Z. Lebensm. Unters.-Forseh. 159, 7--14 (1975) © by J. F. Bergmann, Miinchen 1975

Zur Massenspektroskopie der Aflatoxine K o l o m a n Bencze, 1%iedrich K i e r m e i e r u n d M a n f r e d Miller* Instimt ffir Milehwissenschaft und Lebensmittelveffahrenstechnik tier Technischen Universiti~t Mfinchen** (BleD) Eingegangen am 1. ~ebruar 1975 A b o u t M a s s - S p e c t r o s c o p y of Aflatoxines

Summary. The mass-speetroscopieal identification of aflatoxines in the eluant after thinlayer-chromatographical seperation represents a problem at amounts of less than 50 ng normally found in foods. Therefore it was necessary to investigate the factors influencing the identification. Among others, influences of plate material and the eluant were found. Based on the results with pure aflatoxines ideas were developped on their possible reactions. Zusammen/asaung. Bei einer Probemenge unter 50 ng, wie sie fiblieherweise in Lebensmit¢eln vorkommt, ist die massenspektrometrische Identifizierung yon Aflatoxinen im Eluat nach einer dfinnsehichtehromatographischen Auftrermung problematiseh. Es war daher efforderlich, die ~'aktoren, welche die Identifizierung beeinflussen, zu untersuchen. Hierbei konnte ein EinfluB u.a. des Plattenmaterials und des L6sungsmittels festgestellt werden. Auf Grtmd der erzielten Ergebnisse mit reinen Aflatoxinen konnten Vorstellungen fiber deren Fragmentierungsreaktionen entwickelt werden.

Einleitung Die massenspektrometrische Information hat schon bei der Strukturaufkl/irung der Ariatoxine eine wiehtige Rolle gespielt [1]. Massenspektren yon Aflatoxinen wurden sp~ter im Bereich yon Molekfilpeak (M+) bis zur Masse role 200 yon ttaddon u. Mitarb. [2] verSffentlieht, die damit die Bedeutung der Massenspektrometrie fiir die Analytik der Aflatoxine gezeig~ haben. Rao u. Anders [3] haben nach hochdruckfliissig-ctu'omatographischer Auftrennung die Massenspektrometrie zur Best~tigung herangezogen; ihre Massenspektren zeigen Standard und die aufgetrermten Aflatoxine B1 und G1 im Bereieh yon role 40 bis M+. Kiermeier u. Ruffer [4] haben bei Untersuchungen der hydrolytisehen Abbauprodukte yon Aflatoxin B1 ebenfalls die Massenspektrometrie eingesetzt. In den bisherigen Arbeiten [1---4] hat man ausreiehende Mengen yon Ailatoxin der massenspektrometrischen Untersuchung unterzogen, diese wird aber schwierig und zweifelhaft, wenn nur geringe Mengen yon Aflatoxinen in dubioser Reinheit vorhanden sind. Probleme der Aflatoxinanalytik Die A n a l y t i k d e r Aflatoxine b i e t e t aul~erordentlich viele Schwierigkeiten [5, 6], w e n n sie in einem k o m p l i z i e r t e n Milieu, wie es das Lebens- u n d F u t t e r m i t t e l darstellt, erfal]t w e r d e n mfissen. ~Fiir die TJntersuchung miissen die Aflatoxine aus d e r h o m o g e n i s i e r t e n P r o b e z u e r s t e x t r a h i e r t , d u r c h S/~ulenchromatographie v o r g e t r e n n t u n d n a c h E i n e n g u n g d e r E l u a t e d f i n n s c h i c h t c h r o m a t o g r a p h i s c h isoliert werden. D e r q u a n t i t a t i v e X a c h w e i s w i r d e n t w e d e r n a c h weiterer E ] u t i o n der F l e c k e n oder besser in situ f l u o r o d e n s i t o m e t r i s c h durchgefiihrt. I t c u t e stehen dafiir schon jahrelang bew/ihrte E x t r a k t i o n s v e r f a h r e n u n d A u f t r e n n u n g s m e t h o d e n zur Verffigung. Die D C - A u f t r e n n u n g u n d d e r nachfolgende fluorimetrische N a c h w e i s sind n i c h t so spezifisch, dal3 dies, i n s b e s o n d e r e w e n n ~ e t a b o l i s i e r u n g e i n g e t r e t e n ist, als Beweis ffir die I d e n t i f i z i e r u n g g e l t e n k a n n . E i n e g a s c h r o m a t o g r a p h i s c h e M e t h o d e i s t ffir A f l a t o x i n e noch n i c h t b e k a n n t , w o r a n n i c h t n u r deren niedriger D a m p f d r u c k schuldig sein sol]. Zwei E i g e n s c h a f t e n der A f l a t o x i n e m a c h e n die A u s a r b e i t u n g einer g a s c h r o m a t o g r a p h i s c h e n M e t h o d e sehwierig: 1. katalytischer Zerfall an Schwermetall-Oberfl~ehen, 2. fast irreversible Adsorption an Glasoberfl~chen. * Heri~a Dr. W. Riepe, Institut ffir Spektrochemie, Dortmund, danken wir ffir saehdienliche Stellungsnahmen. ** Der ]:)eutschen Forschungsgemeinschaft m5chten wir fiir die ][J]3erlassung des Massenspektrometers herzlich danken.

