Klinische Wochenschrift

Klin Wochenschr (1990) 68 : 1066-1070

9 Springer-Verlag 1990

Autoantikiirper gegen die Komplementkomponente Clq beim Systemischen Lupus Erythematodes U. Antes 1, H.P. Heinz 1, K. Hartung 2 und M. Loos 1 1 Institut fiir Medizinische Mikrobiologie, Johannes Gutenberg-Universit/it Mainz 2 Abteilung Immunologie und Transfusionsmedizin, Medizinische Hochschule Hannover

Autoantibodies against the Complement Component Clq in Systemic Lupus Erythematosus Summary. Autoantibodies against Clq, a subcomponent of the first complement component C1, could be detected in 49.4% of sera from patients with systemic lupus erythematosus (SLE). They are directed against the collagen-like portion of the Clq molecule and recognize only bound, but not fluid-phase C1 q. The appearance of these autoantibodies in the course of SLE correlates with the detection of IgG in the Clq-Solid-Phase-Bindingassay, with high titres of dsDNA-antibodies and with depressed total complement activity (CH50) and Clq-values. Our investigations show that autoantibodies against the collagen-like portion of bound Clq but not immune complexes are the main constituent of Clq-binding IgG in SLE. Key words" Systemic lupus erythematosus - Autoantibodies - Immune complexes - Complement Clq Collagen like region

Der Systemische Lupus Erythematodes (SLE) wird als der Prototyp der Immunkomplexerkrankung beim Menschen angesehen [18, 19]. Charakteristisch ffir den SLE ist das Auftreten von Autoantik6rpern mit vielf/iltigen Spezifitfiten, die ffir die Pathogenese, Diagnostik und Verlaufskontrolle Abki~rzungsverzeichnis: ABTS - 2,2'-Azino-di(3-ethylbenzthiazolinsulfansiiure) ; A R A = American Rheumatism Association; E L I S A = E n z y m e - l i n k e d Immunosorbent Assay; C I - I N H = C1-Esteraseinhibitor; C l q - S P B A = C l q - S o l i d Phase Binding Assay; CH50 = Gesamth/imolytische Komplementaktivit/it, NHS=Normalhumanserum; P B S = P h o s p h a t p u f f e r (Phosphate buffered saline); SDS = Natriumdodecylsulfat; SLE = Systemischer Lupus Erythematodes

der Erkrankung eine Rolle spielen [34]. Vor allem hohe Titer von Autoantik6rpern gegen Doppelstrang(ds)-DNS und der Nachweis von DNS-antiDNS-Immunkomplexen stellen krankheitsspezifische Marker ffir den SLE dar und korrelieren mit der Krankheitsaktivit/it [3, 8, 22]. Bei der Pathogenese des SLE kommt der Interaktion von Autoantik6rpern und Immunkomplexen mit dem Komplementsystem besondere Bedeutung zu. Als direkter Reaktionspartner ffir Immunkomplexe fungiert Clq, eine Untereinheit der ersten Komplementkomponente C1 [28, 29]. Das Clq-Molek/il bindet fiber seine globul/iren Strukturen an Fc-Stficke in Antigen-Antik6rper-Komplexen und erf/ihrt dadurch eine Konformationsfinderung [10, 24, 25, 31], die das Startsignal ffir die Aktivierung der klassischen Komplementkaskade darstellt. Beim Ablauf dieser internen C1-Aktivierung dissoziiert C1 durch den Cl-Inhibitor (CI-INH) in Immunkomplex-gebundenes Clq und in den Clr2-Cls2-Cl-INH-Komplex [7, 36]. Im Laufe der Komplementaktivierung entstehen biologische aktive Spaltprodukte, die maBgeblich am Entzfindungsprozel3 und der Gewebel/ision beteiligt sind (Abb. 1). Als typisches Merkmal ffir den SLE wurden in diesem Zusammenhang von Agnello et al. [2] sowohl hochmolekulare als auch niedrigmolekulare ,,Clq-Pr/izipitate" beschrieben. Weiterhin zeigt der Clq-Solid-Phase-Bindingassay (ClqSPBA) [13] besonders gute Ubereinstimmung mit dem Krankheitsbild des SLE [1, 23]. Kfirzlich konnten wir durch Ultrazentrifugationsstudien und Absorptionsexperimente beweisen, dab es sich bei dem im Clq-SPBA nachgewiesenen 7S-IgG nicht um Immunkomplexe oder um DNS-anti-DNS Komplexe handelt [3, 12], sondern um Antik6rper gegen C l q [6]. Diese Antik6rper erkennen Clq nur dann, wenn es in gebundener

