Beiträge aus der Hämatologie
p-Thalassämie:
Molekulare Pathogenese und klinische Variabilität A. E. Kulozik Abteilung Pädiatrie ll, Universität Ulm
Zusammenfassung
Das klinische Bild der homozygoten ßThalassämie zeichnet sich bei den meisten Patienten durch eine transfusionsbedürftige Anämie aus. Dennoch findet sich bei diesem Krankheitsbild eine erhebliche klinische Variabilität, dessen Spektrum von diesem schweren Verlauf bis zur fast vollständigen Symptomfreiheit mit nur minimalen hämatologischen Veränderungen reicht. Biochemisch findet sich eine reduzierte oder fehlende ß-Globinkettensynthese in den erythroiden Verläuferzellen des Knochenmarks, die zum relativen Überschuß von unlöslichen a-Globinketten und zur Dyserythropoese führt. Die molekulare Basis dieser Erkrankung ist überaus variabel und geht auf eine Vielzahl von unterschiedlichen Mutationen des ß-Globingens zurück. Diese Mutationen können die Genexpression auf allen Stufen ihres Weges von der DNA zum reifen Hämoglobin beeinträchtigen. Das klinische Erscheinungsbild wird wesentlich vom Typ der ererbten Mutationen bestimmt. Zusätzlich kann das Ausmaß des pathogenetisch wesentlichen a-Globinkettenüberschusses beeinflußt werden durch die Mitvererbung einer a-Thalassämie sowie von Mutationen, die zur hereditären Persistenz fetaler Hämoglobinsynthese (HPFH) führen. Dieser Übersichtsartikel beschäftigt sich mit den Zusammenhängen zwischen dem molekularen Defekt und der klinischen Expression des Krankheitsbildes bei Patienten mit ß-Thalassämie.
Einleitung
Die ß-Thalassämie ist weltweit einer der häufigsten Einzelgendefekte, an der etwa ISO Millionen Menschen im Mittelmeerraum, in Westafrika und weiten Teilen Asiens erkrankt sind (54). Der Zuzug von Menschen aus diesen Regionen nach Nordwesteuropa hat auch hier die Zahl der Thalassämie-Patienten sowie die Anforderungen an medizinische und insbesondere an pädiatrische Einrichtungen stark erhöht. Die meisten homozygoten Patienten leiden an einer schwersten transfusionsbedürftigen Anämie, die sich meist innerhalb der ersten beiden Lebensjahre manifestiert. Später stehen die langfristigen Komplikationen der Eisenüberladung im Vordergrund (Thalassaemia major). Klin. Pädiatr. 203 (1991) 276-283 ce' 1991 F. Enke Verlag Stuttgart
p-Thalassaemia: Molecular Pathogenesis and Clinical Variability
Clinically, homozygous ß-thalassaemia is characterised by a severe anaemia requiring regular transfusion therapy in most patients. However, there is a marked clinical variability ranging from this severe picture to the virtual absence of symptoms and haematological abnormalities. Biochemically, ß-globin synthesis in the erythroid precursors of the bone marrow is reduced or absent resulting in a relative excess of insoluble a-globin chains and dyserythropoiesis. The molecular genetics of this disorder is highly variable involving a multitude of different mutations of the ß-globin gene. These mutations can inactivate gene expression at all levels on its way from DNA to mature haemoglobin. The clinical picture is largely determined by the type of mutations inherited. Additionally the degree of a-globin chain excess can be influenced by the co-inheritance of a-thalassaemia or mutations resulting in the hereditary persistence of fetal globin synthesis (HPFH). This review discusses the relationship between the molecular defect and the clinical picture of patients with ß-thalassaemia.
Heterozygote Personen sind meist asymptomatisch. Hämatologisch findet sich eine leichte bis mäßige Anämie mit einer ausgeprägten Hypochromie und Mikrozytose (Thalassaemia minor). Bei vielen Patienten findet sich jedoch ein breites Spektrum des klinischen Schweregrades, der zwischen dem der Thalassaemia minor und der major Form variieren kann (Thalassaemia intermedia). Diese klinische Variabilität läßt sich meist durch eine exakte Definition der molekularen Pathologie erklären.
Struktur und Ontogenese des Hämoglobins
Hämoglobin ist ein tetrameres Protein, das aus zwei Globinkettenpaaren mit einem Gesamtmolekulargewicht von 64000 besteht. Die Globinketten des normalen adulten Hämoglobins (HbA) bestehen aus 141 (rx-
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ß-Thalassämie: Molekulare Pathogenese und klinische Variabilität
Klin. Pädiatr. 203 (1991)
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PATHOPHYSIOLOGIE DER 8 THALASSÄMIE -~
..
a
ß
/
r---··------,
•. I.L
,
.1
~
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a 2 12
F_
HbF HbF·Zell Selektion
Präzipitation
+
Dyaerythropoeae
I
Anämie
Globin) bzw. aus 146 (ß-Globin) Aminosäuren. Jede der vier Untereinheiten ist kovalent an das Ferro-Protoporphyrin Häm gebunden. Die Bindung der Untereinheiten miteinander erfolgt durch van der Waals und durch Wasserstoffbrückenbindungen. Die Quaternärstruktur des Proteins kann entweder fest (T-Form) oder lockerer (RForm) sein. Die T-Form wird durch CO 2, Protonen oder 2, 3-Diphosphoglycerat stabilisiert, wogegen sich die RForm präferentiell in der Gegenwart von Sauerstoff ausbildet (4). Alle humanen Hämoglobine haben diese tetramere Grundstruktur von zwei Globinkettenpaaren, dienen als Sauerstofftransporter und zeigen eine allosterische Konformationsänderung bei der Bindung von Sauerstoff. Dennoch werden während der embryonalen, der fetalen und der postnatal/adulten Phase der Entwicklung unterschiedliche Globinketten synthetisiert. Die embryonalen Hämoglobine, Gower 1, Gower 2 und Portland sind Tetramere des a- oder der a-ähnlichen ~-Ketten und der ß-ähnlichen E- und y-Ketten. Das fetale Hämoglobin (HbF) besteht aus zwei a- und zwei y-Ketten (a2 Y2) (54). Die embryonalen Hämoglobine werden von der 3. bis zur 8. Gestationswoche und HbF danach bis zur Geburt produziert. Postnatal wird das fetale Hämoglobin fast vollständig durch HbA (a2 ß2) und in geringer Menge auch durch HbA 2 (a2 Ih) ersetzt. Diese ontogenetischen molekularen Schaltvorgänge werden wahrscheinlich vermittelt durch eine Interaktion zwischen genetischen Kontrollelementen in den Promotoren der individuellen Globingene und einer Steuerregion, die die Aktivität des gesamten Genlokus reguliert (Abb. 1) (3, 11, 14, 16).
Pathophysiologie der
P-Thalassämie
Der grundlegende biochemische Defekt bei der ß-Thalassämie ist das Fehlen der ß-Globinsynthese in den erythroiden Vorläuferzellen des Knochenmarks. Der
Abb. 2 Schematische Darstellung der Pathogenese der ßThalassämie (aus: Hentze, Kulozlk, Bartram. Einführung in die medizinische Molekularbiologie. Springer 19901
Mangel an Substrat führt somit zu einer schlechten Hämoglobinisierung der Erythrozyten und daher zur Anämie. Die hämatologischen Befunde bei heterozygoten Überträgern ist somit durch die typische Hypochromie und Mikrozytose charakterisiert. Bei homozygoten Patienten ist die normale Erythropoese nicht nur durch den Mangel an ß-Globin, sondern auch durch den relativen Überschuß an a-Globin gestört. Die überschüssigen aGlobinketten, die nicht zu HbA gebunden werden können, sind schlecht löslich, fallen in den erythroiden Vorläuferzellen des Knochenmarks aus und führen zum Zelltod und zur Dyserythropoese (54). Das Verständnis der Mechanismen für die beobachtete klinische Variabilität des Krankheitsbildes wird durch eine Vergegenwärtigung dieser grundlegenden Pathophysiologie erleichtert (Abb. 2). Ein relativ mildes klinisches Bild der homozygoten ßThalassämie sieht man somit, wenn 1. die Restaktivität des ß-Globingens hoch ist, 2. der Mangel an ß-Ketten durch eine Persistenz von y-Globinketten-Synthese kompensiert, oder 3. der Überschuß an a-Ketten durch eine gleichzeitig vererbte a- Thalassämie vermindert wird (Tabelle 1).