D~rum is~ zur Zeit eine direkte GC/MS-Untersuchung der Aflatoxine noch nicht m6glieh. Welm auch eine hochdruckflfissigkeitschromatographische Auftrennung bereits ausgearbeitet ist [3], so ist diese ihrer geringen Empfindlichkeit wegen nur begrenzt verwendbar. Ftir die Identifizierung geringer Aflatoxinmengen bleibt daher die ])C/MS der zur Zeit einzig brauchbare Weg. Ffir den qualitativen Naehweis fiber die Massenspektrometrie mul~ die Probe ebenfalls eluiert und eingeengt werden. Diese Arbeitssehritte bedeuten jedoch ffir die weiteren Untersuehungen eine Kontaminierungsgefahr, die mit der abnehmenden Menge yon Aflatoxinen steigt. Vorbereitung der Proben zur Massenspektrometrie

Die Vorbereitung der Proben ffir eine MS-Untersuchung besteht aus 3 Schritten: 1. Eluierung aus der Dfinnschicht; 2. Einengen; 3. Verdampfen der letzten LSsungsmittelreste und Verunreinigungen aus der Probe in der Sehubstange. Jeder Arbeitsgang kann die Ergebnisse deutlieh beeinflussen.

Eluierung Bei der Ehfierung sell das LSsungsmittel gegenfiber dem Dfinnschichtmaterial inert bleiben, well sonst sehwerflfichtige Umwandlungsprodukte die Aflatoxine kontaminieren (vgl. Abb. 1, Spalten 1 u. 2). Die Arbeiten yon Seebalcl u. Schunak [7] haben gezeigt, dal~ durch eine Behandlung der LSsungsmittel mit Al~O3 diese katalytisch ver/indert werden k5nnen, so dab dureh die S~ulenchromatographie die LSslmgsmittel nicht gereinigt, sondern ver£ndert werden k6nnen, ldnsere Beobachtungen haben dies best~tigt, vgl. Abb. 1, Spalten 1, 3 u. 5. Die Dtinnsehichtehromatogramme zeigen Verbindungen, welche auf der Chromatographies/iule aus Methanol und Chloroform entstanden sind. Start Reinigung entsteht also eine Versehmutzung der LSsungsmittel. A120 ~ kann man nur dann zur L6sungsmittelreinigung verwenden, wenn die Aktivierungsgrade gen/igend niedrig sind (Abb. 1, Spalte 6). Als Reinigungsverfahren bietet sieh die S~ulenchromatographie mit A1203 mit einem Wassergehalt yon mindestens 5% und nachfolgender fraktionierter Destillation an. Eine weitere Kontaminierungsgefahr ist die Diinnschichtplatte selbst, dureh deren eventuellen Gehalt an 15sliehen Stoffen, die zusammen mit der fraglichen Substanz eluiert werden und sich im Massenspektrum bemerkbar machen. Darum ist es empfehlenswert, die Platte zuerst ohne die TJntersuchungsprobe mit dem Laufmittel zu behandeln. In £hnlicher Weise stSren die bei der Verwendung yon A120~ als Sehiehtmaterial entstehenden Umwandlungsprodukte der Fliel~mittel, die mit einer weiteren dfilmschichtehromatographischen Auftrennung der Eluate nachgewiesen werden konnten (vgl. Abb. 2). Fiir die DC/MS-Untersuehung sollte man daher die Verwendung yon Al~O3Sehiehten vermeiden. Eine besondere Schwierigkeit stellen die Bindemittel der Pl~tten dar, die zum Teil mitextrahiert werden kSnnen, insbesondere wenn grSl~ere Mengen an LSsungsmittel verwendet werden miissen. Sind die Aflatoxine nur in sehr geringen Mengen vorhanden, kann dadurch die massenspektrometrisehe Untersuehung unmSglieh werden, da der verh/iltnism/il3ig grol~e Anteil an 15slichen Bindemittet-Bestandteflen die Auswertung des Massenspektrums der Substanz unmSglich maeht, insbesondere die meist im Abstand yon MZ 14 periodisch auftretenden Peakgruppen.

