189
Chlamdia
pneumoniaeとChlamydia
trachomatis
分 離 法 に 関 す る研 究 北 里 大 学 衛生 科 学 検査 研 究 セ ンタ ー 和
Key words:
山
行
(平成3年10月3日
受 付)
(平成3年11月18日
受 理)
Chlamydia pneumoniae, HL cells. HeLa-229cells
要 Chlamydia
pneumoniaeとChlamydia
新 法 の 概 要 は,次 養 したHL細
の 様 で あ る;メ
胞 とHeLa-229細
正
Chlamydia
trachomatis,
旨
trachomatisの
同 時 分 離 な ら び に 同 時 鑑 別 同 定 法 を 確 立 した.
ン ブ ラ ン フ ィ ル タ ー で 処 理 した 検 体 を,8穴
胞 に 接 種 し,72時
間37℃CO2
incubatorで
ス ラ イ ドチ ャ ンパ ー で 培
培 養 後,モ
ノク ロナ ール抗体
を 用 い た 蛍 光 抗 体 法 に よ り同定 す る. こ の 方 法 を 用 い て,耳
鼻 咽 喉 科 領 域 の109件 か ら ク ラ ミ ジ ア 多 種 同 時 分 離 培 養 同 定 を 試 み,11株
(10.1%)のChlamydia
pneumoniaeと10株(9.2%)のChlamydia
trachomatisと
を 分 離,同
定するこ
とが で き た.
るC.
は じめ に ヒ ト よ り最 近 分 離 さ れ 新 た な ク ラ ミ ジ ア 種 と し て 認 知 さ れ たChlamydia 株1)(以
pneumoniae
下 単 にCpneumoniaeと
を 含 め た 急 性 呼 吸 器 感 染 症,更
し て い る20).よ
TWAR
略 す)は,肺
pneumoniaeの
炎
に は 滲 出性 中 耳 炎
浸 淫 状 況 は,50%以
っ て,C.
pneumoniaeの
そ こ で,C.
pneumoniaeの
分 離 培 養 に最 も適 し
て い るHL細
Chlamydia
従 来 か ら用 い ら れ て い るHeLa-229細
め 新 生 児 肺 炎,扁
行為感 染症 をは じ
桃 炎 等 の重 要 な原 因微 生 物 で あ
C. trachomatisは,一
般 にMcCoy細
胞,HeLa-
229細 胞 等 を 用 い て 分 離 継 代 さ れ て い る13)∼16).し か し,C. pneumoniaeは
pneumoniaeの
の 結 果,従
世 界 的 に も 少 な い17)18).そ
1990年10月
染 症 の 研 究 は,主
に血清学 的検 査
法 に よ っ て な さ れ て い る17)18).そ の 我 が 国 に お け 別刷 請 求 先:(〒108)東
京 都 港 区 白金5-9-1
北 里 大 学衛 生 科 学検 査 研 究 セ ンタ ー 和山 平 成4年2月20日
行正
同 時 分 離 培 養 を 試 み た.そ 胞
材 料 と方 法
229細 胞 で の 継 代 培 養 は 難 し く,そ の 分 離 成 功 例 は 邦 で のC
胞 の二種 類
床 材 料 か らC.trachomatis
来 か ら 用 い ら れ て い るHeLa229細
分 離 さ れ た 株 で も,HeLa.
こ で,本
離 に
単 独 に よ る 方 法 に 比 べ 優 れ た 成 績 を 得 た.
1.材
Pneumoniae感
胞21)∼23)及びC.trachomatis分
の 培 養 細 胞 を 用 い,臨 及 びC.
る と考 え られ て い る8)∼12).
分離 培養
法 の 確 立 は 臨 床 医 学 に と っ て 重 要 と 考 え ら れ る.
等 の 原 因 微 生 物 と し て 注 目 さ れ て 来 た2)∼7).他 方, trachomatisは,性
上 と報 告
さ れ て い る が19),こ の 結 果 は,諸 外 国 の 報 告 と 一 致
料
院 に お い て,扁
よ り1991年2月 桃 炎,気
管 支 炎,中
ジ ア 感 染 を 疑 わ れ た 患 者107名 疾28件
・扁 桃 陰 窩 内 容 物65件
計109例
を 実 験 に 供 し た.