Tab. 1
Die molekulare Ätiologie der ß Thalassaemia interme-
dia Homozygote ß Thalassämie Vererbung von einer oder zwei ß . , Thalassämie-Mutationen Vererbung von HPFH-Mutationen Vererbung von a- Thalassämie-Mutationen Heterozygote ß Thalassämie Vererbung von zusätzlichen a-Globlngenen
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Abb. 1 Der ß-Globingenkomplex mit dem embryonalen e, den fetalen V und den adulten 6- und ß-Globingenen. Die Regulation der Genexpression hängt von einer Wechselwirkung zWischen den lokalen Promotoren (PI und der Lokus-KontrollRegion (LCR) mit ihren 4 Nuklease-hypersensitiven Stellen 1-4 auf der 5 'Seite des Genkomplexes ab. Während der fetalen Phase der Entwicklung konkurriert die fetale Funktionseinheit effektiver um die LCR-Wlrkung als die adulte FunktionseInheit, während sich dieses VerhältniS postnatal umkehrt. Durch das Konkurrenzverhältnis zwischen den fetalen und adulten Promotoren um die LCR-Wirkung kommt es zum perinatalen Schalten von der HbF zur HbA und HbArSynthese
Klin. Pädiatr. (/99/) Molekulare Anatomie und Physiologie des p-Globingenkomplexes Das ß-Globingen ist ein kleines Gen von nur 1,6 kb, das nur einmal im haploiden Chromosomensatz vorkommt (single copy). Es liegt zusammen mit den anderen ß-ähnlichen Globingenen (E, Gy and A y und 15) in einem 60 kb-Genkomplex auf dem kurzen Arm des Chromosoms ll (llpl5) (4). Die codierende Information aller Globingene findet sich auf drei Exons, die durch 2 Introns von im wesentlichen unbekannter Funktion voneinander getrennt sind. Der "Kopf" und der "Schwanz" des ersten bzw. des dritten Exons bestehen aus nicht translatierten Sequenzen, die wahrscheinlich eine Rolle spielen bei der RNA-Reifung, der RNA-Stabilität und bei der Proteinsynthese. Die Regulation der Genaktivität wird durch den sogenannten Promotor vermittelt, der unmittelbar 5', vom Transkriptionsbeginn liegt (Cap-Stelle). Diese Steuerregion enthält vier besonders wichtige Elemente, die entsprechend ihrer Nukleotidsequenz benannt werden. Das der Cap-Stelle am nächsten liegende Element ist die sogenannte ATAAA-Box, das die Stelle der Transkriptionsinitiation determiniert und absolut essentiell für die Genfunktion ist. Weiter 5' finden sich eine CAAT- und ein Paar von CACCC-Boxen, die die Effizienz der Transkription erhöhen (4, 23). Zusätzlich zu diesen lokalen Regulationselementen befindet sich 6-18 kb 5' vom E-Globingen eine Region, die die Expression des gesamten ß-Globingenkomplexes während der ontogenetischen Entwicklung kontrolliert. Entsprechend dieser Funktion spricht man hier von der Lokus-Kontroll-Region (LCR). Die LCR besteht aus 4 Elementen, die in erythroiden Zellen ganz besonders empfindlich für einen in vitro Nuklease-Verdau sind. Diese Eigenschaft spiegelt vermutlich die Verfügbarkeit dieser Region für Transkriptionsfaktoren in vivo wieder (Abb. I) (36). Der erste Schritt der Genexpression umfaßt die Transkription der DNA in die Vorläufer-RNA (preRNA). Dies erfordert die Bindung verschiedener Transkriptionsfaktoren an den Promotor und an die LCR. Das Transkript wird sofort nach seiner Entstehung an seinem 5'-Ende modifiziert, wo ein methyliertes Guanosin (cap) angefügt wird. Am 3 '-Ende wird eine Reihe von Adenosin-Resten (poly-A Schwanz) angehängt. Diese Reaktion wird durch das sogenannte Poly-A Signal vermittelt, das ungefähr 25 Basenpaare 5' von der TranskriptionsterminationssteIle liegt (4). Die in der preRNA noch enthaltenen Introns werden durch das Zusammenspleißen der Exons entfernt, so daß die reife mRNA entsteht. Die Genauigkeit dieser Reaktion ist von größter Wichtigkeit, da auch schon Fehler von nur einem Nukleotid eine Verschiebung des Leserasters während der Translation bewirken. Der Spleißmechanismus erfordert Signalsequenzen an der 5' (Donor) und an der 3' (Akzeptor) Exon/Intron-Grenze und ebenso innerhalb der Introns. Diese Signalsequenzen wurden im Laufe der Evolution konserviert und werden daher als Konsensus-Sequenzen bezeichnet. Der Konsensus an der Donorspleißstelle besteht aus 9 Nukleotiden, von denen 3 im Exon und 6 im Intron liegen. An Position I und 2 eines Introns findet sich fast immer ein GT-Dinucleotid (splice junction), wogegen die anderen Nukleotide
A. E. Kulozik des Konsensus weniger stringent konserviert und variabler sind. Der Konsensus der Akzeptor-Spleißstelle besteht aus einem regelmäßig vorkommenden AG-Dinucleotid am 3' Ende des Introns und einem weniger stringent konservierten Pyrimidin an Position - 3. Der Spleißprozeß ist ein Dreischritt-Mechanismus, der durch einen Ribonukleoprotein-Komplex, das Spleißeosom vermittelt wird (31). Im ersten Schritt wird das 5' Ende des Introns vom davorliegenden Exon abgesetzt. Im 2. Schritt wird das freie 5' Ende an ein Adenin ungefähr 25 Basenpaare 5' vom 3' Ende des Introns angesetzt. Im 3. Schritt wird das 3' Ende des Introns vom nächsten Exon abgesetzt und die beiden Exons zusammen ligiert. Das Intron wird dabei in einer Lassoform freigesetzt und innerhalb des Zellkerns abgebaut. Die gereifte mRNA wird dann in das Zytoplasma transportiert, wo sie entsprechend dem genetischen Code in Protein translatiert wird.
Molekulare Pathologie der p-Thalassämie Die Expression des ß-Globingens kann an jedem Schritt ihres Weges von der DNA zum Protein durch mehr als 100 bekannte Mutationen inaktiviert werden und so eine ß-Thalassämie hervorrufen (Tabelle 2). 1. DNA-Ebene. Wenn das ß-Globingen ganz oder teilweise deletiert ist, fehlt dem betroffenen Chromosom natürlich die genetische Information für die Synthese von ß-Globin (ß 0_ Thalassämie). Das klinische Bild hängt von der Aktivität der benachbarten y-Globingene und somit der HbF-Synthese ab. Kleine Deletionen erhöhen die HbF-Produktion meist nur unwesentlich oder gar nicht und verursachen im homozygoten Zustand ein klinisch schwer verlaufendes Krankheitsbild. Dagegen verursachen größere Deletionen oft eine hereditäre Persistenz fetaler Hämoglobinsynthese (HPFH) und somit einen milden Phänotyp (siehe unten) (4).