Einengen I)er ~otationsverdampfer bedeutet beim Einengen die gr5Bte Verschmutzungsgefahr. Zwischen zwei Proben mull der Verdampfer jeweils gereinigt werden. I)er verwendete Kolben sell ein Spitzkolben mit verl~nger~r Spitze sein, wodurch eine verlustlose ~ber~ragung des I)es~illationsrestes in die Schubstange des Massenspektrometers mSglich ist. Die L6sung daft im Kolben nicht geschiittelt werden, well die Glaswand einen Teil der Aflatoxine adsorbiert.

Verdamp/ungsproze[3 T r o t z o p t i m a ] e r A r b e i t s b e d i n g u n g e n k S n n e n die A f l a t o x i n e nich~ vSllig rein isolier~ werden. Bei der V e r d a m p f u n g der P r o b e l i B t sieh a b e t eine g u t e T r e n n u n g erreichen, w e n n m i t kleinen T e m p e r a t u r g r a d i e n t e n g e a r b e i t e t u n d der T e m p e r a t u r -

OG

C~G CDB

~B ~G

oo

~s

~)B C)s

~:~B

C:DG

~w

s

~)GB

(~hG

oBG

OB I

2

3 Abb. 1

h

5

5

I

2

3

/,

Abb. 2

Abb. 1. DC-Auftrelmung yon L6sungsmittelriiekst~nden naeh der Reinigung der L6sungsmittel. Platte: Silieagel-Folie. Laufmittel: Chloroform/Trichlorgthylen/Amylalkohol/Ameisens~ure (80+15+4+1). Dedektion mit UV-Licht. Fluorescenzfarben: B = blau; b = braun-oeker; d = dunkel; G = griin; g = gelb; h = hell; 0 = orange; W = w e i l L - - 1 = Methanol, Riiekstand aus 50 ml. 2 = Methanol, Riiekstand aus 50 ml naeh zweiter Destillation. 3 ~ Methanol, Riiekstand aus 50 ml nach siiulenchromatographischer Reinigung (A1203-Si~ulemit 0,5% Wassergehalt, FfillhShe 80 cm, Durehmesser 25 mm). 4 = Methanol, Riickstand aus 50 ml naeh zweimaliger sgulenehromato~aphischer Reinigung (Angaben wie bei 3). 5 = Chloroform, Riickstand aus 50 ml nach sgulenchromatographiseher Reinigung (Angaben wie bei 3). 6 = Chloroform/ Methanol (7+3), Rfiekstand aus 50 ml nach s£ulenchromatographiseher Reinigung (A120~ mit 5% Wassergehalt, sonst wie bei 3) Abb. 2. DC-Auftrennung der LSsuugsmittelriicksti~nde aus 50 ml 3{ethanol nach Eluierung einer DC-Oberfl£che yon ca. 2 cm ~ nach Laufmittelbehandlung Laufmittel und Dedektion wie bei Abb. 1 . - St6rsubstanzen im Unter~und einer DC-Platte: I = auf Silieagel-Folie im R~Bereich yon Aflatoxin B~, ohne Aflatoxin B~. 2 = auf Silieagel-Folie im RrBereich yon Ariatoxin G1, ohne Aflatoxin G~. 3 = auf Al~O3-Folie im RrBereieh yon Aflatoxin Bi, ohne Ariatoxin B~. ~ = auf A1203-Folie, DO-Eluatriickstand mit Aflatoxin B~ (sehattiert)

