日薬理誌(Folia Pharmacol. Jpn.)145,112∼116(2015)

特集

細菌感染と急性肺傷害

ARDS の病態解明と新しい治療への薬理学的アプローチ 1

佐和 貞治

要約:急性呼吸窮迫症候群(acute respiratory distress

細菌性肺炎が原因となることが多いことから,細菌感

syndrome:ARDS)は,急性肺傷害のなかで最も救命

染に対する治療法が ARDS の高い死亡率を改善するう

率の低い致死性病態である.細菌性肺炎が原因となる

えではもっとも重要な戦略と言える.近年,多くの病

こ と が 多 い こ と か ら,細 菌 感 染 に 対 す る 治 療 法 が

原性グラム陰性細菌は,Ⅲ型分泌システムと呼ばれる

ARDS の高い死亡率を改善するうえではもっとも重要

新しく発見された毒素分泌メカニズムを介してその病

な戦略である.近年,多くの病原性グラム陰性細菌は,

原性を発揮することが解明されてきた.この分泌シス

Ⅲ型分泌システムと呼ばれる新しく発見された毒素分

テムを用いて,細菌は毒素を直接,標的細胞の細胞質

泌メカニズムを介してその病原性を発揮することが解

に転移させる.転移した細菌毒素は,真核細胞の細胞

明されてきた.この分泌システムを用いて細菌はその

シグナリングをハイジャックし,細菌がホストの免疫

毒素を直接,標的細胞の細胞質に転移させる.転移し

機構から回避できるようにする.我々はこれまで緑膿

た 毒 素 は,真 核 細 胞 の 細 胞 内 シ グ ナ リ ン グ を ハ イ

菌性の急性肺傷害のメカニズムについて研究を進め,

ジャックし,細菌がホストの免疫機構から回避できる

その結果,緑膿菌のⅢ型分泌システムが緑膿菌性肺炎

よう誘導する.我々はこれまで緑膿菌性の急性肺傷害

における急性肺傷害の病態メカニズムに深く関与して

のメカニズムについて研究を進め,その結果,緑膿菌

いることを見出した.本稿において,ARDS の概略と

のⅢ型分泌システムが緑膿菌性肺炎における急性肺傷

我々の緑膿菌性肺傷害に対する治療戦略の開発につい

害の病態メカニズムに深く関与していることを見出し

てまとめる.

た.細胞毒性の強い緑膿菌は,肺上皮の急性壊死を引 き起こすⅢ型分泌毒素を分泌し,急速に全身循環への

2. ARDS の概略

細菌播種を誘導して敗血症へと進展させる.Ⅲ型分泌

1950 年代以後に,気管挿管や陽圧式人工呼吸法が確

に関わるタンパク質の中で V 抗原と呼ばれる PcrV タ

立していく中で,急性発症でびまん性の両側肺浸潤影

ンパク質にⅢ型分泌毒性に対抗できる免疫効果がある

を呈し,急速に低酸素血症が悪化して死に至る病態が

ことを発見した.ヒト化された抗 PcrV 抗体が開発さ

把握されはじめ,1971 年 Ashbaugh と Petty らにより成

れ,現在臨床試験が行われている.他の多くの病原性

人呼吸窮迫症候群 adult respiratory distress syndrome

グラム陰性菌もこの V 抗原相同体,もしくは V 抗原様

(ARDS)と名付けられた(1).その後に,1994 年に米

相同体を持つ.従って,V 抗原抗原やその相同体は,

国胸部疾患学会と欧州集中治療医学会の合同会議

致死性の細菌感染に対する現在新しいワクチンや治療

(American-European Consensus Conference:AECC)

のターゲットとして注目されている.

1. はじめに

により,ARDS は成人に限った疾患ではないことから急 性呼吸窮迫症候群 acute respiratory distress syndrome と修正定義され,加えて前段階を含む病態としての

急 性 呼 吸 窮 迫 症 候 群(acute respiratory distress

ALI という概念が定義された(2).ARDS の当時の基準

syndrome:ARDS)は,急性肺傷害(acute long injury:

において,ARDS の罹患率は 10 万人あたり米国の 58.7

ALI)のなかで最も救命率の低い致死性病態である.