2. Transkriptions-Ebene. Die effiziente Bindung von Transkriptionsfaktoren erfordert einen intakten Promotor. Punktmutationen der ATAAA- oder CACCC-boxen führen zu einer verminderten Effizienz der Transkription. Die Restaktivität des betroffenen Gens ist meist allerdings recht hoch (20-50070) und der Phänotyp relativ mild (23). Die Transkription eines strukturell normalen ß-Globin-Gens kann auch gestört sein, wenn die Nuklease-hypersensitiven Stellen 2-4 des LCR 5' vom E-Globingen deletiert sind (7, 10, 14, 50, 51). Eine isolierte Deletion der LCR-Stelle I scheint sich dagegen funktionell nicht auszuwirken (22). 3. Ebene der RNA-Verarbeitung. Mutationen der Cap-Stelle oder des Poly-A-Signals stören vermutlich die RNA-Stabilität, die Effizienz der weiteren RNAVerarbeitung und der Protein-Synthese. Eine A -+ C-Mutation der Cap-Stelle führt zu einem milden klinischen Phänotyp mit einer Restaktivität des betroffenen ß-Globingens von etwa 50% (34, 56). Mutationen des Poly-A Signals führen zu einer Restaktivität des ß-Globingens von 10-20% und zu einem relativ milden klinischen Bild der Sichelzell-ß-Thalassämie (37). Für eine bedeutsame klini-
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Durch ß Thalassämiemutatlonen gestörte Schritte der GenexpressIon . Beim ß° Phänotyp gibt es keine Restaktivität des beim ß' Phänotyp ist die RestaktivItät für eine klinisch bedeutsame Wirkung zu klein. Beim ß + . Phänotyp findet sich oft ein mildes klinisches Bild Tab. 2
ß GlobIngens,
Betroffene Ebene der Genexpression
Mutationstyp
DNA
Deletion
Transkription
Phänotyp
Mutation von Promotor-Elementen Deletion der 5' LCR Elemente 2-4
RNA Verarbeitung Capping
Cap-Stelle Mutation
Spleißen
Mutationen der Splice junction
Polyadenyllerung
ß' , ßO
Mutationen der weniger stringent konservierten Konsensus Sequenzen
ß+
oder
ß+
Entstehung pathologischer Konsensus-Sequenzen
ß'
oder
ßO
Mutationen des Poly-A Signals
ß+
+
Frameshift-Mutatlonen
Translation
Nonsense Mutationen
Gen-Produkt
instabile
ß Globinketten
ß ' , autosomal dominant vererbte ß Thalassaemie
5
1
234
58
7 5
1
1I I
II
I1
9,10,11
1,10,11
7
5
8
I
I
I 9,10,11
Abb. 3 Schematische Darstellung eines ß Globingens mit der Position der verschiedenen Mutationstypen 1 Deletion der LCR. 2 Mutationen des Promotors. 3: Mutation der Capstelle. 4: Mutation des Initiationscodons. 5 Mutationen der spllce junctlons. 6. Mutationen des Spleißkonsensus. 7: Entstehung pathologischer Konsensussequenzen 8. Mutationen des Poly-A Signals. 9: Nonsense Mutationen. 10: Frameshift Mutationen. 11: Missense Mutationen instabiler ß Globinketten. Die codierenden Bereiche des Gens Sind als schwarze Balken, die 5' und 3 'UTRs als weiße Balken und die Introns sowie flankierenden Sequenzen als Linie dargestellt. LCR = Lokus Kontrol Region. P = Promotor
sche Wirkung bei der homozygoten ß-Thalassämie scheint dies jedoch nicht auszureichen, da Patienten mit doppelter Heterozygotie für eine solche Poly-A Signal-Mutation und eine andere ß + -Thalassämie-Mutation wie etwa die an Position IVSI-11O oder IVS2-745 (siehe unten) an einer transfusionsabhängigen Thalassaemia major leiden (18, 21).
Nicht ganz so nachteilig wirken sich Mutationen der anderen Nukleotide des Konsensus aus und führen zur ß + Thalassämie (48). Eine hohe Restaktivität des ß-GlobinGens mit einem eindeutigen klinischen Nutzen findet sich bei den G-+A und T-+C-Mutationen an Position 5 bzw. 6 des ersten Introns (lVSI-5 G-+A, IVSI-6 T-+C) (26, 28, 48, 53).
Bevor RNA vom Zellkern in das Zytoplasma gelangt, werden die Introns aus dem Primärtranskript entfernt, so daß die reife mRNA mit zusammengespleißten Exons entsteht. Als Signalsequenzen dienen hier die sogenannten Donor- und Akzeptor-Spleißkonsensus Nukleotide. Ein Mutationstyp stört das normale Spleißen durch eine Änderung dieser physiologischen KonsensusSequenzen. Wenn die hochkonservierten GT / AG Nukleotide an den splice junctions betroffen sind, kommt es zum völligen Funktionsverlust des Gens (ß 0- Thalassämie) (48).
Bei einem anderen Mutationstyp entstehen neue Spleißkonsensus-Sequenzen, die zu einer abnormen RNA- Verarbeitung führen. Häufige Beispiele sind die G-+ A und die C -+G-Mutationen an Position 110 des I. Introns (IVSI-11O G-+A) oder 745 des 2. lntrons (IVS2 745 C-+G). Die IVSI-11O G-+A Mutation verändert die normale TTGG-Sequenz an dieser Position zu TTAG, die identisch mit der physiologischen Spleißakzeptor-Stelle 20 Basen-Paare weiter 3' ist. Mehr als 90070 der pre RNA werden an diesem pathologischen Signal gespleißt, was zu
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Inltlations-Codon-Mutation
Klin. Pädiatr. (1991)
einer schweren Form der ß + -Thalassämie führt (43, 55). Analog dazu entsteht durch die IVS2-745 C--->G-Mutation eine pathologische GT-Spleiß-Donorsequenz, die präferentiell für die preRNA-Verarbeitung genutzt wird und so zu einer schweren Form der ß + -Thalassämie führt (48). Letztlich können pathologische Spleißsignalsequenzen auch durch Mutationen in den codierenden Sequenzen entstehen. Beispiele sind hier das HbE und das Hb Knossos, bei denen durch eine Veränderung der Aminosäuresequenz eine Hb-Anomalie einerseits und durch die Störung des Spleißmechanismus ein thalassämischer Phänotyp andererseits entsteht (4). 4. Translationsebene. Die genetische Information der ß-Globin mRNA wird entsprechend dem genetischen Code in Aminosäuresequenz translatiert, d. h. 3 Nukleotide codieren für eine Aminosäure. Die Codons UAA, UAG und UGA signalisieren dabei das Ende der Protein-Synthese (Stopcodons). Pathologische Stopcodons können durch Basensubstitutionen (Nonsense-Mutation) oder durch Deletionen und Insertionen einzelner Nukleotide entstehen, die das normale Leseraster verschieben (Frameshift-Mutationen) (17). Nonsense und FrameshiftMutationen inaktivieren das ß-Globingen vollständig (ß 0_ Thalassämie), und homozygot betroffene Patienten leiden gewöhnlich an einer schweren transfusionsbedürftigen Thalassaemia major. 5. Posttranslationale Ebene. Einige der Mutationen, die die Aminosäuresequenz verändern (Missense-Mutationen) führen zu einer ausgeprägten Instabilität der ß-Globinkette, die schon im Knochenmark abgebaut wird, bevor sie sich mit ex-Globin zu einem funktionellen HbA-Molekül verbinden kann (1). Andere Mutationen führen zur Synthese instabiler ß-Globinketten, die in den erythroiden Vorläuferzellen nicht abgebaut werden können, in den Erythrozyten ausfallen und so eine Einschluß-Körper-ß-Thalassämie hervorrufen. Ein besonderes Merkmal dieser seltenen Form der ß-Thalassämie ist ihr autosomal dominanter Erbgang (45). Die bei der homozygoten ß-Thalassämie beobachtete klinische Variabilität kann somit zum Teil dadurch erklärt werden, daß die verschiedenen ß-Thalassämie-Mutationen die Genexpression unterschiedlich stark stören. Relativ milde Formen der homozygoten ß Thalassämie sieht man, wenn die Expression des ß-Globingens durch Mutationen des Promotors, der Cap-Stelle oder der weniger stringent konservierten Nukleotide des Spleißkonsensus gestört ist.
Geographische Verteilung der häufigen Thalassämie-Mutationen Obwohl heute mehr als 100 ß-ThalassämieMutationen bekannt sind, findet sich bei den meisten Patienten der betroffenen ethnischen Gruppen eine sehr viel geringere Zahl (Tabelle 3). So macht die Codon 39 C--->T Nonsense-Mutation in Sardinien etwa 95010 aller ß-Thalassämie-Gene aus. Die Genetik anderer Bevölkerungsgruppen ist nicht ganz so homogen, aber 10 Mutationen oder weniger finden sich bei mehr als 90% aller Thalassämiegene der meisten ethnischen Gruppen. Diese relativ
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ein fache Populations-Genetik erleichtert das genetische Screening und die Pränataldiagnose. Die Mutationsspektren der verschiedenen Gruppen unterscheiden sich untereinander allerdings erheblich, was auch manche der klinischen Unterschiede erklärt. So finden sich bei westafrikanischen Patienten häufig Promotor-Mutationen und somit relativ milde klinische Verläufe. Ebenso gibt es bei Patienten des östlichen Mittelmeerraumes häufig die milde Spleißmutante IVS 1-6 T--->C, die das nicht seltene Vorkommen der homozygoten ß-Thalassaemia intermedia in dieser Gegend erklärt.
