradienten (0 30%). Far diese Versuche wurden 0,5 ml des 100000 x g-Uberstandes mit radioaktivem Wirkstoff (Endkonzentration 10 -v M) versetzt, auf 9,5 ml der Saccharoseli3sung (linearer Gradient 0 - 3 0 %) geschichtet und bei 5 ~ 20 h bei 150000 x g zentrifugiert. Aktivit~its- und Proteinbestimmungen in den Fraktionen erfolgten in der angegebenen Weise.
Sedimentationsexperimente Der bei 2000 x g vorzentrifugierte Zellextrakt wurde mit den radioaktiv markierten Wirkstoffen IAA (5 x 10-9M bis 10- 8 M), MCPA, 4-C1-PA oder 2-C1-PA (5 x 10-aM bis 10-7M) inkubiert. Zur Ermittlung des Anteils der spezifischen Bindung und zur Untersuchung kompetitiver Bindungseffekte wurden gleichartigen Parallelans~tzen zus~itzlich die jeweiligen unmarkierten Wirkstoffe in Konzentrationsabstufungen von 10 -7 M bis 10-4M zugesetzt. Aus jeweils 5 ml des Inkubationsansatzes wurde der sedimentierbare, gebundene Anteil des radioaktiven Wirkstoffes durch 30minutige Zentrifugation (3 x5 ml Swing out-Rotor, VAC601) bei 100000 x g und 4 ~ abgetrennt. Nach sorgf~ltigem Abgiegen des Uberstands und Entfernen des Fliissigkeitsfilms v o n d e r Zentrifugenbecherwandung wurdeu die Pellets in Dioxan-Szintillator16sung nach Bray aufgenommen und die 14C-Aktivit~ten am Fliissigkeitsszintillationsspektrometer bestimmt. Zu jeder Konzentration wurden mindestens drei Einzelbestimmungen durchgeftihrt. Uber die Pelletgewichte, ihren durchschnittlichen Trockengewichtsanteil (10-11%) und die Aktivitit des IJberstandes des Bindungsansatzes wurde die in der Restfhissigkeit des Pellets gel6ste Aktivitfit berechnet. Dieser Betrag wurde zur Korrektur auf den tats~chlichen Bindungsbetrag jedes Einzelp.e!lets vom jeweiligen Megwert abgezogen. Zur Ermittlung der Uberstandsaktivit~it kamen Probenmengen yon jeweils 0,3 ml zur Messung. Die Bestimmung des pH-Optimums der spezifischen Bindung flit IAA und die Phenoxyessigs~iuren erfolgte im pH-Bereich von 4,5 - 8,0.
Gleichgewichtsdialyse Die Dialyseexperimente wurden in Teflon-Dialysezellen nach Weder und Bickel (1970) durchgefiihrt. Als Membranmaterial diente Visking-Dialysierschlauch (Visking, Union Carbide Corp., Chicago). Die Kammern wurden mit 1 ml Cytosolextrakt (7,5 mg Protein/ml) bzw. einer feindispersen Suspension yon 100 mg Pelletmaterial in 1 ml Extraktionsmedium (pH 6,3) (Receptorseite) und 1 ml einer 2 x 10 7 M ~C-Auxinl6sung in Extraktionsmedium (pH 6,3) (Ligandseite) beschickt. Zur Ermittlung des unspezifischen Bindungsanteils erhielten Vergleichsdialysen zus~itzlich auf der Ligandseite den unmarkierten Wirkstoff in einer Kouzentration von 10 .4 M. Unter st~indigem Rotieren der Dialysezellen bei Zimmertemperatur war eine Einstellung des Verteilungsgleichgewichts des Liganden nach 5 h erreicht. Zur Bestimmung der Wirkstoffkonzentration wurden aus beiden Kammern drei MeBproben/t 300 i11 entnommen und in je 10 ml Szintillatorl6sung eingebracht.