人から,オーストラリア 22 人,スカンジナビア諸国

キーワード:急性呼吸窮迫症候群,抗体療法,Ⅲ型分泌システム,緑膿菌,V 抗原 京都府立医科大学 麻酔科学教室(〒602-8566 京都市上京区河原町通り広小路上る梶井町 465 番地) E-mail: [email protected] 原稿受領日:2014 年 12 月 9 日,依頼原稿 Title: Bacterial infection and acute lung injury Author: Teiji Sawa

細菌感染と急性肺傷害

113

表 1 急性呼吸窮迫症候群(acute respiratory distress syndrome)の定義 AECC 定義(1994 年) 分類

Acute Lung Injury(ALI)

ARDS

経過

急性

酸素化

P/F 比≦ 200 mmHg

P/F 比≦ 300 mmHg

胸部 X 線

両側肺浸潤影(正面像)

肺動脈楔入圧

測定時で P/F 比≦ 18 mmHg または左房圧上昇の臨床所見がない Berlin 定義(2012 年)

分類 経過

Mild ARDS

Moderate ARDS

Severe ARDS

既知の危険因子の侵襲もしくは呼吸状態の増悪または新たな出現から一週間以内

酸素化

P/F 比:201∼300 mmHg with PEEP/CPAP ≧ 5 cm H2O

P/F 比:101∼200 mmHg with PEEP/CPAP ≧ 5 cm H2O

P/F 比:≦ 100 mmHg with PEEP/CPAP ≧ 10 cm H2O

肺水腫

心不全や輸液過多で説明がつかない呼吸不全 危険因子が判然としない場合は客観的評価(心エ コーなど)によって静水圧性肺水腫の否定が必要

胸部 X 線

両側肺浸潤影:胸水,無気肺,結節などで説明がつかないもの

13.5 人であると報告された一方で,日本集中治療医学

15.5%に続き,肺炎は 9.9%と脳血管疾患 9.9%と並ん

会による本邦の統計では 1.7 人と大変低く,国際間で

で第 3 位となった.主な起炎菌には,Potentially Drug

も大きな幅を持つ.死亡率報告についても,1990 年代

Resistant(PDR)pathogens と呼ばれる MRSA(メチシ

には 60%とも言われていたが,最近では平均すると

リン耐性黄色ブドウ球菌),緑膿菌,アシネトバクター,

25∼30%前後であろうと考えられている.ただし,敗

ESBL(基質拡張型 b ラクタマーゼ)産生腸内細菌など

血症を原因とする場合の死亡率は 60%前後と依然高

が含まれる.これらの多剤耐性菌が蔓延してきている

値にあると言われる.

昨今の状況でどのような治療戦略を立てて,肺炎が

その後 20 年の歳月を経て,診断基準の特異度の低

ALI を経て ARDS へ進展することを防ぐことができる

さや急性の定義の曖昧さなどが問題となり,2012 年,

かは 21 世紀のテーマと言える.21 世紀に入りゲノム

欧州集中治療医学会主導のもとに新しい国際診断基準

医科学に関わる技術は急速に進歩し,多くの病原性細

であるベルリン定義(The Berlin Definition)が発表さ

菌の全ゲノム解析,そしてヒトゲノムの解析が進めら

れた (3).今後,この新国際基準に従って臨床研究が

れてきた.また,ALI を起こす病原体側もしくはホス

進むものと考える.ARDS の原因は,いわゆる肺への

ト側のメカニズムについてより詳細に把握し,予防・

直接損傷がきっかけとなる呼吸器起因性(肺炎,胃内

治療のターゲットを見出して,この致死性疾患にどの

容誤嚥,重度肺挫傷,脂肪塞栓,

ように対応していくかについてが現在求められている.

水など)と肺外の

原因が肺へ間接的に損傷を起こす非呼吸器起因性(敗

ARDS にしても敗血症にしても致死性の病態を示す

血症,重度外傷や熱傷,心肺バイパス術大量輸血,輸

炎症性症候群であり,原因は呼吸性,非呼吸性を含め

血関連急性肺傷害(TRALI),急性膵炎,播種性血管内

て極めて多様であり,どの ARDS にも効果を示すとい

凝固 DIC,など)に分類できる.ただし,ARDS に至っ

うような万能薬を見つけることは容易ではないであろ

てしまった状態においては,肺感染症が関与しないも

う.現在までのジレンマは,ARDS の病態形成には過

のは極めて稀であり,直接,間接に関わらず,細菌感

剰な炎症反応が関わっていることは確かであるが,一

染による ALI は続発性敗血症への進展性を含めて重要

方でその炎症反応を抑制すれば,感染病態が悪化する

である.治療方法としては,依然,特異的なものはな

ことで逆に予後を悪化させる懸念があることである.