U. Antes et al. : Autoantik6rper gegen die Komplementkomponente C lq C1

*

Antigen - AnPikorper -

Komptexe

Clr 2

C1s2 I Aktivierung

%S/ C2

~[

t

~ C4bZa

'-,\\,2

,K-c,r

9

Abb. 1. f.)bersicht fiber die Aktivierung der klassischen Komplementkaskade dutch Immunkomplexe: Reaktion von Immunkomplexen mit CI, interne C1-Aktivierung und Entstehung CI q-tragender Immunkomplexe

Form, z.B. an Immunkomplexe oder Oberflilchen vorliegt. Enzymatische Fragmentierung von C l q zeigte, daB die Autoantik6rper aus SLE-Seren gegen die kollagenartigen Anteile yon Clq gerichtet sind. Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es, an einer gr6geren Anzahl von SLE-Patienten Autoantik6rper gegen C l q nachzuweisen und diese mit anderen immunologischen Parametern wie dsDNS-Antik6rpern, Gesamtkomplementaktivitilt, Clq-Gehalt und Clq-SPBA zu korrelieren. Die Beteiligung von Clq an der Pathogenese des SLE soll diskutiert werden. Patienten und Methoden Die immunologischen Untersuchungen wurden an 168 Seren von Patienten mit SLE vorgenommen,

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die im Rahmen der multizentrischen SLE-Studie an der Medizinischen Hochschule Hannover gesammelt wurden. Die Diagnose der Erkrankung wurde nach den ARA-Kriterien [33] gestellt. Die Seren wurden portioniert bei - 2 0 ~ aufbewahrt und unmittelbar vor den Tests bei 37 ~ C aufgetaut. Als Kontrolle wurde Serum von gesunden Spendern verwendet (NHS). Die Bestimmung der Gesamtkomplementaktivitilt (CH50), der Clq-Proteinkonzentration und der Clq-SPBA wurden nach frfiher beschriebenen ELISA-Methoden durchgeffihrt [4, 5, 15]. Zum Nachweis von dsDNS-Antik6rpern wurde ein ELISA-System mit festphasengebundener dsDNS entwickelt [6]. Clq aus Humanserum wurde nach der Methode von Stemmer und Loos [32] gereinigt. Die Reinigung der globulilren Strukturen von C l q erfolgt nach Spaltung mit Kollagenase wie in frfiheren Arbeiten beschrieben [14]. Die kollagenartigen Teile von C l q wurden nach enzymatischer Spaltung von humanem Clq mit Pepsin nach der Methode von Reid [29] gereinigt. Proteinbestimmungen wurden nach Lowry et al. [26] durchgeffihrt, zur Reinheitsprfifung der Prilparationen wurde die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese [21] herangezogen. Zum Nachweis von Antik6rpern gegen die kollagenartigen Teile von C l q wurde ein ELISA entwickelt: Mikrotiterplatten wurden 1 Std. bei 37 ~ C mit gereinigten kollagenartigen Fragmenten yon C l q beschichtet (Konzentration 20 gg/ml in 10 mM Phosphatpuffer (PBS), pH 7,4; K = 15 mS). Danach wurde mit 2% Magermilchpulver in PBS abgesilttigt (1 Std bei Zimmertemperatur). Anschliel3end wurde 1 Std. bei Zimmertemperatur mit Patientenserum inkubiert (verdiinnt in 10 m M Phosphatpuffer pH 7,4; K = 40 mS). Gebundene Antik6rper gegen C l q wurden mit peroxidasemarkiertem F(ab')z-Antik6rper gegen Human-IgG (Dianova, Hamburg) in einer Arbeitsverdiinnung von 1:200 nachgewiesen. Als Substrat wurde 5 mM ABTS (Sigma, Deisenhofen) mit 1% Wasserstoffperoxid verwendet, als Substratpuffer wurde 10 m M Citratpuffer pH 4,3 gewilhlt. Der Gehalt an Antik6rpern gegen Clq im Patientenserum wurde anhand der gemessenen Absorption bei 414 nm quantifiziert. Ergebnisse Zum Nachweis von Autoantik6rpern gegen C l q wurde in friiheren Untersuchungen der C l q SPBA eingesetzt [6]. U m herauszufinden, gegen welche Strukturen im Clq-Molekfil die Autoantik6rper