2.方
法
まで に北 里 研 究 所 病 耳炎 の クラ ミ
よ り採 取 さ れ た 喀 ・中 耳 貯 留 液16件
の
和 山 行正
190
1)検
体 の前処理
行 っ た.蒸 留 水 で 洗 浄 後,Giemsa染
検 体 は 綿 棒 に て 採 取 後,す phate
ぐ にSucrose
phos-
glutamin,以
下SPGと
に 入 れ,1分
間 ミキ サ ー に て 誘 出 処 理 後 メ ン ブ ラ
略 す)2ml入
ン フ ィ ル タ ー(0.45μm径 リ ポ アK. K)に 2)ス
り試 験 管 容 器
マ イ レ ク スHA,日
て ろ 過 し,た
本 ミ
だ ち に 使 用 し た.
下 に述 べ る方 法 を 用 い
た. ら 分 与 さ れ たHL細
胞 を2×105個/ml濃
胞22)とHeLa.229細
minimum
medium)
Laboratories,
(MEM,
Clara,
CA)に
slide(Nunc,
GIBCO
て 調 整 し た.無 Inc.)にHL細
胞 調 整 液 を 各4穴 CO2
下 グ リセ リ ン と 略 す)で
ア セ トン で10分 間 固 定 し た ス ラ イ ド上 の
細 胞 を 風 乾 後,C.
Pneumoniaeに
C. Pneumoniaeマ
ウ ス モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体(Wa-
液(以
下PBSと
0.003%
略 す)に
dextranと
後,2,000G60分 分CO2
遠 心,吸
incubatorに
静 置 し た.
ン ブ ラ ン フ ィル
つ 接 種 し軽 く振 壷 に37℃60
mMg
glucous,0.001%cyclo-
incubatorに
除 去 後,キ
て 静 置 培 養 し た.培
ャ ピ ラ リ ー に て1穴
及 びHeLa-229細 200μlに
加 え37℃72時
胞
胞 を は ぎ 取 り,そ れ ぞ れSPG液
再 浮 遊 さ せ 一70℃ に 凍 結 保 存 し た.ス
ま た,C.
trackomatis陽
ラ
99%メ
色 法
(Washington
色
Research
色 を 室 温30分
述
ポ ッ ト
清 型 別 抗C
Foundation,
浄 し,FITC標
(ZYMED,CA)20倍
Seattle.) のせ
識 抗 マ ウ スIgG抗
希 釈 液 を の せ 反 応,洗
体
浄,封
入 し て 観 察 し 血 清 型 別 を 同 定 し た. 潤 箱 に て30分
間 室 温 の条 件 で
行 っ た. 結 1.臨
果
床 材 料 か ら の ク ラ ミジ ア の 分 離 胞 及 びHL細
胞 を用 い た場合 の臨
床 材 料 か ら の ク ラ ミ ジ ア の 分 離 結 果 をTable1
よ り分 離 さ れ た21例
ア の うち10例(47.6%)はC.
あ っ た.C.
間
HL細
胞 で6例,HL細
分 離 さ れ た.分
は,HeLa-299細
の ク ラ ミジ
trackomatisで,11
例(52.4%)はCpneumoniaeで
で11例
タ ノ ー ル で10分 間 固 定 し た ス ラ イ ド上 の
細 胞 を 風 乾 後,May-Grunwald染
血 清 型 別 は,ス 記 固 定 後,血
10倍 希 釈 液 を そ れ ぞ れ の ス ポ ッ トに10μl毎
pneumoniaeは,HeLa-229細 Giemsa染
応 後,前
ウ ス モ ノ ク ロ ナ ール 抗 体 キ ッ ト
臨 床 材 料109例
て ス ポ ッ トを 作 製 し,後 述 す る 血 清 型 別 を 調 べ た.
a.May-Grunwald
せ,反
に 示 し た.
性 例 は,感 染HeLa-299
細 胞 再 浮 遊 液 の 一 部 を 無 蛍 光 ス ラ イ ドに ペ ン 先 に
3)染
trackomatisマ
HeLa-229細
イ ド ・チ ャ ン バ ー は60分 間 風 乾 した.