いのが現状であるが,①原疾患に対する治療:感染制

20 世紀末に解明されてきた過剰な炎症反応に関わる

御,② ARDS への呼吸治療:人工呼吸(人工呼吸器関

サイトカインネットワークに対して,サイトカインの

連肺損傷に対して肺保護戦略),③全身的補助治療:

抑制により制御する試みは,現在までには明確には成

鎮静,栄養管理,感染予防,などの対処療法を中心と

功していない.また,敗血症の病態形成の一旦を担う

する総合的な治療戦略を立てて対処していくことが現

エンドトキシンの認識に関わる Toll 様受容体を中心と

在では必要となる.

する先天性免疫機構の制御が病態を改善させるのでは

平成 23 年度の厚生労働省による日本での主な死因

ないかという試みも今のところ有意な結果をもたらし

別死亡統計においては,悪性新生物 28.5%,心疾患

ていない.我々は,ARDS の前病態となる ALI の時点

114

佐和 貞治

で,早期に治療介入することがより不可逆性の病態に

緑膿菌においても,1995 年前後よりエクソエンザイ

近い ARDS への進展を防ぐ可能性があると考えてきた.

ム S(exoenzyme S:ExoS)とその関連毒素がⅢ型分

特に,人工呼吸関連性肺炎の最も高頻度起炎菌である

泌システムで分泌される毒素であることが明らかに

緑膿菌の ALI のメカニズムを徹底的に解明することで,

なった(7).同時にⅢ型分泌の装置や制御に関わる遺

治療のターゲットを見出し,早期診断,予防に繋げる

伝子群を含むゲノム領域である exoenzyme S regulon

手立てを求めてきた.以下,それらの取り組みについ

が発見され,2000 年に緑膿菌株 PAO1 での全ゲノム解

て述べる.

析報告より,4 つのタンパク質毒素(ExoS,ExoT,

3. 病原性グラム陰性菌のⅢ型分泌システム

ExoU,ExoY)の遺伝子との位置関係等が解明された (7) . 緑膿菌 PAO1 株の環状のゲノムは 5570 個のタンパ

グラム陰性菌は,外壁を構成する細胞外膜と内膜の

ク質をコードする遺伝子を含む 630 万塩基対で構成さ

二重膜を越えて菌体外へ細胞質内のタンパク質分子を

れ て い る(8).Exoenzyme S regulon 領 域 は 25,700 塩

分泌する仕組みとして,複数の様式を持つタンパク質

基対で構成され,Ⅲ型分泌に関わる 5 つのオペロンで

分泌システムを保有する.従来,タンパク質毒素はそ

構成される 36 遺伝子が含まれている.それらの中で

の分泌様式により,Ⅰ型もしくはⅡ型と分類された分

も ExsA は,Ⅲ型分泌システム全体を活性化する転写

泌システムを通じて,菌体外へ運ばれて標的細胞の表

活性因子であり,またゲノム上に散在するⅢ型分泌毒

面へ作用することでその毒性を発揮すると考えられて

素タンパク質の遺伝子とその毒素タンパク質のシャペ

きた.ところが,1980 年代後半にスウェーデンの細菌

ロンタンパク質(Orf1,SpcU)の転写活性も司る.た

学者らにより,ペスト菌を含むエルシニア菌において,

だし,これまでに発見された 4 つのⅢ型分泌毒素のう

そのタンパク質毒素が特殊な分泌装置を通じて標的細

ち,PAO1 株のゲノム上には ExoS,ExoT,ExoY の 3

胞内に直接注入されるという発見が報告され,Ⅲ型分

つのみが存在する.一方,細胞毒性の強い約 20%の緑

泌システムと名付けられた(図 1) (4).その後,この

膿菌株(PA103 や PA14 株)では ExoS を欠損する代わ

Ⅲ型分泌システムは,大腸菌,サルモネラ菌,赤痢菌,

りに病原性アイランド(pathogenicity island)と呼ば

クラミジア菌など広く各種病原性グラム陰性細菌に高

れ る 領 域(Pseudomonas aeruginosa pathogenicity

い相同性をもつ分泌システムとして発見されてきた (5) .

island-2:PAPI-2)が挿入遺伝子群として存在し,その

現在ではグラム陰性菌の分泌システムは,さらに新た

遺伝子群には細胞毒性の強いⅢ型タンパク質分泌毒素

に見つかったⅣ型,Ⅴ型,Ⅵ型を加えて,6 つに分類

である ExoU の遺伝子とそのシャペロンタンパク質が

される (6) .Ⅲ型とⅣ型は,従来のⅠ型・Ⅱ型と異なり,

コードされている.