a ns t i eg n a e h der Stiirke des I o n e n s t r o m s geregel~ wird. D e r V e r d a m p f u n g s p r o z e $ der E l u a t e k a n n i m Mlgemeinen in ffinf P h a s e n eingeteilt w e r d e n u n d zwar verdampfen 1. flfiehtige Reste aus Elutions- oder Laufmittel ohne Temperaturerh6hung der Sehubstange; 2. schwerflfichtige Riickst~nde aus dem LSsungsmittel, aus der Platte und auch eventuell leichtflfichtige Reaktionsprodukte der Aflatoxine bei 70--90 ° C; 3. schwererflfichtige Reaktionsprodukte der Aflatoxine bei 90--120 ° C; 4. Bindemittel und andere Stoffe aus dem Dfinnschichtmaterial bei 110--150 ° C; 5. Aflatoxine ab ca. 150° C. Zwischen P h a s e 4 u n d 5 gibt es keine scharfe Grenze. D a m i t kSnnen gr6Bere ~{engen DC-Elua~ geringe A f l a t o x i n m e n g e n i m M a s s e n s p e k t r u m maskieren.

10 Fragmentierungsreaktionen yon Aflatoxin B~ Metlbedingungen

Zur massenspektrometrischen Untersuchung: VARIAN MAT CH-7. - - Probeneingabe immer mi~ der Schubstange; Fragmentierung bei einer ][onenquellentemperatur yon 150°C u n d - wenn nicht anders angegeben - - bei 70 eV und 300 FA Kathodenstrom. 312

100"

80

60 22B

c-

69

228

256

~ 4o

2Bt,

~: 2o

I

.... i ....

4O

....

iIjtEtLit t1t r,

..i....i.,

.. ,..

,. I....i

....

80

I ....

....

i,...i...-i....

s I

I

I .

150

120

,.i....l....i....i....i...

i....i....i...

200

240

.... r - ' r L - i - - - J - - - ,

280 m ~

320

Abb. 3. Massenspektrum yon Aflatoxin B~ (70 eV, 300 FA,) 0

0

O

-CO

~,

M+:312

A~:284

l

-CO 0

A2:256

A3:228

I

-CHz=C=O

CH3 -co

"-

[MZ 157] As: 157

A~:185

As; 156

Abb. 4. Fragmentierungsweg yon Aflatoxin B~ mit prim~rer Carbonyl~bspaltung. Vor der Massenzahl: Symbol der Verbindung (vgl. Tab. 1)

11

Massenspektrum Das Massenspektrum (Abb. 3) weist bei allen Aflatoxinen einen sehr intensiven Molekfilpeak auf, ein Ausdruek ffir die thermisehe Stabilit/it, die wit bei frfiheren Versuehen gefunden haben [8]. Sehr hohe Intensit/~t haben die sauerstoffhaltigen Endprodukte des Abbaues H20 (MZ 18), CO (MZ 28), O~ (MZ 32) und das Cyelopropanion C3H3+ (MZ 39). H/~ufiges Vorkommen yon Methylengruppen bei der Fragmentierung 1/iBt sieh aus der hohen Intensit/~t bei MZ 14 vermuten. Der intensive Peak (MZ 28) zeigt bei hoher AuflSsung einen deutlichen Antefl (fiber 15%) an C2H4 (MZ 28). Tabelle 1. Fragmentierungswege yon Aflatoxin B~ und die dabei auftretenden Massenzahlen. (Vor der Massenzahl: Symbol des Fragmentions; in Klammern: tel. Peakintensitiit bei 70 eV, 300 ~A) Fragmen$ierungswege A -

-

B

Carbonyl

C

-- Keten

A1

$ 284 (34)

A~

256 (40)

B.2

269 (27)

A,

228 (45) 4 --CH2 =C=O 185 (23) v~ --CO 157 (11) --I:I 156 (9)

Ba

241 (30) vt - - C 0 213 (33) 4 --CO 185 (23)

A5 A6

-- Aldehyd

¢ :B1 270 (5)

-oo

A~

D

1

D~

-.