識 抗C
入 し観 察 し た.
trackomatisの
養液 を吸引
分 の 感 染HL細
つ い て は,FITC標
液 を50μ1の
反 応 は す べ て,湿 間
識 抗 マ ウ スIgG抗
ウ ス モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体(Syva,
Alto,CA)原
反 応 後,洗
ラ ミジ ア 培 養 用 培 養 液(2
加MEM)を0.5ml毎
Palo
ま た,C.
て 静 置 し細 胞 に 吸 着 さ せ た.
lutamine,0.059%
trachomatisに
し た ス ラ イ ド標 本 を,上
内 容 液 を 吸 引 除 去 後,ク
heximid
Seattle.)20倍
希 釈 液 を の せ 反 応 後,同
し た よ う に 洗 浄,封
下DEAE-
着 さ せ た 後,更
Foundation,
リセ リン 封 入 し 蛍 光 顕 微 鏡 に て 観
tmkomatisマ
養液
洗 浄 し,pH7.0,
加 え 室 温30分
穴200μlず
様 に 洗 浄 し,グ
bufferedsaline
吸 引 除 去 後,メ
タ ー 処 理 検 体 を,各
体(ZYMED,CA)20倍
つ 分 注 し,37℃
て2回
た い し て は,抗
洗 浄 し た.FITC標
Santa
C.
Hanks液(以
略 す)を
DEAE-dextranを
留 水 で2回
察 し た.
Phosphate
DEAE-dextran
Research
essential
間 後,培
封 入 し検
モ ノ ク ロナ ー ル 抗 体 を用 い た 蛍 光 抗 体 法
胞 及 びHeLa.229細
て 培 養 し た.24時
を 吸 引 除 去 しpH7.2
CO2
b.
蛍 光8穴chamber
ご と500μlず
incubatorに
リセ リ
酸一重 炭 酸 ソー
希 釈 液 を50μlの せ 反 応 さ せ た 後,PBSで3回,蒸
度 に 細 胞 増 殖 用 培 養 液(10%
加 熱 牛 胎 児 血 清 加Eagle's
リ セ リ ン:0.5M炭
ダ=9:1,以
shington
Kuoか
び 蒸 留 水 で 洗 浄 後,pH9.0グ
鏡 し た.
96%冷
ラ イ ド ・チ ャ ン パ ー 分 離 培 養 法
基 礎 的 検 討 を し た 後,以
間 行 っ た.再 ン 緩 衝 液(グ
glutamin液(7.5%Sucrose,0.072%
色 を 室 温30分
離 さ れ たC.
胞
Pneumoniae
胞 を 用 い て 分 離 し た 場 合 よ り,
胞 を 用 い て 分 離 し た 場 合 の 方 が,封
感染症学雑誌
入体 の
第66巻 第2号
C. PneumoniaeとC.
Table
1
Isolation
clinical
*
**
Two
of
patients
shed
both
No. of isolation/No.
trachomtis10例
Chlamydia
pneumoniae
191
離 法 に関 す る研 究
and
Chlamydia
trachomatis
from
specimens
大 き さ 及 び そ の 数 も 多 か っ た.ま C.
trackomatis分
の う ち8例
species
of Chlamydiae
of specimen
た,分
離 され た
は,HL細
Table
2
from
胞 では
Sero
clinical
types
of C. trachomatis
isolation
specimens
分 離 さ れ な か っ た. 喀 痰 材 料 で は,26症 分 離 さ れ た.3例
例28検
体 中3例(10.7%)
の うち1例
み が 分 離 さ れ た.し C. pneumoniae,
はCtmckomatisの
か し,残
り2例
HeLa-229細
はHL細
胞 でC.
胞 で 試 み た と こ ろ,結
果 に 示 し た よ う にC.
の 両 方 の ク ラ ミ ジ ア が 同 一 症 例 検 体 よ り分 離 さ れ
pneumoniaeは,HeLa-229細
胞 を 用 い る よ りHL
た.
細 胞 を 用 い た 方 が 分 離 率 が 高 く,逆
扁 桃 陰 窩 内 容 物 材 料 で は,65症 (18.5%)分
離 さ れ た.12例
chomatisが,6例
はC.
trachomatis
例65検
の う ち6例
体 中12例 はC.
pneumoniaeが
tra-
分離 され
中 耳 貯 留 液 材 料 で は,16症 (25.0%)分
離 さ れ た.4例
chomatisで
あ り,3例
例16検
の う ち1例
はC.