細菌は標的細胞に直接接着し,特殊な分泌装置を介し

緑膿菌の 4 つのⅢ型分泌毒素 ExoS,ExoT,ExoU,

てタンパク質毒素を標的細胞の細胞質内に直接注入す

ExoY は,それぞれ標的細胞の細胞質内に転移した後

ることである.またこの新しく発見された分泌システム

に活性化される酵素作用を持つ(図 2).ExoS や ExoT

が細菌の病原性発揮に深く関わることが解明されてきた.

には,ADP-リボシル転移酵素と GTPase 活性化タンパ ク質酵素,ExoU はホスホリパーゼ A2 活性,ExoY は アデニルサイクラーゼ活性を持つ.特に ExoU 毒素は その強力なリパーゼ作用により,標的細胞の細胞膜を 破壊し細胞壊死を起こすことから,ALI や敗血症,そ して感染死亡率との関連性が報告されてきている点で 重要である(9).

4. 緑膿菌性 ALI メカニズム 緑膿菌のⅢ型分泌装置は,毒素タンパク質が細菌側 の二重膜構造を越える分泌装置(secretion apparatus)と, 標的細胞の原形質膜を越える転移機構(translocational mechnism)で構成される.分泌装置は,PscC や PscJ などの多くのタンパク質で構成される装置の基底構造 図 1 Ⅲ型分泌システムにおける毒素転移

病原性グラム陰性菌は標的細胞表面に直接接触し,Ⅲ型分泌装置を通じ て酵素作用を持つタンパク質毒素を標的細胞の細胞質へ転移させる.

(basal components)と PscF で構成されるニードル状 構造で構成される.また転移機構の詳細は,まだ完全

細菌感染と急性肺傷害

115

図 3 細菌性急性肺傷害の治療ターゲット

緑膿菌性急性肺傷害のターゲットとして,抗菌療法に加えて細菌Ⅲ型分 泌の阻害,肺上皮傷害の軽減,全身へ広がるサイトカインの制御などが 期待できる.

図 2 緑膿菌Ⅲ型分泌毒素 ExoS,ExoT,ExoU,ExoY

緑膿菌の 4 つのⅢ型分泌毒素 ExoS,ExoT,ExoU,ExoY は,それぞ れ標的細胞の細胞質内に転移した後に活性化される酵素作用を持つ. ExoS や ExoT は,ADP-リボシル転移酵素と GTPase 活性化タンパク 質酵素,ExoU はホスホリパーゼ A2 活性,ExoY はアデニルサイクラー ゼ活性を持つ.

ル抗体もそのⅢ型分泌毒性の阻害作用には抗体の Fc 部分を必要とせず,Fab 部分のみでその作用を発揮する. 我々は,このモノクローナル抗体 mAb166 の抗体遺伝 子をクローニングし,遺伝子組み換え抗体を作成した. この抗体は,米国ベンチャー企業である KaloBios 社

には明らかになっていないが,少なくともニードルの

(South San Francisco,California)により,同社の持

先端において,キャップ状の構造をとる PcrV と,細

つ Antibody Af finity Engineering by Serial Epitope-

胞膜で転移孔(translocational pore)を形成すると考

guided Complementarity Replacement と い う Phage

えられている PopB と PopD の 3 つのタンパク質が関

Display を基盤とする技術により抗原への結合親和性

わる.とくにキャップタンパク質である PcrV は,ペ

が増強され(affinity maturation),かつヒトに有害な抗

スト菌を含むエルシニア菌の V-抗原と呼ばれてきた

原性部位が取り除かれ(humanized),遺伝子組み換え

タンパク質である LcrV と高い相同性を持ち,それら

ヒト化抗 PcrV 抗体 KB001 として動物実験での有効性

に対する特異抗体がⅢ型分泌の毒性を抑制できること

が報告された(17).

が注目されてきた(10–12).

5. 緑膿菌Ⅲ型分泌システムを標的とする抗体 療法の開発

抗 PcrV 抗体がどのように緑膿菌のⅢ型分泌毒素の 転移を抑制するのかに関しては未だ詳細な報告はない. ただし,PcrV 分子上の mAb 抗体結合ドメイン領域, PcrV の立体構造や,PcrV が分泌装置の先端において

著者らは,1999 年に緑膿菌のⅢ型分泌の毒素転移に

五量体(pentamer)の環状キャップ構造を取ることなど

関わるタンパク質である PcrV に緑膿菌のⅢ型分泌毒性

から,抗体が先端構造に結合することにより,Ⅲ型分

を阻害できるワクチン効果があることを報告した(13).