1068

U. Antes et al. : AutoantikSrper gegen die Komplementkomponente C l q

gerichtet sind, wurde gereinigtes Clq enzymatisch in globul/ire und kollagenartige Teile fragmentiert. Beide Fraktionen wurden mit gereinigten Antik6rpern aus SLE-Seren zur Reaktion gebracht. Es zeigte sich, dab die Autoantik6rper aus SLE-Seren die kollagenartigen Strukturen des Clq-Molekfils, nicht die globul/iren Teile erkennen (Abb. 2). Bei dem Testsystem des Clq-Solid-Phase-Bindingassay ist neben der Detektion von Autoantik6rpern gegen Clq auch ein Nachweis von Immunkomplexen mSglich. Um dies zu umgehen, wurde ein ELISA-Test zum direkten Nachweis von Autoantik6rpern gegen die kollagenartigen Teile von Clq aufgebaut. Dazu wurden die gereinigten kollagenartigen Fragmente von humanem Clq an Mikrotiterplatten fixiert und gebundene AutoantikSrper aus Patientenserum mit peroxidasemarkiertem F(ab')z-Antik6rper gegen humanes IgG detektiert. Mit dieser Methode konnten AutoantikSrper gegen Clq bei Seren von Patienten dosisabh/ingig bis zu Verdiinnungen von 1:1000 nachgewiesen werden, w/ihrend Seren von gesunden Personen (NHS) negativ waren. Die Bindung von IgG aus Patientenserum an Festphasengebundenes Clq konnte durch Zugabe von Fliissigphasen-Clq im Oberschul3 nicht blockiert werden. Dies zeigt, dab die AutoantikSrper aus SLE-Seren kein Flfissigphasen-Clq, sondern nur gebundenes Clq erkennen, das durch den konformationsge/inderten Kollagenteil charakterisiert ist (Abb. 3). In zus/itzlichen Experimenten wurde festgestellt, dab die Zugabe von Clq-Kollagenanteilen zu Patientenserum die Bindung der Autoantik6rper an Festphasengebundenes Clq reduzierte. Bei den untersuchten SLE-Seren waren sowohl die gesamth/imolytische Komplementaktivit/it (CH50) als auch der Clq-Gehalt stark erniedrigt. AntikSrper gegen dsDNS waren bei 90,4% der SLE-Seren nachweisbar. Im Clq-SPBA zeigten 78,6% der SLE-Seren eine positive Reaktion ffir IgG. Die gesamth/imolytische Komplementaktivit/it (CH50) war bei 89,9% der Proben sehr stark erniedrigt (CH50 kleiner 10 Units/ml; Normbereich 20-25 Units/ml); ebenso konnte bei 41,7% der Seren ein erniedrigter Clq-Proteingehalt festgestellt werden (weniger als 140 gg/ml, Normalwert 180 gg/ml). Um zwischen Immunkomplexen und Antik6rpern gegen Clq zu differenzieren, wurden die Seren im ELISA zum Nachweis von Antik6rpern mit festphasegebundenen kollagenartigen Teilen von Clq getestet. In diesem Test zeigten 49,4% der SLE-Seren Antik6rper gegen die kollagenartigen Teile von Clq (Tabelle 1). Alle SLE-Seren, bei denen Autoantik6rper ge-

