Wilhelm Roux' Archiv 168, 205--225 (1971) 9 by Springer-Verlag 1971

l~tude autoradiographique de l'influence de la temp6rature sur la proliferation cellulaire chez les embryons ~g6s de Pleurodeles waltlii Miehah. (Amphibien, Urod61e) G. B~UGAL Laboratoire de Zoologic, Institut de Reeherehes Biologiques, Universit6 Scientifique et M6dicale de Grenoble l~epu le 1 Mars 1971 Autoradiographie S t u d y of the Effect of T e m p e r a t u r e on Cellular Proliferation in Late E m b r y o s of Pleurodeles waltlii Michah. (Amphibia, Urodela) Summary. We observed in Pleurodeles embryos, stage 34, that the duration of the cell cycle and its phases was approximately the same for every tissue but was easily modified by varying the temperature. The generation time and the duration of S phase in embryos submitted to a 12~ temperature instead of 26~ are tripled or quadrupled. A temperature rise produced a proportionale shortening in Ge and M phases and a lengthening in G1 phase. This G1 phase is not detectable at 12~ but represent a 1/4 of the total generation time at 26~ The more differentiated the cells are, the longer is the G1 time. The cell population studied during these experiments are growing exponentially. Growth fraction, which represents the exponential growth basis, is temperature independent but has a tissue specificity. This growth fraction is smaller the more the tissue is differentiated. However, the relative rate of cell division, inversely proportional to the generation time, is temperature dependent and appears to control the embryo's relative rate of growth under different temperatures.

Jtdsum& Chez l'embryon de Pleuro@le au stade 34, la dur6e du cycle cellulaire et de ses phases varie peu selon les tissus mais d6pend 6troitement de la temp6raturc. Le temps de ggn6ration et la dur6e de la phase S song environ 3 ou 4 lois plus longs & 12'~C qu'~. 26~ Lorsque la temp6rature s'61~ve, la phase G2 est abr6g6e darts les m6mes proportions que la phase M; par contre, la dur6e de la phase G1 qui est nulle s 12~ s'allonge consid6rablement pour repr6senter environ 1/4 de la dur6e totale du cycle cellulaire s 26~C. La dur6e de cette phase est d'autant plus longue, s une temp6rature donn6e, que les cellules song plus diff6renci6es. Les tissus 6tudi6s repr6sentent des populations eellulaires en croissance exponentielle. Le coefficient de prollf6ration, duquel d6pend la base de la fonction exponentielle de eroissance, est ind6pendant de la temp6rature mais particulier s chaque tissu. I1 est d'autant plus faible que le tissu est plus diff6renei6. En revanche, la vitesse de multiplication des cellules, qui est inversement proportionnelle au temps de g6n6ration, varie largement en fonction de la temp6rature; en outre, elle semble d6terminer s elle seule ta vitesse du d6veloppement des embryons aux temp6ratures choisies. Introduction Les premieres 6tudes e o n e e r n a n t l'influenee de la t e m p 6 r a t u r e sur la division cellulaire o n t 6t6 r6alis6es sur les oeufs en s e g m e n t a t i o n chez l ' o u r s i n (Agrell, 1958), l'ascaris (Ephrussi, 1927) ou la sabelle (FaurS-Fr6miet, 1924). Ces t r a v a u x o n t permis de d 6 t e r m i n e r les coefficients de t e m p 6 r a t u r e (Q10) des diff6rentes phases de la mitose. Ces r6sultats o n t 6t6 confirm6s et eompl6t6s ehez les Amphibiens (Peter, 1924) et plus r 6 c e m m e n t ehez les Mammif6res (Shapiro et L u b i n n i -