泌毒素の通過を阻害するのではないかと考える (18–20) .

また,この PcrV に対するウサギ由来の特異的ポリク ローナル抗体は,細胞培養の実験系においては,マク

6. 抗緑膿菌 PcrV 抗原抗体の臨床試験

ロファージや肺上皮細胞への緑膿菌による ExoU や

米国 KaloBios 社がヒト化を行なった遺伝子組み換

ExoY の毒素転移をブロックし,動物を用いた緑膿菌

えヒト化抗 PcrV 抗体 KB001 は,近年 Sanofi-Pasteur

性肺炎モデルにおいては,ALI を軽減し,菌血症や敗

社により米国とフランスにおいて第Ⅱ相の臨床試験が

血症の発症を防いだことから,この抗体がⅢ型分泌毒

実施され,その結果の一部について最近報告された.

素の転移を抑制できることを報告した(14).

フランスでの臨床第Ⅱ相試験では,39 名の緑膿菌が検

次に同様のⅢ型分泌毒性に対するブロッキング作用

出された人工呼吸中の患者を 3 群に分け,それぞれに

を認めるマウス由来の抗 PcrV モノクローナル抗体

KB001 を 3 mg/kg(n=13)もしくは 10 mg/kg(n=14) ,

mAb166 を開発し,この抗体の PcrV 上の結合ドメイン

もしくは placebo(対照群 n=12)が投与され,投与

領域を同定した(15, 16).ウサギ由来の抗 PcrV ポリク

後 28 日以内の肺炎への進展が評価された.その結果,

ローナル抗体も,マウス由来の抗 PcrV モノクローナ

対照群では 60%であった一方で,KB001 を 3 mg/kg

116

佐和 貞治

(n=13)も し く は 10 mg/kg 治 療 群 で は,そ れ ぞ れ



33%と 31%と有効性が示された (21).米国で行われ た臨床第Ⅱ相試験では,27 名の緑膿菌慢性感染を伴う 肺嚢胞線維症患者を 3 群に分け,それぞれ KB001 を 3 mg/kg(n=10)もしくは 10 mg/kg(n=8) ,もしくは placebo(対照群 n=9)を投与し,投与後 14 日目にお ける治療群での気道分泌物内炎症性マーカーを評価し た.その結果,治療群において,有意な炎症性マー カーの低下が認められたことが報告されている(22). 今後の第Ⅲ相の臨床試験の実施が待たれるところである.

7. まとめ ARDS について,新しい診断基準を解説し,加えて 我々の緑膿菌性 ALI に対する新しい治療法の取り組み を本稿にまとめた.多剤耐性緑膿菌が致死的な院内感 染の発症にしばしば起因している昨今の状況において, 緑膿菌の感染症と主要な病原因子であるⅢ型分泌毒性 の関わり,それらの病原性に対する特異的なブロッキ



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ング抗体の開発と現状について報告した.PcrV 特異 抗体(KB001)は,臨床試験段階にあり,特異抗体によ る TTS 毒性の抑制は ALI の治療薬として有効である可 能性がある.遺伝子組み換え抗体技術の進歩は,我々 の関わる抗体以外にも,リポポリサッカライド O 抗原 サブタイプ 11 を標的とするモノクローナル抗体であ る Panobacumab や,

毛タンパク質に対する特異抗

体 LST-007 の前臨床試験報告が行われている(23, 24). 今後,様々な抗体療法や g-グロブリン療法は,免疫力 の低下した患者に発症する多剤耐性緑膿菌感染に対す る抗菌療法の adjuvant therapy として期待が高まると

著者プロフィール

佐和 貞治(さわ ていじ) 京都府立医科大学大学院医学研究科 麻酔科学教室,教授,博士 (医学). ◇ 1985 年京都府立医科大学医学部卒業,ヨット部卒. 88 年京都 府立医科大学麻酔科学教室助手. 99 年カリフォルニア大学サン フランシスコ校麻酔周術期科助教授. 02 年カリフォルニア大学 サンフランシスコ校麻酔周術期科准教授. 06 年京都第一赤十字

ころである.

病院麻酔科部長. 10 年京都府立医科大学麻酔科学教室教授. 14

著 者 の 利 益 相 反:佐 和 貞 治(The Regents of University of California).

ムと免疫療法の開発.◇趣味:オーディオ,アナログ・レコード

年ヨット部部長.◇研究テーマ:緑膿菌性肺傷害の病態メカニズ 収集,音楽鑑賞(ジャズ,ボサノバ).

[Bacterial infection and acute lung injury].

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