Cpm x 1000 10-

8 6-

4

2

0

IgG NHS

IgG SLE- Serum

IgG NHS

IgG SLE- Serum

Clq- Fragmenle

kollagenartige Teile

~

globul~ire Teile

Abb. 2. Immunpr/izipitation von kollagenartigen und globulfiren Fragmenten von C l q mit gereinigtem IgG aus SLE-Serum und IgG aus Normalhumanserum (NHS) in Anwesenheit von 5% Polyethylenglykol

Extinktlon (414nm) 1600 Bindung im Clq- SPBA 1400

12oo 1000 800 600

4O0

-~

//

SLE- Serum

9.-t-- SLE- Serum § Clq

200 0

i

p

i

*

i

i

i

1:640 1:320 1:160 1:80 1:40 1:20 1:10

SerumverdUnnung

Abb. 3. EinfluB yon Flfissigphasen-Clq auf die Bindung von AutoantikSrpern gegen C l q aus SLE-Serum an FestphasenC l q im Clq-SPBA

Tabelle 1. Komplementspiegel und Nachweis von Autoantik6r-

pern bei SLE Seren. Anzahl der Seren: N = 168 Untersuchungsparameter

Positive Seren Anzahl

in Prozent

151 70

89,9 41,7

AntikSrper gegen dsDNS

152

90,4

Clq-Solid-Phase Binding-assay (CIq-SPBA) IgG

132

78,6

83

49,4

CH50 kleiner 10 Units/ml Clq-Proteingehalt kleiner 140 gg/ml

Antik6rper gegen Clq-kollagenartige Teile

U. Antes et al. : Autoantik6rper gegen die K omplementkomponente C lq TabeUe 2. Autoantik6rper gegen die kollagenartigen Teile von C l q bei SLE Seren. Korrelation mit den Ergebnissen des C l q SPBA, dem Nachweis yon dsDNS-Anfik6rpern, der Bestimmung der Gesamtkomplementaktivit/it (CH50) und des C l q Proteingehalts SLE-Seren mit Autoantik6rpern gegen C l q (N= 83)

- positiv im Clq-SPBA N = 8 3 (100%) - anti-dsDNS positiv N = 79 (95,2%) CH50 weniger als 10 Units/ml N - 78 (94,0%) Clq-Proteingehalt kleiner 140 lag/ml N - 37 (44,6%)

gen Clq nachgewiesen wurden, reagierten positiv im Clq-SPBA und 95,2% zeigten Antik6rper gegen dsDNS. AuBerdem korrelierte das Auftreten von Antik6rpern gegen C l q mit stark erniedrigter Gesamtkomplementaktivit/it; 94% der Proben, die Antik6rper gegen Clq enthielten, hatten CH50Werte kleiner als 10 Units/ml, aul3erdem war bei 44,6% der Seren der Clq-Gehalt erniedrigt (Tabelle 2). Diskussion