Ergebnisse und Diskussion Aus Homogenaten von Pisum-Epikotylen und -Wurzeln wurde durch differentielle Zentrifugation zwischen 2000 x g und 100000 x g eine Partikelfraktion abgetrennt, die neben Ribosomen und Fragmenten
107 Tabelle 1. Verteilung yon spezifischen Bindungsstellen fiir Auxine in Pisum-Epikotylen Wuchsstoff
IAA MCPA
membranhaltige Fraktion
16sliche Fraktion
spezif. gebundene Radioaktivit~t (cpm)
L*b. 100 L*r
spezif. gebundene Radioaktivitfit (cpm)
L*b 100 L, I
235_+35 110_+40
1,7 2,1
65_+10 30_+15
0,5 0,6
Die Gleichgewichtsdialysen wurden entweder nur mit 14C-markiertern Wirkstoff ( L * f = 2 x l 0 - T M ) oder mit einem Gemisch yon markiertem ( L ' I = 2 x 10 7 M) und inaktivem (LB= 10 .4 M) Wirkstoff durchgefiihrt Die suspendierte Pelletmenge betrug 100mg pro ml Homogenatpuffer (pH 6,3), der Proteingehalt der 16slichen Fraktion entsprach dem Proteingehalt der Pelletsuspension und lag bei 7,5 mg Protein/ml
des ER vorzugsweise Plasmamembranen enthfilt. In Gleichgewichtsdialyseexperimenten mit einer Suspension dieser membranhaltigen Partikelfraktion wurden fiir IAA und MCPA Werte der spezifischen Wirkstoffbindung gefunden, welche die der Bindung an Cytosolproteine vergleichbarer Konzentration um mehr als das Dreifache fibersteigen (Tabelle 1). Diese Dialyseexperimente best~itigen die Reversibilit~it der Auxinbindung. Der Nachweis eines Assoziations-Dissoziationsgleichgewichtes konnte noch anschaulicher bei Versuchen zur Anreicherung spezifisch bindender Zellfraktionen durch Dichtegradientenzentrifugation erbracht werden. Wurde eine mit 14CWirkstoff inkubierte Membranfraktion auf einen Saccharosegradienten geschichtet, so land w~ihrend der Sedimentation des zun~ichst gebildeten WirkstoffRezeptorkomplexes durch den Gradienten infolge des Zurfickbleibens des freien Wirkstoffs eine st~indige StiSrung des Gleichgewichtes statt. Die Diffusion des markierten Wirkstoffs in die umgebende Saccharose16sung ffihrte schlieglich zur vollst~indigen Dissoziation des Komplexes (Aktivit~itsverteilungskurve I, Abb. 1). Bei Zentrifugation der Partikel-gebundenen Wirkstofffraktion durch einen t4C-wirkstoffhaltigen Saccharosegradienten dagegen entsprachen Proteinund Aktivitiitsverteilung einander (Kurve II, Abb. 1). Unter diesen aequilibrierenden Sedimentationsbedingungen bleibt folglich der Komplex erhalten. Es gelang nicht, durch Dichtegradientenzentrifugation eine Partikelfraktion mit erh6hter Bindungskapazit~it abzutrennen. Deshalb wurde ffir alle weiteren Bindungsuntersuchungen der innerhalb yon 30 rain differentiell zwischen 2000 und 100000 x g sedimentierende Anteil des Zellrohhomogenats verwendet. Die Bestimmung der an die Membranfraktion gebundenen Wirkstoffmenge erfolgte fiber Sedimentationsexperimente. Dieses Verfahren ist der Anwendung
108
R. D/511st~idt et al.: Bindung von I A A an Fraktionen
der Gleichgewichtsdialyse zur Ermittlung von Bindungsdaten yon Partikelfraktionen tiberlegen. Die Sedimentationsmethode erfordert einen geringeren Zeitaufwand gestattet deshalb den Nachweis schnell denaturierbarer Bindungsproteine und umgeht die Schwierigkeiten und Fehlerquellen, die sich aus der Ablagerung yon Partikeln auf der Dialysemembran ergeben. g/cm ~