はCtm-
pneumoniaeが
桃 陰 窩 内 容 物,中
trachomatis, C.
耳 貯 留 液 材 料 で は,
pneumoniaeの
両方 の クラ ミ
ジ ア が 分 離 さ れ た 症 例 は な か っ た. 2.分
離C.
trachomatisの
清 型 別 をTable2に HeLa-229細 chomatisの
HL細
trachomatisの
血
のCtm.
血 清 型 別 は,E型3例,D型2例,F型
胞 はMasabら
ら に よ っ て,CC.
で あ っ た.
に よ り樹 立 さ れ21),Kuo 対 して 感 受 性 の よ
い こ と が み い だ さ れ た も の で あ る22)23). そ こ で,臨
床 材 料 を もち い て ク ラ ミジ ア分 離 を
平成4年2月20日
を 示 す も の で,こ
性
pneumoniaeの 例 は,ク
両 方 が 同
ラ ミジ ア の複 合 感 染
の結 果 か ら も少 な く と も これ ら れ ら
ク ラ ミジ ア感 染 症 を研 究 して い く うえで 重 要 な 問 の 場 合,今
回 用 いた ス ラ イ
ドチ ャ ン バ ー 法 は 多 種 類 の ク ラ ミジ ア の 同 時 分 離 培 養 に 最 も適 し た 有 用 な 方 法 で あ る と 考 え る.ま た,ス
ラ イ ドチ ャ ン バ ー の 破 損 を 防 ぐ意 味 で 用 い
た.96穴
察
pneumoniaeに
trackomatisとC.
時 に 分 離 さ れ た2症
題 で あ る と考 え る.そ
示 し た.
考
pneumoniaseの
複 合 感 染 に 関 す る報 告 は 世 界 的 に も例 が な く今 後
胞 に よ り分 離 さ れ た10例
2例,G型1例,I型1例,K型1例
trackomatisとC.
2種 類 の 細 胞 を 同 時 に 使 う必 要 性 が あ り,こ
血 清型別
臨 床 材 料 よ り分 離 さ れ たC.
胞 の 感 受 性 の違 い に よ る もの で あ
質 の 相 違 を 示 唆 し て い る も の と 考 え ら れ る. C.
さ れ た. ま た,扁
類 の 細 胞 を 同 時 に 使 う必 要 性 が あ る.
り,同 時 にC. 分離
tra-
て,こ れ ら気 道 や 中 耳 の 検 体 か ら 分 離 す る 場 合 は,
こ の こ と は,細
体 中4例
にC.
胞 で は 分 離 率 は 低 くHeLa-
229細 胞 を 用 い た 方 が 分 離 率 が 高 か っ た.し た が っ
こ れ ら2種
た.
C.
chomatisは,HL細
absoberを
プ レ ー ト の 上 下 に ゴ ム 処 理 し たshock 下 敷 き す る こ と で,ス
ラ イ ドチ ャ ン
バ ーの 破 損 は 防 ぐこ とが で きた . 分 離 さ れ たC. E,F,G型
trackomatisの
血 清 型 別 は,D,
が 多 く,血 清 疫 学 的 報 告 に 一 致 し て い
192
和 山 行正
た20).
染 症.