Wechselwirkungen mit anderen genetischen Defekten Der relative Überschuß ungebundener und unlöslicher ex-Globin ketten ist der zentrale pathophysiologische Faktor bei der homozygoten ß-Thalassämie (Abb. 2). So erklärt sich auch die klinische Bedeutung von Veränderungen der y- oder der ex-Globingenexpression. Die Auswirkungen einer mitvererbten exThalassämie bei einer homozygoten ß-Thalassämie hängen im wesentlichen von dem Typ des molekularen ex-G1obingen-Defektes ab (15). Der normale ex-Globingenkomplex befindet sich an der Spitze des kurzen Arms von Chromosom 16 und enthält 2 fast identische und eng gekoppelte ex-Globingene (ex2 und ex1). Normale Personen haben daher 4 ex-Globingene (exex/exex). Die ex-Thalassämie wird meistens durch Deletionen eines oder beider ex-Globingene verursacht (ex + - oder ex 0_ Thalassämie). Personen mit einer durch Deletionen verursachten ex-Thalassämie haben somit 3, heterozygote ex + -Thalassämie (-ex/exex); 2, homozygote ex + -Thalassämie (-ex/-ex) oder heterozygote exo-Thalassämie (--/exex); 1, doppelt heterozygote exo/ex'Thalassämie (--/-ex); oder keine ex-Globingene (--/---), ein Krankheitsbild, das mit einem längeren postnatalen Leben nicht vereinbar ist. Bei Patienten mit einer homozygoten ß-Thalassämie und dem --I -ex-Genotyp findet sich eine schwere Mikrozytose und meist eine transfusionsbedürftige Thalassaemia major oder aber auch eine Thalassaemia intermedia (12, 30). Homozygote ß-Thalassämie-Patienten mit einem -ex/-ex oder einem --I exex Genotyp leiden gewöhnlich an einer Thalassaemia intermedia, wogegen der -ex/ exex Genotyp meist keine bedeutende klinische Rolle spielt (19, 39, 49, 52). Bei einigen Patienten mit einer hohen Restaktivität der ß-Globingene kann sich allerdings sogar eine heterozygote ex + - Thalassämie merklich positiv auf den Krankheitsverlauf auswirken (eigene unveröffentlichte Beobachtungen). Die erythroiden Vorläuferzellen von Personen mit einer heterozygoten ß-Thalassämie kompensieren den relativen ex-Globin-Überschuß vermutlich durch proteolytischen Abbau dieser Globinketten. Bei einigen Patienten mit 5 oder 6 ex-Globingenen ist dieses System jedoch überfordert. Es kommt hier zu einer klinisch merklichen Dyserythropoese und den Symptomen der Thalassaemia intermedia (25, 41, 44). Wenn keine ß-Globinketten zur Verfügung stehen, kann sich ex-Globin mit y-Globin zu HbF verbin-
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ß-Thalassämie: Molekulare Pathogenese und klinische Variabilität Geographische Heterogenität der molekularen Anatomie der
Land Literatur
Anzahl der Mutationen von ~ 90% aller ß Thalassämie Allele
Italien Sardinien (40) Sizilien (8)
3
Griechenland 1201
7
1
ß Thalassämle Häufigste Allele
1%)
Codon 39 non sense Codon 39 non sense IVSl-6 T--+C IVS1-110 G--+A
(95) (35) (29) 126)
IVS1-ll0 G--+A Codon 39 nonsense IVS1-l G--+A
(42) (171 (13)
Jugoslawien (9)
10
IVS1-ll0 G--+A IVS 1-6 T--+C IVS1-l G--+A
Bulgarien 138)
10
IVS1-ll0 G--+A Codon 39 nonsense IVS2-745 C--+G IVSl-6T--+C
(45) (191 111 I (24) 1221 (10) (10)
Türkei 135)
10
IVS1-ll0 G--+A IVS 1-6 T--+C IVS2-1 G--+A
(391 (181 112)
Zypern (42)
4
IVS1-ll0 G--+A IVS1-l G--+A
(70) (121
Libanon (5)
6
IVS1-ll0 G--+A
162)
Amerik. Schwarze
6
-29 A--+G -88 C--+T
(21)
(55)
Indien 1461
6
IVSl-5 G--+C 619 bp Deletion Codon 8/9 frameshift IVS1-l G--+T Codon 41/42 frameshift
(221 (22) (20) (141 (121
Malaysien (57)
8
IVSl-5 G--+C Hb-Malay Codon 41/42 frameshlft
Indonesien 129)
8
IVSl-5 G--+C HbE IVS2-654 C--+T
(49) (151 1101 (44) (181 (101
Süd-China 158)
5
Codon 41/42 frameshift IVS2-654 C--+T -28 A--+G Codon 17 nonsense
Spanien (2)
3
Codon 39, nonsense IVS 1-6 T--+C
(46) (19) (11 I 1101 (64) (151
Portugal 16)
4
Codon 39 nonsense IVS1-l G--+A IVS 1-110 G--+A
(531 1321 1101
den. Bei der homozygoten ß-Thalassämie ist das relative HbF wegen des selektiven Überlebensvorteils von F-Zellen immer erhöht (54). Wenn die y-Globin-Genexpression und somit die y-Globinkettensynthese allerdings postnatal persistiert, können die überschüssigen a-Globinketten abtitriert werden, was zu einem milden Verlauf der homozygoten ß-Thalassämie führt. Die klinische Auswirkung bei einer solchen hereditären Persistenz fetaler Globinsynthese (HPFH) hängt wesentlich von dessen molekularer Basis ab. Es gibt zwei Mutationstypen, die zu einer erhöhten yGlobingenexpression führen. (I) DNA-Deletionen, die das ß-Globingen und mehr oder weniger von dessen flankierenden Sequenzen betreffen und (2) Punktmutationen der y-Globingen-Promotoren. Abhängig von dem genauen molekularen Defekt findet sich bei manchen Patienten mit einer homozygoten ß-Thalassämie und einer gleichzeitig
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bestehenden HPFH ein fast normales hämatologisches Bild oder aber auch ein thalassämischer Phänotyp unterschiedlicher Ausprägung (4). Der genaue Mechanismus, durch den Deletionen des ß-Globingen-Komplexes die Expression der yGlobingene beeinflussen können, ist nicht bekannt. Gute Daten gibt es jedoch für zwei sich möglicherweise ergänzende Hypothesen. (I) Bei einem kompetitiven Synergismus zwischen dem ß-LCR einerseits und den fetalen oder adulten Globingenpromotoren andererseits (Abb. I) entfiele bei den Deletionen der ö- und ß-Globingene der adulte Konkurrent, so daß es zu einer erhöhten Expression der fetalen Globingene kommen kann (3, 11). (2) Große Deletionen von Sequenzen in der Nachbarschaft des ß-Globingenes könnten den Abstand zwischen den y-Globingenen
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Tab. 3
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Klin. Pädiatr. (/991)
und Enhancer-Elementen auf der 3' Seite des ß-Globingens verkürzen und somit eine Wirkung dieser verstärkenden Regulatorsequenzen auf die y-Globingene ermöglichen.
A. E. Kulozik
R
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Die Punktmutationen der y-Globingenpromotoren entfalten ihre Wirkung vermutlich durch eine Erhöhung der Affinität für die Bindung von Transkriptionsfaktoren oder durch eine Veränderung der dreidimensionalen Verhältnisse nach der Bindung dieser Faktoren (32, 33). Dabei gibt es unterschiedliche Auswirkungen der verschiedenen Mutationen. Während sich bei einigen ein HbF zwischen 20% und 30% bei Heterozygoten und eine fast normale Hämatologie bei Patienten mit einer homozygoten ß-Thalassämie findet (4), entfalten andere eine hämatologisch/klinisch merkliche Wirkung erst, wenn ein deutlicher erythroider Streß vorliegt. Die Vererbung solcher weniger stark wirksamen Mutationen kann aber dennoch zu einer erheblichen Abmilderung des klinischen Bildes einer homozygoten ß-Thalassämie oder auch einer homozygoten Sichelzellerkrankung führen (24, 27, 47).
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Schlußbemerkung
Die beobachtete klinische Variabilität der ß-Thalassämie erklärt sich einerseits durch die Heterogenität der pathologischen Veränderungen des ß-Globingenkomplexes. Andererseits zeigt sich, daß die klinische Ausprägung dieses "monogenen" Erbganges nicht nur von dem Defekt des ß-Globingens selbst, sondern auch von genetischen Einflüssen abhängt, die von den (X- und den yGlobingenen ausgehen. Als praktische Konsequenz ergibt sich aus dem verbesserten Verständnis der molekularen Pathologie der ß-Thalassämie die Möglichkeit einer sehr spezifischen Diagnostik sowie für ein selektives genetisches Screening und für die pränatale Krankheitserkennung. Außerdem richten sich intensive Bemühungen auf die Verbesserung der Behandlung von Patienten durch die Entwicklung einer tragfähigen Strategie für die somatische Gentherapie. Es wird allerdings einige Zeit dauern, bevor diese Option für den Pädiater am Krankenbett verfügbar sein wird.