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Abb. 1. Saccharosegradientenzentrifugation einer Auxin-inkubierten Partikelfraktion aus P i s u m - E p i k o t y l e n . - 100 mg des 100000 x g Pellets wurden in 0,5 ml einer gepufferten 10 7 M [14C]MCPAL6sung dispergiert und auf einem Saccharosegradienten (9,5 ml, 5 - 50 ~o) 3 h bei 150000 x g zentrifugiert. Bei Verwendung eines reinen Saccharosegradienten wird der gebundene Wirkstoff w~ihrend der Sedimentation vom Protein getrennt (Aktivit~itsverteilungskurve I, - . . . . . ); enth~ilt der Saccharosegradient [ 1 4 C ] M C P A in einer Konzentration yon 10 8 M, bleibt die Wirkstoffbindung an die Pelletfraktion erhalten (Verteilungskurve II, - . . . . ). Der Proteinverteilungspeak (. . . . . . . . ) beider Gradienten ist identisch, wenn eine Normierung der Fraktion des Versuchs II auf den Dichtegradienten yon I ( ) erfolgt
Die Einstellung des Bindungsgleichgewichtes im Inkubationsansatz ~rfolgt so schnell, dab es nicht gelingt, die zeitliche )knderung der Wirkstoffanlagerung w~ihrend der Inkubation zu verfolgen. Uber einen Zeitraum von 3 h blieb der Anteil gebundenen Wirkstoffs konstant, danach begann die Bindungskapazit~it der Pelletfraktion abzusinken. Die total gebundene Radioaktivit~it steigt mit sinkendem pH-Wert, das Maximum der spezifischen Bindung liegt dagegen zwischen 6,0 und 6,5, da mit abnehmender Dissoziation der Wuchsstoffe unspezifische Anlagerungen stark zunehmen. Bei Bindungsexperimenten zeigen voneinander unabh~ingige Versuchsserien starke Streuungen. Eine Sicherung der Bindungsdaten erfolgte deshalb durch drei- bis ftinffache Wiederholung jedes Einzelexperiments. Durch Abtrennung der Membranfraktion vom Uberstand vor Durchfiihrung der Bindungsexperimente l~ii3t sich die Streuung herabsetzen. Wir fanden diese Verbesserung des Tests, die auch Hertel (1974) im Zusammenhang mit Untersuchungen zur Naphthylessigsiiure-Bindung an Partikelfraktionen aus Maiskoleoptilen beschreibt, nach Abschlul3 vorliegender Experimente bei Versuchen zur Isolierung yon Auxin-bindenden Proteinen aus der Pelletfraktion. Tabelle 2 enth~ilt die im Sedimentationsexperiment gemessenen Bindungsbetriige yon IAA und Phenoxyessigs~iureabk/Smmlingen. Diese bei P i s u m gefundenen Werte entsprechen recht gut den yon Hertel et a1.(1972) beschriebenen spezifischen Anlagerungen yon IAA an Membranfraktionen aus Maiskoleoptilen. Die Abbildungen 2 - 4 enthalten die Versuchsergebnisse, die bei der Untersuchung des kompetitiven Einflusses der vier Auxine auf die Wirkstoff-Proteinbindung erhalten wurden. Ftir die IAA- und MCPA-Anlagerung an P i s u m Partikelfraktionen aus Wurzeln und Epikotylen wurden aus den Resultaten der Abbildungen 2 - 4 die Bin-
Tabelle 2. Bindung yon Auxinen an Membranfraktionen aus Epikotyl- u n d Wurzelabschnitten von P i s u m sativum L. Auxin
IAA MCPA 4-C1-PA 2-C1-PA
Epikotyl gebundene AktivitS.t