Serologische Studien haben gezeigt, dab das Auftreten von Autoantik6rpern mit vielf/iltigen Spezifit/iten, von Immunkomplexen und Komplementerniedrigung mit der Krankheitsaktivit/it beim SLE korreliert. Unsere Untersuchungen konzentrierten sich auf die Charakterisierung des IgG, das im Clq-Solid-Phase Bindingassay (Clq-SPBA) [13] bei SLE nachgewiesen wird. Durch Ultrazentrifugationsstudien, Absorptionsexperimente und enzymatische Fragmentierung konnte gezeigt werden, dab nicht Immunkomplexe, sondern Autoantik6rper gegen die Kollagenteile von C l q den Hauptbestandteil des Clq-bindenden IgG beim SLE darstellen [6]. Antik6rper gegen die kollagenartigen Teile von gebundenem C l q konnten bei 49,4% der Seren von Patienten mit Systemischem Lupus Erythematodes (SLE) nachgewiesen werden. Das Auftreten der Autoantik6rper gegen Clq korreliert mit starker Erniedrigung des Komplementspiegels und mit dem Nachweis von dsDNS-Antik6rpern. Bei den beschriebenen Autoantik6rpern gegen Clq ist hervorzuheben, dab diese nicht gegen das native Molekfil, sondern gegen Neoepitope in C l q gerichtet sind, die erst nach Bindung, z.B. an Immunkomplexe auftreten [24, 31]. Dieser Mechanismus k6nnte bei der Entstehung von Autoantik6r-

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pern gegen Clq eine Rolle spielen. Im Krankheitsverlauf des SLE entstehen durch die Anwesenheit von Autoantik6rpern mit verschiedenen Spezifit/iten st/indig Clq-bindende Immunkomplexe, bei denen der konformationsge/inderte Kollagenteil von Clq die Bildung von Autoantik6rpern provozieren k6nnte. Ein fihnlicher Mechanismus ist bei der Bildung von Rheumafaktoren bekannt, die als Antik6rper gegen strukturver/inderte Fc-Stficke von Immunglobulin anzusehen sind [20]. Analog zur Bildung von Rheumafaktoren, die vor allem bei der rheumatoiden Arthritis vorkommen, werden beim SLE Autoantik6rper gegen den konformationsgefinderten Kollagenteil yon C l q nachgewiesen. Nicht ganz auszuschlieBen ist, dab die niedermolekulare (low molecular weight, LMW) Form von Clq, die nach Hoekzema et al. [16] im Serum von Patienten mit SLE vermehrt auftritt, mit der Autoantik6rperbildung gegen Clq assoziiert ist. Da Martin und Loos [27] jedoch zeigen konnten, dab das LMW-Clq physiologischerweise von monozyt/iren Zellen gebildet wird, erscheint diese M6glichkeit weniger wahrscheinlich. Im Hinblick auf die Struktur und Funktion des Clq-Molekfils werden ffir die Beteiligung der Autoantik6rper gegen Clq an der Pathogenese des SLE mehrere M6glichkeiten diskutiert. Autoantik6rper gegen C l q k6nnten an zirkulierende oder gewebest/indige Immunkomplexe gebunden werden, dadurch selbst zur Komplementaktivierung ffihren und den entzfindlichen Krankheitsprozel3 verst/irken. Dies k6nnte eine Erkl/irung ffir die Erniedrigung der Gesamtkomplementaktivit/it fiber einen 1/ingeren Zeitraum sein, wie sie bei SLE-Patienten beobachtet wird. Darfiberhinaus k6nnten Immunkomplexe aus gebundenem Clq und Antik6rper gegen Clq zu einer bevorzugten Ablagerung, vor allem im vaskulfiren Bereich, z.B. der Niere, ffihren. So konnten Ablagerungen von Clq h/iufiger bei Lupus Nephritiden als bei anderen Glomerulonephritiden nachgewiesen werden [11, 18]. Autoantik6rper gegen Clq k6nnten die Eigenschaften yon Clq-tragenden Immunkomplexen, wie Gr6Be, L6slichkeit oder Clearance fiber Komplement- und Fc-Rezeptoren [9, 35] beeinflussen. Weiterhin k6nnten Kreuzreaktivit/iten der Autoantik6rper gegen C l q mit anderen Strukturen, z.B. Kollagen oder Basalmembranbestandteilen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese des SLE spielen. Danksagung. Diese Untersuchungen wurden gef6rdert durch B M F T 01 ZU 86025 und SFB 311 D1, D2.

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U. Antes et al. : Autoantik6rper gegen die Komplementkomponente C1 q

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