206

G. Brugal:

k o v a , 1966; R a o et E n g e l b e r g , 1968) et chez les v6g6taux (Brown, 1951; E v a n s et Savage, 1959; V a n ' t Hoff et Ying, 1964). Alors que ees t r a v a u x o n t e o n s i d 6 r a b l e m e n t 6 t e n d u nos connaissances cone e r n a n t l'influence de la t e m p 6 r a t m ' e sur la dur6e de la m i t o s e et de l ' i n t e r p h a s e , F a c t i o n de ce f a c t e u r sur les 4 phases d u cycle eellulaire d6arites p a r H o w a r d et Pelc (1951) n ' a fair l ' o b j e t que d ' u n p e t i t h o m b r e de t r a v a u x r6cents. Ceux-ei, e n t r e p r i s grace a u x t e c h n i q u e s a u t o r a d i o g r a p h i q u e s et m i c r o e i n 6 m a t o g r a p h i q u e s , p o r t e n t p r i n c i p a l e m e n t sur d u mat6riel v6g6tal ( W i m b e r , 1966) des tissus d ' A m p h i biens e m b r y o n n a i r e s (Chibon et Brugal, 1969), ou sur des cellules de Mammifbres a d u l t e s eultiv6es in vitro (Rao et E n g e l b e r g , 1965; Sisken et al., 1965; V e n d r e l y et al., 1968). Ils o n t m o n t r 6 que les p h a s e s d u cycle cellulaire s o n t d i f f 6 r e m m e n t affect6es p a r les conditions de t e m p 6 r a t u r e . L ' i n f l u e n c e de la t e m p 6 r a t u r e sur les divers p a r a m ~ t r e s de la prolif6rar cellulaire tels que l ' i n d i e e de m a r q n a g e , l'indiee m i t o t i q u e et le coefficient de prolif6ration, n ' a 6t6 que p a r t i e l l e m e n t 6tudi6e ( E v a n s et Savage, 1959; R a o et Engelberg, 1968). I1 nous a done p a r u i n t 6 r e s s a n t de pr6eiser les modifications de la ein6tique de diverses p o p u l a t i o n s de eellules en fonetion de la t e m p 6 r a t u r e chez les e m b r y o n s d ' u n Vert6br6 poYkilotherme Pleurodeles waltlii Miehah. (Amphibien, Urod~le) d o n t la vitesse de d 6 v e l o p p e m e n t varie l a r g e m e n t an f o n c t i o n de ce facteur.

Mat~rial at m6thode Les exp6rienees ont 6t6 r6alis6es sur des lots de 50 embryons de Pleurod~le au stade 34 de Gallien et Durocher (1957) plac6s aux temp6ratures de 12~C, 17~C, 23 C~ et 26 ~C. Lorsqu'ils ont atteint le stade 34, 30 embryons de chaque lot regoivent une injection de thymidine triti6e puis sont conserv6s ~ la temp6rature de l'exp6rienee avant d'etre fix6s, un par un, ~ des intervalles de temps 6chclonn6s entre 1 h e t 99 h apr~s 1'injection. Darts chaque lot, 20 embryons non trait6s nons ont permis de d6terminer la vitesse du d6veloppement aux temp6ratures ehoisies.

Mode opdratoire Les embryons ayant atteint le stade 34 sont lav6s et anesth6si6s dans la solution op6ratoire st6rile de Holtfreter additionn6e de MS 222 ~ la concentration de 1 g/l. Au moyen d'une microaiguille, 2.10 -~ ml environ d'une solution de thymidine triti6e s la concentration de 50 ~zCi/ml (activit6 sp6cifique: 9,7 Ci/m~) est inject6e dans la cavit6 g6n6rale des animaux (environ 10-2 [zCi/animal). Aprbs l'injection les cmbryons sont replac6s dans la solution op~ratoire de Holtfreter d'oh ils seront retir6s pour ~tre fix6s. Pendant cette p6riode la mortalit6 est toujours trbs faible et de l'ordre de 2 s 3%. Les injections et les fixations ont 6t6 pratiqu6es ~ diff6rentes heures de la journ6e sans tenir compte d'6ventuelles variations nycth6m6rales de la prolif6ration ce]lulaire.

Traitement histologiqur et autoradiographique Les embryons sont fix6s durant 24 heures dans le liquide de Smith puis inclns dans la paraffine et d6bit6s en coupes s6ri6es de 5 ~ d'6paisseur. Apr~s d6paraffinage, les pr6parations sont recouvertes d'6mulsion nucl6aire Ilford L 4 non dilu6e. Apr~s 45 jours d'exposition s la temp6rature de 12~C, les autoradiographies sont r6v616es et fix6es selon les proc6d6s elassiques puis color6es par le vert de m6thyle et la pyronine (m61ange de Pappenhein-Urma).