B~ B~

$ 283 (29) -oo

C~ C.~ C3 C4

257 (7)

D.~ 255 (27)

~, --CH 214 (10) vT--CO 186 (9) vr q-H--CO: 143 (11)

D~ D4 D5 D6

227 (44) 4 --CO 199 (14) v~ --CH~=C=O 157 (11) ,~ --CH~----C=O t15 (32)

Die Fragmentierung kann versehiedene Riehtungen nehmen (Tab. 1). Ein Fragmentierungsweg (jeweils mit dem Symbol A bezeiehnet) kann naeh unserer Vorstellung mit dem Verlust einer Carbonylgruppe beginnen. Ein weiterer Weg k6nnte dureh Abspaltung yon Keten (jeweils mit dem Symbol ]3 bezeiehnet) eingeleitet werden, der m6glieherweise vom Fragmention (MZ 270) dureh CH-Verlust einen Fragmentierungsweg C er6ffnet. Die Abspaltung einer CHO-Gruppe aus Aflatoxin ]31 ffihrt zum Fragmentierungsweg D, der durch Bruehstficke mit verh/iltnism/~l~ig hohen Intensit~ten gekennzeiehnet ist. D i e primate Carbonyl-Abspaltung ist typiseh ffir Cumarinderivate [9]. Die Produkte dieser Fragmentierungsreihe (Weg A, Abb. 4) sind stark im Massenspektrum yon Aflatoxin ]3~ vertreten. Bei 70 eV ist naeh wiederholter CO-Abspaltung das Laetonring-System abgebaut (Abb. 4: A3). Naeh einem Keten- und anschliel~endem Verlust yon CO und H entsteht i~hnlieh vie bei ]3enzofurfurol [10] ein Dehydrotropylium-Derivat (MZ 156).

Die Fragmentierung yon Aflatoxin B1 ist aueh mit einem prim~ren Abbau des Furanringes mSglich (Weg B/Abb. 5). l ~ e h Abspaltung yon CO und H bildet sieh ein Dehydrotropylium-Derivat (B 3). Die VerbJndung B 4 mit MZ 213, welehe naeh Carbonylverlust aus B3 gebildet wird, hat ein Elektronensystem, das die Entstehung doppelt geladener Ionen begfinstigt (Abb. 6). I)as Fragmention MZ 106,5,

12

das aus dem Fragmention MZ 213 (B 4) entsteh~, hat unter den doppelt geladenen Ionen die hSchste Intensit~t und ist typisch fiir Aflatoxin B r Das Tropyliumion MZ 91 kommt auch in verschiedenen Stufen der Dehydrierung mit N[Z 87 und 89 vor. O

O

O

O

-,C,H::C=O -,.O.,~ ~.O~ ~.,.,,-

-OCH3

M÷: 312

Bt' 270

[MZ 2691 B=: 269

o

l

-c0

o

Bs: 2/,1 0

< -CO

Hz

B,~: 185

B4:213

Abb. 5. Fragmen~ierungsweg yon Afla~oxin B 1 mit prim~rer Ketenabspaltung. Vor der Massenzahl: Symbol der Yerbindung (vgl. Tab. l)

100" % 8£

iK Ill

•

20

40

60

80

Ill I I

100

,I, ,ll 120

li

I I I, m/e

160

Abb. 6. Doppel~ geladene Ionen aus Aflatoxin B1-Bruehstiicken mit ungerader M_Z. I~IZ 106,5 = ]00% Intensit~t