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Dr. med. A. E. Kulozik, PhD Universitäts-Kinder klinik Abteilung Pädiatrie II Prittwitzstr. 43 7900 Ulm
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Klin. Pädiatr. 203 (1991)
p-Thalassämie:
Molekulare Pathogenese und klinische Variabilität A. E. Kulozik Abteilung Pädiatrie ll, Universität Ulm
Zusammenfassung
Das klinische Bild der homozygoten ßThalassämie zeichnet sich bei den meisten Patienten durch eine transfusionsbedürftige Anämie aus. Dennoch findet sich bei diesem Krankheitsbild eine erhebliche klinische Variabilität, dessen Spektrum von diesem schweren Verlauf bis zur fast vollständigen Symptomfreiheit mit nur minimalen hämatologischen Veränderungen reicht. Biochemisch findet sich eine reduzierte oder fehlende ß-Globinkettensynthese in den erythroiden Verläuferzellen des Knochenmarks, die zum relativen Überschuß von unlöslichen a-Globinketten und zur Dyserythropoese führt. Die molekulare Basis dieser Erkrankung ist überaus variabel und geht auf eine Vielzahl von unterschiedlichen Mutationen des ß-Globingens zurück. Diese Mutationen können die Genexpression auf allen Stufen ihres Weges von der DNA zum reifen Hämoglobin beeinträchtigen. Das klinische Erscheinungsbild wird wesentlich vom Typ der ererbten Mutationen bestimmt. Zusätzlich kann das Ausmaß des pathogenetisch wesentlichen a-Globinkettenüberschusses beeinflußt werden durch die Mitvererbung einer a-Thalassämie sowie von Mutationen, die zur hereditären Persistenz fetaler Hämoglobinsynthese (HPFH) führen. Dieser Übersichtsartikel beschäftigt sich mit den Zusammenhängen zwischen dem molekularen Defekt und der klinischen Expression des Krankheitsbildes bei Patienten mit ß-Thalassämie.
Einleitung
Die ß-Thalassämie ist weltweit einer der häufigsten Einzelgendefekte, an der etwa ISO Millionen Menschen im Mittelmeerraum, in Westafrika und weiten Teilen Asiens erkrankt sind (54). Der Zuzug von Menschen aus diesen Regionen nach Nordwesteuropa hat auch hier die Zahl der Thalassämie-Patienten sowie die Anforderungen an medizinische und insbesondere an pädiatrische Einrichtungen stark erhöht. Die meisten homozygoten Patienten leiden an einer schwersten transfusionsbedürftigen Anämie, die sich meist innerhalb der ersten beiden Lebensjahre manifestiert. Später stehen die langfristigen Komplikationen der Eisenüberladung im Vordergrund (Thalassaemia major). Klin. Pädiatr. 203 (1991) 276-283 ce' 1991 F. Enke Verlag Stuttgart
p-Thalassaemia: Molecular Pathogenesis and Clinical Variability
Clinically, homozygous ß-thalassaemia is characterised by a severe anaemia requiring regular transfusion therapy in most patients. However, there is a marked clinical variability ranging from this severe picture to the virtual absence of symptoms and haematological abnormalities. Biochemically, ß-globin synthesis in the erythroid precursors of the bone marrow is reduced or absent resulting in a relative excess of insoluble a-globin chains and dyserythropoiesis. The molecular genetics of this disorder is highly variable involving a multitude of different mutations of the ß-globin gene. These mutations can inactivate gene expression at all levels on its way from DNA to mature haemoglobin. The clinical picture is largely determined by the type of mutations inherited. Additionally the degree of a-globin chain excess can be influenced by the co-inheritance of a-thalassaemia or mutations resulting in the hereditary persistence of fetal globin synthesis (HPFH). This review discusses the relationship between the molecular defect and the clinical picture of patients with ß-thalassaemia.
Heterozygote Personen sind meist asymptomatisch. Hämatologisch findet sich eine leichte bis mäßige Anämie mit einer ausgeprägten Hypochromie und Mikrozytose (Thalassaemia minor). Bei vielen Patienten findet sich jedoch ein breites Spektrum des klinischen Schweregrades, der zwischen dem der Thalassaemia minor und der major Form variieren kann (Thalassaemia intermedia). Diese klinische Variabilität läßt sich meist durch eine exakte Definition der molekularen Pathologie erklären.
Struktur und Ontogenese des Hämoglobins
Hämoglobin ist ein tetrameres Protein, das aus zwei Globinkettenpaaren mit einem Gesamtmolekulargewicht von 64000 besteht. Die Globinketten des normalen adulten Hämoglobins (HbA) bestehen aus 141 (rx-
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ß-Thalassämie: Molekulare Pathogenese und klinische Variabilität
Klin. Pädiatr. 203 (1991)
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PATHOPHYSIOLOGIE DER 8 THALASSÄMIE -~
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Anämie
Globin) bzw. aus 146 (ß-Globin) Aminosäuren. Jede der vier Untereinheiten ist kovalent an das Ferro-Protoporphyrin Häm gebunden. Die Bindung der Untereinheiten miteinander erfolgt durch van der Waals und durch Wasserstoffbrückenbindungen. Die Quaternärstruktur des Proteins kann entweder fest (T-Form) oder lockerer (RForm) sein. Die T-Form wird durch CO 2, Protonen oder 2, 3-Diphosphoglycerat stabilisiert, wogegen sich die RForm präferentiell in der Gegenwart von Sauerstoff ausbildet (4). Alle humanen Hämoglobine haben diese tetramere Grundstruktur von zwei Globinkettenpaaren, dienen als Sauerstofftransporter und zeigen eine allosterische Konformationsänderung bei der Bindung von Sauerstoff. Dennoch werden während der embryonalen, der fetalen und der postnatal/adulten Phase der Entwicklung unterschiedliche Globinketten synthetisiert. Die embryonalen Hämoglobine, Gower 1, Gower 2 und Portland sind Tetramere des a- oder der a-ähnlichen ~-Ketten und der ß-ähnlichen E- und y-Ketten. Das fetale Hämoglobin (HbF) besteht aus zwei a- und zwei y-Ketten (a2 Y2) (54). Die embryonalen Hämoglobine werden von der 3. bis zur 8. Gestationswoche und HbF danach bis zur Geburt produziert. Postnatal wird das fetale Hämoglobin fast vollständig durch HbA (a2 ß2) und in geringer Menge auch durch HbA 2 (a2 Ih) ersetzt. Diese ontogenetischen molekularen Schaltvorgänge werden wahrscheinlich vermittelt durch eine Interaktion zwischen genetischen Kontrollelementen in den Promotoren der individuellen Globingene und einer Steuerregion, die die Aktivität des gesamten Genlokus reguliert (Abb. 1) (3, 11, 14, 16).
Pathophysiologie der
P-Thalassämie
Der grundlegende biochemische Defekt bei der ß-Thalassämie ist das Fehlen der ß-Globinsynthese in den erythroiden Vorläuferzellen des Knochenmarks. Der
Abb. 2 Schematische Darstellung der Pathogenese der ßThalassämie (aus: Hentze, Kulozlk, Bartram. Einführung in die medizinische Molekularbiologie. Springer 19901
Mangel an Substrat führt somit zu einer schlechten Hämoglobinisierung der Erythrozyten und daher zur Anämie. Die hämatologischen Befunde bei heterozygoten Überträgern ist somit durch die typische Hypochromie und Mikrozytose charakterisiert. Bei homozygoten Patienten ist die normale Erythropoese nicht nur durch den Mangel an ß-Globin, sondern auch durch den relativen Überschuß an a-Globin gestört. Die überschüssigen aGlobinketten, die nicht zu HbA gebunden werden können, sind schlecht löslich, fallen in den erythroiden Vorläuferzellen des Knochenmarks aus und führen zum Zelltod und zur Dyserythropoese (54). Das Verständnis der Mechanismen für die beobachtete klinische Variabilität des Krankheitsbildes wird durch eine Vergegenwärtigung dieser grundlegenden Pathophysiologie erleichtert (Abb. 2). Ein relativ mildes klinisches Bild der homozygoten ßThalassämie sieht man somit, wenn 1. die Restaktivität des ß-Globingens hoch ist, 2. der Mangel an ß-Ketten durch eine Persistenz von y-Globinketten-Synthese kompensiert, oder 3. der Überschuß an a-Ketten durch eine gleichzeitig vererbte a- Thalassämie vermindert wird (Tabelle 1).