L*A~b' 100 L*y
bei 14C-Auxininkubation (cpm)
unter Zusatz inaktiven Auxins (cpm)
520 370 606 762
438 291 483 784
0,2 0,3 0,3 0,0
Wurzel gebundene Aktivit~it
L*Ab 100 L, I
bei 14C-Auxininkubation (cpm)
unter Zusatz inaktiven Auxins (cpm)
1224 331 795 815
1110 253 750 815
0,4 0,3 0,1 0,0
[ 1 4 C] I A A wurde in einer Konzentration v on L *Aj" = 5 • 10- 8 M eingesetzt, die Konzentration der zugesetzten inaktiven I A A betrug L 8 = 10- s M ; die Konzentrationen der Phenoxyessigs~iuren betrugen L*AI=10-TM und L B = 1 0 -4 m. Die Streuung der angegebenen Mittelwerte liegt innerhalb der Fehlerbreite der AktivitMsmessung yon 2,5
R. D6llst~idt et al.: Bindung von I A A an Fraktionen
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Abb. 2. Bindung yon [~4C]IAA an Partikelfraktionen ans P i s u m - E p i k o t y l e n (A) nnd -Wurzeln (B) in Abh~ingigkeit von unmarkierten Auxi-
n e n . - Der vorzentrifugierte Zellextrakt aus Koleoptilen bzw. Wurzeln wurde mit ~4C-markierter I A A (10 .8 M) inkubiert. Die auf der Abszisse angegebenen Konzentrationen der inaktiven Wirkstoffe wurden in aliquoten Teilen des Inkubationsansatzes eingestellt. Der gebundene Anteil der markierten I A A wurde nach Sedimentation bei 100 000 x g bestimmt (s. Material und Methoden). Die Differenz der Kurvenanfangswerte (unbeeinflul3te ~4C-Wirkstoffbindung) erkl~irt sich aus den unterschiedlichen Bindungseigenschaften voneinander unabh~ingiger Zellaufschliisse. Jeder M e g p u n k t resultiert aus drei Einzelbestimmungen
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Abb. 3. Bindung von [ 1 4 C ] M C P A (5-10 .8 M) an Partikelfraktionen aus P i s u m - E p i k o t y l e n (A) und -Wurzeln (B). - Die Versuchsdurchfiihrung erfolgte analog zur Bestimmung der IAA-Bindung (vgl. Abb. 2)
dungskonstante K zu > 106 M -1 und die Zahl der Bindungspl~itze n-R > 10 -13 mol pro mg Pelletprotein abgeschiitzt. Da mit der zur Verftigung stehenden spezifischen Aktivit~it der Wirkstoffe nur bei Ligandkonzentrationen L f > 1/K gearbeitet werden konnte, ist eine genauere Bestimmung von K und n R nicht m6glich. Die Bindungskonstanten k/3nnen um ein bis zwei Gr613enordnungen h6her sein als der angegebene Wert. Hervorzuheben ist der Befund, dab das Verdr~ingungsexperiment das synthetische Auxin M C P A als Konkurrenten des nativen Hormons ausweist (Ver-
dr~ingung der IAA dutch MCPA), w~ihrend umgekehrt IAA nicht in der Lage ist, M C P A vom Bindungsort zu 16sen. Ein solches Verhalten im Verdr~ingungsexperiment ist zu erwarten, wenn M C P A und IAA an die gleiche Receptorregion binden, jedoch KMCPA wesentlich gr613er als KIAA ist. Da 4-C1-PA sich andererseits trotz geringerer Bindungsaffinit/it analog zum M C P A verh/ilt, ist eine Konkurrenz um den gleichen Bindungsplatz in Frage zu stellen. Die Ergebnisse lassen sich jedoch durch die Annahme erkl~iren, dal3 die Phenoxy-
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R. D611st~idt et al. : B i n d u n g von I A A a n F r a k t i o n e n
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