今 回 喀 痰 よ りC.pmeumoniaeを
分離 で きた こ
とは,飛 沫 或 は 経 口感 染 の 可 能 性 を示 唆 し,従 来 い わ れ て きたC.pneumoniaeの
ヒ ト・ヒ ト感 染 説
を証 明 で きた もの と考 え る. ま た,今
回用 い た 各 材 料 よ りク ラ ミジ アが 分 離
5)
され た こ とか ら,耳 鼻 咽 喉 科 領 域 に お げ る疾 患 関 連 の うえで よ り大 き な意 義 を もつ も の と考 え る. 今 回 の 研 究 か ら,気 道 や 中 耳 に はC.trachomatis
とC.pneumoniae両
方 の感染 が 同時 に起 こ
る 場 合 が あ る こ と が 初 め て 明 ら か と な り,こ
に 多 系 列 の 細 胞 培 養 を 行 い,モ
6)
れ ら
領 域 の 検 体 か ら ク ラ ミ ジ ア を 分 離 す る 場 合,同
時
ノ ク ロナ ー ル 蛍 光
7) 抗 体 染 色 法 を 施 す 必 要 性 が あ る.そ
の意 味 か ら も
多 穴 ス ラ イ ドチ ャ ン ノミー を 用 い る 方 法 は,こ
れ ら
の 多 種 類 の検 体 培 養 操 作 を 同時 に進 行 させ る こ と が で き,し
か も 操 作 は 比 較 的 簡 便 で あ る.ま
た,
8)
今 回 マ イ コ プ ラ ズ マ に よ る汚 染 は 認 め られ な か っ た が,こ
の こ とは 検 体 の 吸 引 除 去 及 び 培 養 日数 に
起 因 す る も の と 考 え ら れ る.よ
っ て,細
菌 に よる
9)
汚 染 を 除 去 す る た め に 用 い た メ ン ブ ラ ン フ ィル
こ れ ら の 方 法 は ク ラ ミジ ア 分 離 培 養 法 と し て よ り 10)
優 れ て い る も の と 考 え る. 謝 辞:本 研 究 の遂 行 な らび に本 論 文 作成 にあ た り終 始 御 田
材 料 を御 提 供 下 さ り,終 始 かわ らぬ御 指 導 を賜 りま した ワ シン トン大 学S.P.Wang博 衛 生研 究 所
士,C.C.Kuo博
士,国 立 予 防
萩 原 敏 且 博士,北 里 研究 所 病 院
小川 浩 司博
士 に深 く感 謝 い た し ます.
文 献 1) Grayston, J. T., Kuo, C.C., Wang, S. P. & Altman, J.: A new Chlamydia psittaci strain, TWAR, isolated in acute respiratory tract infections. New Engl. J. Med., 315: 161-168, 1986. 2) Ogawa, H., Fujisawa, T. & Kazuyama, Y.: Isolation of Chlamydia pneumoniae from the middle ear aspirates of otitis media with effusion: Case report. J. Infect. Dis., 162: 1000 1001, 1990. 3)
小 川 浩 司, 崎 嘉 司:
橋 口一 弘, Chlamydia
和 山 行 正, pneumoniaeに
増 田 は つ み,
山
よ る気 道 感
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小 川 浩 司, 口一 弘,
口文章 教 授 に 深甚 な る謝 意 を表 し ます.ま た,貴 重 な研 究
94:
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タ ー に よ る 前 処 置 は,ク ラ ミジ ア 増 殖 の 面 で よ く,
懇 篤 な る御 指 導御 鞭 燵 を 賜 りま した 北里 大 学 衛 生学 部
日 耳 鼻,
4) Grayston, J. T., Wang, S. P., Kuo, C.C. & Campbell, L.A.: Current knowledge on Chlamydia
田 中 寿 一,
山 崎 嘉 司:
る 慢 性 扁 桃 炎.
和 山 行 正,
Chlamydia
日 耳 鼻,
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川 井 田 政 弘,
橋
trachomatisに 333-340,
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感 染 症 誌,
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An Isolation Procedure of Chlamydia pneumoniae and Chlamydia trachomatis Yukumasa KAZUYAMA Researchand DevelopmentCenterof HygienicScience,KitasatoUniversity The author devised a method which permits simultaneous isolation and identification of Chlamydia using a slide chamber with 8 wells. Contaminating bacteria were eliminated by filtration with the menbrane filter. The procedure allowed isolation of Chlamydia pneumoniae and Chlamydia trachomatis from 11 (10.1%)out of 109 and 10 (9.2%)out of 109 otolaryngologic clinical specimens, respectively. The use of HL cells together with Hela-229 cells had been considered essential to isolate Chlamydia from specimens in this field. The conditions for isolating Chlamydia pneumoniae were similar to those for Chlamydia trachomatis. The slide chamber procedure with menbrane filtertreated specimens was suitable for simultaneous isolation and culture of various species of Chlamydia and allowed easy differentiation of Chlamydiapneumoniae from Chlamydia trachomatis with identification by the indirect fluorescent-antibody technique. Routine examination of clinical specimens using this procedure should be required in the future in order to better understand chlamydial infections.
平 成4年2月20日