Tab. 1
Die molekulare Ätiologie der ß Thalassaemia interme-
dia Homozygote ß Thalassämie Vererbung von einer oder zwei ß . , Thalassämie-Mutationen Vererbung von HPFH-Mutationen Vererbung von a- Thalassämie-Mutationen Heterozygote ß Thalassämie Vererbung von zusätzlichen a-Globlngenen
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Abb. 1 Der ß-Globingenkomplex mit dem embryonalen e, den fetalen V und den adulten 6- und ß-Globingenen. Die Regulation der Genexpression hängt von einer Wechselwirkung zWischen den lokalen Promotoren (PI und der Lokus-KontrollRegion (LCR) mit ihren 4 Nuklease-hypersensitiven Stellen 1-4 auf der 5 'Seite des Genkomplexes ab. Während der fetalen Phase der Entwicklung konkurriert die fetale Funktionseinheit effektiver um die LCR-Wlrkung als die adulte FunktionseInheit, während sich dieses VerhältniS postnatal umkehrt. Durch das Konkurrenzverhältnis zwischen den fetalen und adulten Promotoren um die LCR-Wirkung kommt es zum perinatalen Schalten von der HbF zur HbA und HbArSynthese
Klin. Pädiatr. (/99/) Molekulare Anatomie und Physiologie des p-Globingenkomplexes Das ß-Globingen ist ein kleines Gen von nur 1,6 kb, das nur einmal im haploiden Chromosomensatz vorkommt (single copy). Es liegt zusammen mit den anderen ß-ähnlichen Globingenen (E, Gy and A y und 15) in einem 60 kb-Genkomplex auf dem kurzen Arm des Chromosoms ll (llpl5) (4). Die codierende Information aller Globingene findet sich auf drei Exons, die durch 2 Introns von im wesentlichen unbekannter Funktion voneinander getrennt sind. Der "Kopf" und der "Schwanz" des ersten bzw. des dritten Exons bestehen aus nicht translatierten Sequenzen, die wahrscheinlich eine Rolle spielen bei der RNA-Reifung, der RNA-Stabilität und bei der Proteinsynthese. Die Regulation der Genaktivität wird durch den sogenannten Promotor vermittelt, der unmittelbar 5', vom Transkriptionsbeginn liegt (Cap-Stelle). Diese Steuerregion enthält vier besonders wichtige Elemente, die entsprechend ihrer Nukleotidsequenz benannt werden. Das der Cap-Stelle am nächsten liegende Element ist die sogenannte ATAAA-Box, das die Stelle der Transkriptionsinitiation determiniert und absolut essentiell für die Genfunktion ist. Weiter 5' finden sich eine CAAT- und ein Paar von CACCC-Boxen, die die Effizienz der Transkription erhöhen (4, 23). Zusätzlich zu diesen lokalen Regulationselementen befindet sich 6-18 kb 5' vom E-Globingen eine Region, die die Expression des gesamten ß-Globingenkomplexes während der ontogenetischen Entwicklung kontrolliert. Entsprechend dieser Funktion spricht man hier von der Lokus-Kontroll-Region (LCR). Die LCR besteht aus 4 Elementen, die in erythroiden Zellen ganz besonders empfindlich für einen in vitro Nuklease-Verdau sind. Diese Eigenschaft spiegelt vermutlich die Verfügbarkeit dieser Region für Transkriptionsfaktoren in vivo wieder (Abb. I) (36). Der erste Schritt der Genexpression umfaßt die Transkription der DNA in die Vorläufer-RNA (preRNA). Dies erfordert die Bindung verschiedener Transkriptionsfaktoren an den Promotor und an die LCR. Das Transkript wird sofort nach seiner Entstehung an seinem 5'-Ende modifiziert, wo ein methyliertes Guanosin (cap) angefügt wird. Am 3 '-Ende wird eine Reihe von Adenosin-Resten (poly-A Schwanz) angehängt. Diese Reaktion wird durch das sogenannte Poly-A Signal vermittelt, das ungefähr 25 Basenpaare 5' von der TranskriptionsterminationssteIle liegt (4). Die in der preRNA noch enthaltenen Introns werden durch das Zusammenspleißen der Exons entfernt, so daß die reife mRNA entsteht. Die Genauigkeit dieser Reaktion ist von größter Wichtigkeit, da auch schon Fehler von nur einem Nukleotid eine Verschiebung des Leserasters während der Translation bewirken. Der Spleißmechanismus erfordert Signalsequenzen an der 5' (Donor) und an der 3' (Akzeptor) Exon/Intron-Grenze und ebenso innerhalb der Introns. Diese Signalsequenzen wurden im Laufe der Evolution konserviert und werden daher als Konsensus-Sequenzen bezeichnet. Der Konsensus an der Donorspleißstelle besteht aus 9 Nukleotiden, von denen 3 im Exon und 6 im Intron liegen. An Position I und 2 eines Introns findet sich fast immer ein GT-Dinucleotid (splice junction), wogegen die anderen Nukleotide
A. E. Kulozik des Konsensus weniger stringent konserviert und variabler sind. Der Konsensus der Akzeptor-Spleißstelle besteht aus einem regelmäßig vorkommenden AG-Dinucleotid am 3' Ende des Introns und einem weniger stringent konservierten Pyrimidin an Position - 3. Der Spleißprozeß ist ein Dreischritt-Mechanismus, der durch einen Ribonukleoprotein-Komplex, das Spleißeosom vermittelt wird (31). Im ersten Schritt wird das 5' Ende des Introns vom davorliegenden Exon abgesetzt. Im 2. Schritt wird das freie 5' Ende an ein Adenin ungefähr 25 Basenpaare 5' vom 3' Ende des Introns angesetzt. Im 3. Schritt wird das 3' Ende des Introns vom nächsten Exon abgesetzt und die beiden Exons zusammen ligiert. Das Intron wird dabei in einer Lassoform freigesetzt und innerhalb des Zellkerns abgebaut. Die gereifte mRNA wird dann in das Zytoplasma transportiert, wo sie entsprechend dem genetischen Code in Protein translatiert wird.
Molekulare Pathologie der p-Thalassämie Die Expression des ß-Globingens kann an jedem Schritt ihres Weges von der DNA zum Protein durch mehr als 100 bekannte Mutationen inaktiviert werden und so eine ß-Thalassämie hervorrufen (Tabelle 2). 1. DNA-Ebene. Wenn das ß-Globingen ganz oder teilweise deletiert ist, fehlt dem betroffenen Chromosom natürlich die genetische Information für die Synthese von ß-Globin (ß 0_ Thalassämie). Das klinische Bild hängt von der Aktivität der benachbarten y-Globingene und somit der HbF-Synthese ab. Kleine Deletionen erhöhen die HbF-Produktion meist nur unwesentlich oder gar nicht und verursachen im homozygoten Zustand ein klinisch schwer verlaufendes Krankheitsbild. Dagegen verursachen größere Deletionen oft eine hereditäre Persistenz fetaler Hämoglobinsynthese (HPFH) und somit einen milden Phänotyp (siehe unten) (4).