Mdthodes de comptage Les histo-autoradiographies obtenues nous ont permis d'6valuer le poureentage de mitoses marqu6es, l'indice de marquage et l'indice mitotique s 4 temp6ratures dens le m6senchyme de

]~gude autoradiographique de l'influenee de la temp6rature m~senchyme

de la base du m e m b r e

ant~rieur

%MM ~

............. 2 6 ~

m0r : . . . , . ' . " i ' ~ . . . . . .

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4

17% 12~

'~

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I

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I

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i-" ! I

0

207

heures

8

12 16 20 24

30

36

42

48

56

64

72

84

100

Fig. 1. Courbes de variation du poureentage de mitoses marquees (MM*) en fonetion du temps ~coul6 apr~s une injection de thymidine griti6e, obtenues ~ diff6rentes temp6ratures dans le m6senchyme de la base du membre ang~rieur ehez des embryons de Pleurod~le au stade 34 la base du boargeon de membre, l'6pith61ium gastrique et le t~lene6phale. Ces tissus ont ~gg choisis en raison de leurs origines embryonnaires diHdrentes. Le mdsenchyme de la base du bourgeon de membre ant~rieur, d'origine m6sodermique, est form~ au stade 34 d'une population de cellules apparemment identiques et indiff~renei6es. Les cellules m6senchymateuses eonstituant les 4 ou 5 assises proximales du bourgeon song toujours marqu6es de rayon intense eg se distinguent nettemeng d'un massif cellulaire distal form~ de grandes cellules polygonales peu marquges. L'@ithdlium gastrique, d'origine endodermique, esg riche en plaquettes vitellines qui ggneng parfois les eompgages au stade 34. Les glandes digestives ne sent pas diff6renci6es, la prise de nourrigure ne d6butang qu'aux stades 36--37. YSe tdlenc@hale, d'origine ectodermique, est constigu6 au stade 34 d'une couche interne, dense et fiche en mitoses, et d'une couche externe, ls eg pauvre en noyaux. Apr~s ehaque intervalle de temps s~parant la fixation de l'injecgion de thymidine tritige une temp6rature donn6e, un seul embryon est sacrifi6 pour d6terminer le pourcentage de mitoses marqu6es, l'indice de marquage et l'indiee mitotique. Les courbes de variation du poureentage de mitoses marqu6es, ~tablies aux 4 temp6ratures choisies, nous ong permis de ealeuler graphiquement la duroc du cycle cellulaire et de ses phases eonform6ment s la m~ghode de Quastler et Shermann (1959). Nous avons interpr6t6 comme mitose, la phase du cycle cellulaire qui s'dtend de la fin de la prophase au d6but de la tglophase et durant laquelle les chromosomes song nettement individualis6s. L'indice de marquage, exprim6 en pourcengage, a 4t6 gtabli apr6s comptage de 1000 cellules environ au moyen d'un microscope s projection. Ce proe6d6 r~duit l'erreur de comptage s environ 10 cellules pour 1000 cellules. L'indice mitotique exprim6 par le nombre de mitoses pour 1000 cellules, a 6tg ~gabli aprgs comptage d'tm millier de cellules ~ l'aide d'une grille oculaire. Ce proc6d6 conduit s erreur de compgage d'environ 20 cellules pour 1000 cellules.

R~sultats

I. Influence de la tempdrature sur la durde du cycle cellulaire et de ses Thases 1. R 6 s u l t a t s e x p 6 r i m e n t a u x Les eourbes de v a r i a t i o n d u p o u r c e n t a g e de mitoses marqu6es, en f o n e t i o n d u temps, 6tablies a u x 4 t e m p 4 r a t u r e s choisies, s e n t donn4es d a n s la fig. 1 pour

208

G. Brugal: T,S en heures 9Z ! I I

~pifh61ium

I

80

gastrique

~t

',\

68

! \

\',,

i\

"-,.,

44

\

\\ Gi,G2,M

32

"~

erl heures

~'~ ""-~..