13 O

O

O

O

-CH2=C=O M"; 312

BI: 2'70

I

-CH

[MZ:2571 C~ : 257

I

-OCH

"~H~-CH O

O

C2: 21/,

0

o

C4:143

I

-CO

0

C3:185

Abb. 7. :Fragmentierungsweg yon Aflatoxin BI, ausgehend yon :Fragment ]VIZ 270 nach CItVerlust. Vor der Massenzahh Symbol der Verbindung (vgl. Tab. 1)

o

0

o

-CliO D

M~'= 312

D~: 283

l-CO

4-

Dz : 255

[

-CH2=CH ~

~0" "0" g

-OCH~

+4

D~ :113,5

~, J D~,: 199

CO D3:227

Abb. 8. Fragmentierungsweg yon Aflatoxin B 1 mit lorim£rer CHO-Abspaltung. Vor der i~Iassen. zahl: Symbol der Verbindung (vgl. Tab. 1)

14 Die dureh CH-Abspaltung aus Fragment B 1 (MZ 270) entstandenen Fragmente (Fragmentierungsweg C/Abb. 7) sind labil. Hierbei ist eine ehinoide Ringbildung zu beobachten (Fragment C2). Daran sehlieltt sich die Abspaltung yon CO ~n. Die Besehreibung/ihnlicher CO-Abspaltung finder man 5fters in der Literatur [11, 12]. Ein Di-cyclopentadienon hat dank seines langen eonjugierten Doppelbindungssystems die grSgte Stabilit/~t in dieser Abbaureihe (Ca). Die nach tICO-Abspaltung entstandenen Produkte des Fragmentierungsweges D sind besti~ndig (Abb. 8). Das eonjugierte Elektronensystem stabilisiert die Fragmente, die zur Bfldung doppelgeladener Ionen neigen; Bruchstiiek D~++ mit MZ 57,5 hat die zweitgrSgte Intensit/it der doppeltgeladenen Ionen. Ffir diesen Fragmentierungsweg D ist De mit MZ 115 typisch (vgl. Tab. 1).

Fragmentierungsrealctionen anderer A flatoxine I n den Massenspektren aller Aflatoxine sind Fragmentionen mit den (M-X). Werten 29, 57 und 71 zu finden, die auf gemeinsame Strukturelemente zuriiekzuf/ihren sind. Daneben gibt es Massenzahlen, welche fiir die einzelnen Aflatoxine typiseh sind, z. B. f/ir Aflatoxin B 1 MZ 256, 269, 284 (vgl. Tab. 2), fib° Aflatoxin 5i 1 MZ 247, 299, 310. Tabelle 2. Intensive Fragmen~ionendes Aflatoxin B1 bei 70 eV, 300 ~A MZ

185 199 213 227 228 229 241 242 255 256 257 269 284 312 313

I(%B)

20

21

33

56

54

11

26

8

35

33

8

21

32

100 26

Literatur

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

Goldblatt, L.A.: Aflatoxin. New York, London: Academic Press 1969 Haddon, W.F., ~abry, W., WMss,A.C.: Anal. Chem. 43, 268 (1971) Rao, tt.H.R., Anders, M.W.: J. Chromatog. 84, 402 (1973) Kiermeier, F., Ruffer, L. : Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 155, 129 (1974) Kiermeier, F.: Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 148, 331 (1972) Engstrom, G.W.: J. Chromatog. 44, 128 (1969) Seebald, tI.J., Schunack, W.: Arch. Pharm. ]05, 406 (1972); 307, 161 (1974) Bencze, K.: UnverSffentliehte Versuche Barnes, C.S., Occolowitz,J. L. : Australian J. Chem. 17, 975 (1964) ]~eak,P., Kinstle, T.H., Carls, G.A.: J. Am. Chem. Soc. 86, 3833 (1964) Pelah, Z., Wilson, J.M., Ohashi, M., Buolzikiewicz, tI., Djerassi, C.: Tetrahedron 19, 2233 (1963) 12. Nakata, tt., Kirat~,Y., Tatematsu, A.: Tetrahedron Letters 196~, 123 13. Sid 1V[asri,M., ttaddon, W.F., Lundin, l~.E., tlsich, D.P.H.: J. Agr. Food Chem. 22, 512 (1974) Professor Dr. F. Kiermeier Institut fiir Milehwissenschaft der Technisehen Universiti~t 5Iiinchen ]:)-8050 Freising-Weihenstephan Bundesrepublik Deutschland