2. Transkriptions-Ebene. Die effiziente Bindung von Transkriptionsfaktoren erfordert einen intakten Promotor. Punktmutationen der ATAAA- oder CACCC-boxen führen zu einer verminderten Effizienz der Transkription. Die Restaktivität des betroffenen Gens ist meist allerdings recht hoch (20-50070) und der Phänotyp relativ mild (23). Die Transkription eines strukturell normalen ß-Globin-Gens kann auch gestört sein, wenn die Nuklease-hypersensitiven Stellen 2-4 des LCR 5' vom E-Globingen deletiert sind (7, 10, 14, 50, 51). Eine isolierte Deletion der LCR-Stelle I scheint sich dagegen funktionell nicht auszuwirken (22). 3. Ebene der RNA-Verarbeitung. Mutationen der Cap-Stelle oder des Poly-A-Signals stören vermutlich die RNA-Stabilität, die Effizienz der weiteren RNAVerarbeitung und der Protein-Synthese. Eine A -+ C-Mutation der Cap-Stelle führt zu einem milden klinischen Phänotyp mit einer Restaktivität des betroffenen ß-Globingens von etwa 50% (34, 56). Mutationen des Poly-A Signals führen zu einer Restaktivität des ß-Globingens von 10-20% und zu einem relativ milden klinischen Bild der Sichelzell-ß-Thalassämie (37). Für eine bedeutsame klini-
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ß-Thalassämie: Molekulare Pathogenese und klinische Variabilität
Klin. Pädiatr. 203 (1991)
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Durch ß Thalassämiemutatlonen gestörte Schritte der GenexpressIon . Beim ß° Phänotyp gibt es keine Restaktivität des beim ß' Phänotyp ist die RestaktivItät für eine klinisch bedeutsame Wirkung zu klein. Beim ß + . Phänotyp findet sich oft ein mildes klinisches Bild Tab. 2
ß GlobIngens,
Betroffene Ebene der Genexpression
Mutationstyp
DNA
Deletion
Transkription
Phänotyp
Mutation von Promotor-Elementen Deletion der 5' LCR Elemente 2-4
RNA Verarbeitung Capping
Cap-Stelle Mutation
Spleißen
Mutationen der Splice junction
Polyadenyllerung
ß' , ßO
Mutationen der weniger stringent konservierten Konsensus Sequenzen
ß+
oder
ß+
Entstehung pathologischer Konsensus-Sequenzen
ß'
oder
ßO
Mutationen des Poly-A Signals
ß+
+
Frameshift-Mutatlonen
Translation
Nonsense Mutationen
Gen-Produkt
instabile
ß Globinketten
ß ' , autosomal dominant vererbte ß Thalassaemie
5
1
234
58
7 5
1
1I I
II
I1
9,10,11
1,10,11
7
5
8
I
I
I 9,10,11
Abb. 3 Schematische Darstellung eines ß Globingens mit der Position der verschiedenen Mutationstypen 1 Deletion der LCR. 2 Mutationen des Promotors. 3: Mutation der Capstelle. 4: Mutation des Initiationscodons. 5 Mutationen der spllce junctlons. 6. Mutationen des Spleißkonsensus. 7: Entstehung pathologischer Konsensussequenzen 8. Mutationen des Poly-A Signals. 9: Nonsense Mutationen. 10: Frameshift Mutationen. 11: Missense Mutationen instabiler ß Globinketten. Die codierenden Bereiche des Gens Sind als schwarze Balken, die 5' und 3 'UTRs als weiße Balken und die Introns sowie flankierenden Sequenzen als Linie dargestellt. LCR = Lokus Kontrol Region. P = Promotor
sche Wirkung bei der homozygoten ß-Thalassämie scheint dies jedoch nicht auszureichen, da Patienten mit doppelter Heterozygotie für eine solche Poly-A Signal-Mutation und eine andere ß + -Thalassämie-Mutation wie etwa die an Position IVSI-11O oder IVS2-745 (siehe unten) an einer transfusionsabhängigen Thalassaemia major leiden (18, 21).
Nicht ganz so nachteilig wirken sich Mutationen der anderen Nukleotide des Konsensus aus und führen zur ß + Thalassämie (48). Eine hohe Restaktivität des ß-GlobinGens mit einem eindeutigen klinischen Nutzen findet sich bei den G-+A und T-+C-Mutationen an Position 5 bzw. 6 des ersten Introns (lVSI-5 G-+A, IVSI-6 T-+C) (26, 28, 48, 53).
Bevor RNA vom Zellkern in das Zytoplasma gelangt, werden die Introns aus dem Primärtranskript entfernt, so daß die reife mRNA mit zusammengespleißten Exons entsteht. Als Signalsequenzen dienen hier die sogenannten Donor- und Akzeptor-Spleißkonsensus Nukleotide. Ein Mutationstyp stört das normale Spleißen durch eine Änderung dieser physiologischen KonsensusSequenzen. Wenn die hochkonservierten GT / AG Nukleotide an den splice junctions betroffen sind, kommt es zum völligen Funktionsverlust des Gens (ß 0- Thalassämie) (48).
Bei einem anderen Mutationstyp entstehen neue Spleißkonsensus-Sequenzen, die zu einer abnormen RNA- Verarbeitung führen. Häufige Beispiele sind die G-+ A und die C -+G-Mutationen an Position 110 des I. Introns (IVSI-11O G-+A) oder 745 des 2. lntrons (IVS2 745 C-+G). Die IVSI-11O G-+A Mutation verändert die normale TTGG-Sequenz an dieser Position zu TTAG, die identisch mit der physiologischen Spleißakzeptor-Stelle 20 Basen-Paare weiter 3' ist. Mehr als 90070 der pre RNA werden an diesem pathologischen Signal gespleißt, was zu
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Inltlations-Codon-Mutation
Klin. Pädiatr. (1991)
einer schweren Form der ß + -Thalassämie führt (43, 55). Analog dazu entsteht durch die IVS2-745 C--->G-Mutation eine pathologische GT-Spleiß-Donorsequenz, die präferentiell für die preRNA-Verarbeitung genutzt wird und so zu einer schweren Form der ß + -Thalassämie führt (48). Letztlich können pathologische Spleißsignalsequenzen auch durch Mutationen in den codierenden Sequenzen entstehen. Beispiele sind hier das HbE und das Hb Knossos, bei denen durch eine Veränderung der Aminosäuresequenz eine Hb-Anomalie einerseits und durch die Störung des Spleißmechanismus ein thalassämischer Phänotyp andererseits entsteht (4). 4. Translationsebene. Die genetische Information der ß-Globin mRNA wird entsprechend dem genetischen Code in Aminosäuresequenz translatiert, d. h. 3 Nukleotide codieren für eine Aminosäure. Die Codons UAA, UAG und UGA signalisieren dabei das Ende der Protein-Synthese (Stopcodons). Pathologische Stopcodons können durch Basensubstitutionen (Nonsense-Mutation) oder durch Deletionen und Insertionen einzelner Nukleotide entstehen, die das normale Leseraster verschieben (Frameshift-Mutationen) (17). Nonsense und FrameshiftMutationen inaktivieren das ß-Globingen vollständig (ß 0_ Thalassämie), und homozygot betroffene Patienten leiden gewöhnlich an einer schweren transfusionsbedürftigen Thalassaemia major. 5. Posttranslationale Ebene. Einige der Mutationen, die die Aminosäuresequenz verändern (Missense-Mutationen) führen zu einer ausgeprägten Instabilität der ß-Globinkette, die schon im Knochenmark abgebaut wird, bevor sie sich mit ex-Globin zu einem funktionellen HbA-Molekül verbinden kann (1). Andere Mutationen führen zur Synthese instabiler ß-Globinketten, die in den erythroiden Vorläuferzellen nicht abgebaut werden können, in den Erythrozyten ausfallen und so eine Einschluß-Körper-ß-Thalassämie hervorrufen. Ein besonderes Merkmal dieser seltenen Form der ß-Thalassämie ist ihr autosomal dominanter Erbgang (45). Die bei der homozygoten ß-Thalassämie beobachtete klinische Variabilität kann somit zum Teil dadurch erklärt werden, daß die verschiedenen ß-Thalassämie-Mutationen die Genexpression unterschiedlich stark stören. Relativ milde Formen der homozygoten ß Thalassämie sieht man, wenn die Expression des ß-Globingens durch Mutationen des Promotors, der Cap-Stelle oder der weniger stringent konservierten Nukleotide des Spleißkonsensus gestört ist.
Geographische Verteilung der häufigen Thalassämie-Mutationen Obwohl heute mehr als 100 ß-ThalassämieMutationen bekannt sind, findet sich bei den meisten Patienten der betroffenen ethnischen Gruppen eine sehr viel geringere Zahl (Tabelle 3). So macht die Codon 39 C--->T Nonsense-Mutation in Sardinien etwa 95010 aller ß-Thalassämie-Gene aus. Die Genetik anderer Bevölkerungsgruppen ist nicht ganz so homogen, aber 10 Mutationen oder weniger finden sich bei mehr als 90% aller Thalassämiegene der meisten ethnischen Gruppen. Diese relativ
A. E. Kulozik
ein fache Populations-Genetik erleichtert das genetische Screening und die Pränataldiagnose. Die Mutationsspektren der verschiedenen Gruppen unterscheiden sich untereinander allerdings erheblich, was auch manche der klinischen Unterschiede erklärt. So finden sich bei westafrikanischen Patienten häufig Promotor-Mutationen und somit relativ milde klinische Verläufe. Ebenso gibt es bei Patienten des östlichen Mittelmeerraumes häufig die milde Spleißmutante IVS 1-6 T--->C, die das nicht seltene Vorkommen der homozygoten ß-Thalassaemia intermedia in dieser Gegend erklärt.