... - G I

~5 4 8

2

0 12

17

23

26 temp~rat ure enVC

Fig. 2. Courbes de variation de la dur6e du cycle eellulaire et de ses phases en fonction de la temp6rature, obtenues darts l'6pith61ium gastrique chez des embryons de Pleurodble au stade 34. L'6chelle des ordonn6es est 4 fois plus petite pour S et T que pour G1, G~ et M

le m6senchyme de Ia base du bourgeon de membre ant6rieur; des courbes de m6me type ont 6t6 obtenues pour les deux autres tissus. Elles permettent de calculer, darts chaque cas, la dur6e du cycle ccllulaire et de ses phases selon la m6thode de Quastler et Shermann (1959). Les r6sultats obtenus sont port6s darts le tableau 1. Les valeurs du tableau 1 permettent de tracer les courbes de variation de la dur6e du cycle mitotique et de ses phases en fonction de la temp6rature. Les courbes obtenues sont donn6es dans la figure 2 pour r6pith61ium gastrique. Des graphiques semblables ont 6t6 obtenus pour les deux autres tissus. Nous avons d6termin6, darts les trois tissus 6tudi6s, la fraction du cycle eellulaire oecup6e par chaque phase aux diff6rcntes temp6ratures. Les r6sultats obtenus, exprim6s en pourcentage du temps de g6n6ration, sont traduits par les courbes des fig. 3--5. Le rapport entre la dur6e du cycle cellulaire et de ses phases ~ 26 ~ C ct 12 ~ C a 6t6 calcul6 pour les trois tissus; ce rapport, ou coe]]icient de variation, traduit la sensibflit6 de la dur6e du cycle cellulaire et de ses phases aux conditions de temp6rature. Les r6sultats obtenus sont port6s clans le tableau 2.

]~tude autoradiographique de l'influence de la temperature

s%

--(~)

92 -

68 6O

209

~176176176176176176176176176176176176176176 ~176176176176176176176176176 I

I

12

I

17

I

23

26

temperature en=C

Fig. 3. Courbes de variation de la fraction du cycle eellulaire (exprim~e en poureentage du temps de g6n~ration) occup~e par ]a phase S en fonction de la temp6rature, dans ]e t6lene~phale (1), le m~senehyme de ]a base du membre ant6rieur (2) et l'6pith61ium gastrique (3) Tableau 1. Durdes du cycle cellulaire et de ses phases calculdes graphiquement d'apr~s les courbes de variation du pourcentage de mitoses marqudes dtablies h di]/drentes tempdratures dans 3 tissus d'embryons de Pleurod~le au stade 34. (Mdthode de Quastler et Shermann, 1959) Tissus

)/I6senehyme de la base du membre ant6rieur

Temperature (~

12

t7

23

26

12

17

23

26

12

17

23

26

91 0 79 6 6

40 1 31 4 4

24 4

22

92

6

0

16

14

2 2

1 1

82,5 3,5

42 1 34 2,5 4,5

32 4 24 1,5 2,5

29 6,5 20 1 1,5

93 0 81 4 8

48 4 38 2 4

32 5 24 1 2

30 7,5 21 0,5 1

Dur~es (h) T S G2 M

Epithelium gastrique

6

T~lenc6phale

Tableau 2. Coe//icients de variation de la durde du cycle cellulaire et de ses phases, entre 26 ~ C et 12 ~ C, clans 3 tissus d'embryons de Pleurod~le au stade 34. L a valeur du coe]/icient traduit la sensibilit~ des phases du cycle aux conditions de tempdrature. Cette sensibilitg se traduit par un allongement dans le cas de T, S, G 2 et M e t par u n raccourcissement clans le cas de G1 Tissus

Coefficients de variation entre 26 ~ C et 12~ C T

GI

4,14

~

Epith61ium gastrique

3,17

T61ene~phale

3,10

M~senchyme de la base du membre ant6rieur

S

G2

M

5,64

6

6

c~

4,13

3,40

4

cv

3,86

8

8

2. I n t e r p r e t a t i o n des r6sultats T o u t e s les courbes obtenues, t r a d u i s a n t la v a r i a t i o n du p o u r c e n t a g e de mitoses m a r q u e e s en f o n e t i o n du t e m p s 6coul~ apr~s l'injection, p r 4 s e n t e n t u n e g r a n d e rSgularit6 et u n p l a t e a u c o n s t a n t ~ 100 %. On p e u t en d6duire q u e :

210

G. Brugal:

les trois tissus ~tudi~s sont homog~nes et ne comprennent pas de souspopulations de cellules ayant des comportements mitotiques distincts; - - l'incorporation de thymidine triti6e, et par cons6quent la synth~se d'AD/q, est ininterrompue durant route ia phase S. Action de la tempdrature sur le temps de gdndration. Variation de la dur6e absolue (tableau 1): dans les trois tissus ~tudi6s, lc temps de g6n~ration d6croit rapidement lorsque la temp6rature s'61~ve de 12 ~ C ~ 17 ~ C, puis plus lentement au-dessus de 17 ~ C. Cette variation du temps de g6n6ration se traduit par une courbe ayant la forme d'une branche d'hyperbole (fig. 2). Coefficient de variation (tableau 2) : lorsque la temperature s'abaisse de 26 ~ C 12 ~C le temps de g4n6ration est multipli6 par un coefficient de 3,10 s 4,14 selon les tissus. Le tableau 2 montre que le m4senehyme de la base du bourgeon de membre est le plus sensible aux variations de temp6rature, puis viennent par ordre de sensibilit6 d~croissante, l'~pith~lium gastrique et le t61enc6phale. Action de la tempdrature sur la durde de la phase S. Variation de la dur6e absolue (tableau 1): dans les trois tissus ~tudi6s, la dnr6e de la phase S d6crolt quand la temp6rature s'~l~ve de 12 ~ C ~ 26 ~ C; cette variation se traduit, eomme pour le temps de g6n6ration, par une eourbe ayant la forme d'une branche d'hyperbole. Le parall~lisme entre les variations de ia duroc de la phase S et du temps de g~n6ration traduit le fair que, selon ia temp6rature, ia synth~se d'ADN occupe 70% ~ 90% de la dur4e du cycle celluiaire. Variation de ia fraction du cycle mitotique oeeup~e par la phase S (fig. 3): dans les trois tissus 6tudi4s, la fraction du cycle cellulaire occup~e par la phase S est importante ~ routes les temp6ratures choisies et atteint 90% ~ 12 ~ C. Cette fraction d~erolt de fa~on semblable dans les trois tissus lorsque la temp6rature s'61~ve de 12 ~ C ~ 26 ~ C. Coefficient de variation (tableau 2) : lorsque la temperature s'abaisse de 26 ~ C 12 ~ C, la dur6e de la phase S est multipli4e par un coefficient variant entre 3,86 et 5,64 selon les tissus. La comparaison du coefficient de variation de la dur6e de la phase S des trois tissus fair apparaitre que le m~senehyme de la base du bourgeon de membrc ant4rieur pr6sente la phase S la plus sensible aux conditions de tempSrature; puis viennent, par ordre de sensibilit4 d~eroissante, l'6pith41ium gastrique et le t61encSphale. Influence de la tempdrature sur la durde des phases G~ et M. Variation de ]a duroc absolue (tableau 1): quelle que soit la temp6rature, ia dur6e de la phase G2 est toujours inf~rieure ou 5gale ~ celle de ia phase M. Ces deux phases sont abr~g4es proportionnellement ~ l'51~vation de temperature entre 12~ et 26~ dans le m6senehyme de ia base du bourgeon de membre et l'4pith4lium gastrique, et entre 17 ~ C et 26 ~ C dans le t~lene4phale. Variation de la fraction du cycle cellulaire oceup6e par les phases G2 et M (fig. 4) : quclle que soit la temperature, ia fraction du cycle cellulaire occup~e par la phase G2 est toujours inf4rieure ou 4gale ~ celle occup~e par la phase M; elle d4croit avec l'~l~vation de temp6rature entre 17 ~ C et 26 ~ C dans le t~lenc~phale et entre 12 ~ C et 26 ~ C dans l'~pith~lium gastrique et le m4senehyme de ia base du bourgeon de membre. Darts ees deux derniers tissus, la d4eroissancc est particuli~rement sensible au-dessus de 23 ~ C. Les fractions du cycle eellulaire occupies 9~ar les phases G~ et M varient, dans un m6me tissu, de fa~on identiquc (m~s-

-

]~tude autoradiographique de l'influenee de la temp6rature

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