Wechselwirkungen mit anderen genetischen Defekten Der relative Überschuß ungebundener und unlöslicher ex-Globin ketten ist der zentrale pathophysiologische Faktor bei der homozygoten ß-Thalassämie (Abb. 2). So erklärt sich auch die klinische Bedeutung von Veränderungen der y- oder der ex-Globingenexpression. Die Auswirkungen einer mitvererbten exThalassämie bei einer homozygoten ß-Thalassämie hängen im wesentlichen von dem Typ des molekularen ex-G1obingen-Defektes ab (15). Der normale ex-Globingenkomplex befindet sich an der Spitze des kurzen Arms von Chromosom 16 und enthält 2 fast identische und eng gekoppelte ex-Globingene (ex2 und ex1). Normale Personen haben daher 4 ex-Globingene (exex/exex). Die ex-Thalassämie wird meistens durch Deletionen eines oder beider ex-Globingene verursacht (ex + - oder ex 0_ Thalassämie). Personen mit einer durch Deletionen verursachten ex-Thalassämie haben somit 3, heterozygote ex + -Thalassämie (-ex/exex); 2, homozygote ex + -Thalassämie (-ex/-ex) oder heterozygote exo-Thalassämie (--/exex); 1, doppelt heterozygote exo/ex'Thalassämie (--/-ex); oder keine ex-Globingene (--/---), ein Krankheitsbild, das mit einem längeren postnatalen Leben nicht vereinbar ist. Bei Patienten mit einer homozygoten ß-Thalassämie und dem --I -ex-Genotyp findet sich eine schwere Mikrozytose und meist eine transfusionsbedürftige Thalassaemia major oder aber auch eine Thalassaemia intermedia (12, 30). Homozygote ß-Thalassämie-Patienten mit einem -ex/-ex oder einem --I exex Genotyp leiden gewöhnlich an einer Thalassaemia intermedia, wogegen der -ex/ exex Genotyp meist keine bedeutende klinische Rolle spielt (19, 39, 49, 52). Bei einigen Patienten mit einer hohen Restaktivität der ß-Globingene kann sich allerdings sogar eine heterozygote ex + - Thalassämie merklich positiv auf den Krankheitsverlauf auswirken (eigene unveröffentlichte Beobachtungen). Die erythroiden Vorläuferzellen von Personen mit einer heterozygoten ß-Thalassämie kompensieren den relativen ex-Globin-Überschuß vermutlich durch proteolytischen Abbau dieser Globinketten. Bei einigen Patienten mit 5 oder 6 ex-Globingenen ist dieses System jedoch überfordert. Es kommt hier zu einer klinisch merklichen Dyserythropoese und den Symptomen der Thalassaemia intermedia (25, 41, 44). Wenn keine ß-Globinketten zur Verfügung stehen, kann sich ex-Globin mit y-Globin zu HbF verbin-
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ß-Thalassämie: Molekulare Pathogenese und klinische Variabilität Geographische Heterogenität der molekularen Anatomie der
Land Literatur
Anzahl der Mutationen von ~ 90% aller ß Thalassämie Allele
Italien Sardinien (40) Sizilien (8)
3
Griechenland 1201
7
1
ß Thalassämle Häufigste Allele
1%)
Codon 39 non sense Codon 39 non sense IVSl-6 T--+C IVS1-110 G--+A
(95) (35) (29) 126)
IVS1-ll0 G--+A Codon 39 nonsense IVS1-l G--+A
(42) (171 (13)
Jugoslawien (9)
10
IVS1-ll0 G--+A IVS 1-6 T--+C IVS1-l G--+A
Bulgarien 138)
10
IVS1-ll0 G--+A Codon 39 nonsense IVS2-745 C--+G IVSl-6T--+C
(45) (191 111 I (24) 1221 (10) (10)
Türkei 135)
10
IVS1-ll0 G--+A IVS 1-6 T--+C IVS2-1 G--+A
(391 (181 112)
Zypern (42)
4
IVS1-ll0 G--+A IVS1-l G--+A
(70) (121
Libanon (5)
6
IVS1-ll0 G--+A
162)
Amerik. Schwarze
6
-29 A--+G -88 C--+T
(21)
(55)
Indien 1461
6
IVSl-5 G--+C 619 bp Deletion Codon 8/9 frameshift IVS1-l G--+T Codon 41/42 frameshift
(221 (22) (20) (141 (121
Malaysien (57)
8
IVSl-5 G--+C Hb-Malay Codon 41/42 frameshlft
Indonesien 129)
8
IVSl-5 G--+C HbE IVS2-654 C--+T
(49) (151 1101 (44) (181 (101
Süd-China 158)
5
Codon 41/42 frameshift IVS2-654 C--+T -28 A--+G Codon 17 nonsense
Spanien (2)
3
Codon 39, nonsense IVS 1-6 T--+C
(46) (19) (11 I 1101 (64) (151
Portugal 16)
4
Codon 39 nonsense IVS1-l G--+A IVS 1-110 G--+A
(531 1321 1101
den. Bei der homozygoten ß-Thalassämie ist das relative HbF wegen des selektiven Überlebensvorteils von F-Zellen immer erhöht (54). Wenn die y-Globin-Genexpression und somit die y-Globinkettensynthese allerdings postnatal persistiert, können die überschüssigen a-Globinketten abtitriert werden, was zu einem milden Verlauf der homozygoten ß-Thalassämie führt. Die klinische Auswirkung bei einer solchen hereditären Persistenz fetaler Globinsynthese (HPFH) hängt wesentlich von dessen molekularer Basis ab. Es gibt zwei Mutationstypen, die zu einer erhöhten yGlobingenexpression führen. (I) DNA-Deletionen, die das ß-Globingen und mehr oder weniger von dessen flankierenden Sequenzen betreffen und (2) Punktmutationen der y-Globingen-Promotoren. Abhängig von dem genauen molekularen Defekt findet sich bei manchen Patienten mit einer homozygoten ß-Thalassämie und einer gleichzeitig
281
bestehenden HPFH ein fast normales hämatologisches Bild oder aber auch ein thalassämischer Phänotyp unterschiedlicher Ausprägung (4). Der genaue Mechanismus, durch den Deletionen des ß-Globingen-Komplexes die Expression der yGlobingene beeinflussen können, ist nicht bekannt. Gute Daten gibt es jedoch für zwei sich möglicherweise ergänzende Hypothesen. (I) Bei einem kompetitiven Synergismus zwischen dem ß-LCR einerseits und den fetalen oder adulten Globingenpromotoren andererseits (Abb. I) entfiele bei den Deletionen der ö- und ß-Globingene der adulte Konkurrent, so daß es zu einer erhöhten Expression der fetalen Globingene kommen kann (3, 11). (2) Große Deletionen von Sequenzen in der Nachbarschaft des ß-Globingenes könnten den Abstand zwischen den y-Globingenen
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Tab. 3
Klin. Pädiatr. 203 (1991)
Klin. Pädiatr. (/991)
und Enhancer-Elementen auf der 3' Seite des ß-Globingens verkürzen und somit eine Wirkung dieser verstärkenden Regulatorsequenzen auf die y-Globingene ermöglichen.
A. E. Kulozik
R
9
Die Punktmutationen der y-Globingenpromotoren entfalten ihre Wirkung vermutlich durch eine Erhöhung der Affinität für die Bindung von Transkriptionsfaktoren oder durch eine Veränderung der dreidimensionalen Verhältnisse nach der Bindung dieser Faktoren (32, 33). Dabei gibt es unterschiedliche Auswirkungen der verschiedenen Mutationen. Während sich bei einigen ein HbF zwischen 20% und 30% bei Heterozygoten und eine fast normale Hämatologie bei Patienten mit einer homozygoten ß-Thalassämie findet (4), entfalten andere eine hämatologisch/klinisch merkliche Wirkung erst, wenn ein deutlicher erythroider Streß vorliegt. Die Vererbung solcher weniger stark wirksamen Mutationen kann aber dennoch zu einer erheblichen Abmilderung des klinischen Bildes einer homozygoten ß-Thalassämie oder auch einer homozygoten Sichelzellerkrankung führen (24, 27, 47).
10
11
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l'
Schlußbemerkung
Die beobachtete klinische Variabilität der ß-Thalassämie erklärt sich einerseits durch die Heterogenität der pathologischen Veränderungen des ß-Globingenkomplexes. Andererseits zeigt sich, daß die klinische Ausprägung dieses "monogenen" Erbganges nicht nur von dem Defekt des ß-Globingens selbst, sondern auch von genetischen Einflüssen abhängt, die von den (X- und den yGlobingenen ausgehen. Als praktische Konsequenz ergibt sich aus dem verbesserten Verständnis der molekularen Pathologie der ß-Thalassämie die Möglichkeit einer sehr spezifischen Diagnostik sowie für ein selektives genetisches Screening und für die pränatale Krankheitserkennung. Außerdem richten sich intensive Bemühungen auf die Verbesserung der Behandlung von Patienten durch die Entwicklung einer tragfähigen Strategie für die somatische Gentherapie. Es wird allerdings einige Zeit dauern, bevor diese Option für den Pädiater am Krankenbett verfügbar sein wird.
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Dr. med. A. E. Kulozik, PhD Universitäts-Kinder klinik Abteilung Pädiatrie II Prittwitzstr. 43 7900 Ulm
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Klin. Pädiatr. 203 (1991)
