Planta (Berl.) 113, 157--171 (1973) 9 by Springer-Verlag 1973

Ehl in vitro Proteinsynthesesystem aus Maiskeimlingen* Woong-Seop Sim** u n d Dieter K1/~mbt Botanisches Institut der Universit~t Bonn, Meckenheimer Allee 170, D-5300 Bonn, Federal Republic of Germany Eingegangen am 13. April / 17. ~ai 1973 A Cell-Free System of P r o t e i n Synthesis from Maize Seedlings Summary. An amino acid incorporating system has been prepared from maize seedlings, and it has been characterized with the aid of poly-U and a "mRNA enriched fraction" from the same plant material. The rate of protein synthesis decreases proportionally with the incubation period. It seems to be related to the degradation of polysomes. The optimal Mg2+ concentration is 20 mM for the poly-U dependent protein synthesis and 10 mM for the synthesis with endogenous polysomes. The poly-U directed polyphcnylalanine synthesis is increased 12-fold by addition of exogenous sieNA. Under optimal conditions poly-U causes a 40-fold increase of the phenylalanine incorporation. A ~ mRNA enriched fraction" was prepared from maize seedlings using proteinase K for deproteination of polysomes. The resulting RNA was further fractionated by successive precipitation with LiC1, NaC1 and ethanol and characterized by polyacrylamide gel electrophoresis. The addition of 57 ~zg of the mRNA-enriched sample increases the incorporation of amino acid into polypeptides by a factor of approximately 2 at a Mg2+ concentration of 5 raM, and by a factor of 1.5 at 15 mM Mg2+. The addition of 72 ~zg rRNA does not stimulate the incorporation at low Mg2+ concentration, while at 15 mM Mg2+ a 1.3-fold increase is observed.

Einleitung Auf der Suche n a c h R e g u l a t i o n s o r t e n pflanzlicher Wuchsstoffe sind i m m e r wieder I n d i z i e n gefunden worden, die einen h o r m o n a l e n EinfluB dieser Stoffe auf die T r a n s k r i p t i o n u n d / o d e r T r a n s l a t i o n wahrscheinlieh machen. E i n e Analyse der z u g r u n d e liegenden W i r k u n g s m e e h a n i s m e n im in vivo System ist m i t gro$en methodischen Schwierigkeiten v e r b u n d e n , da wegen der i n e i n a n d e r g r e i f e n d e n Regelkreise ein Prim~rregulationsimpuls zu schwach ausgepr/~gt ist. Die Arbeit m i t funktionsfi~higen in vitro S y s t e m e n der T r a n s k r i p t i o n u n d T r a n s l a t i o n bietet in diesem Fall wesentliche Vorteile gegenfiber dem E x p e r i m e n t i e r e n m i t dem k o m p l e x e n l e b e n d e n Objekt. Diese in vitro Systeme sollten aus wuehsstoffabh/s * Tell einer Dissertation (W. S. Sire), Bonn 1973. ** Stipendiat des Deutschen Akademischen Austauschdienstes.

158

W.-S. Sim und D. Kl~mbt

wachsenden Geweben pr~pariert werden. I n der vorliegenden Arbeit ist ein P r o t e i n s y n t h e s e s y s t e m aus Mais beschrieben, das zur in vitro Prfil u n g y o n Wuchsstoffwirkungen auf die T r a n s l a t i o n dienen soll. F o r t s e h r i t t e auf dem Gebiet der P r o t e i n s y n t h e s e sind vor allem durch A r b e i t e n a n in vitro S y s t e m e n aus B a k t e r i e n u n d S~ugetieren erzielt worden. Systeme aus hSheren Pflanzen h a b e n d a r a n n u t sehr geringen Anteil. Grfinde daffir sind im sehwierigeren ZellaufsehluI3 u n d im hohen R N a s e - G e h a l t zu suchen. D e n n o c h h a b e n Stephenson et al. bereits 1956 ein in vitro System aus T a b a k pr~pariert. Naeh 1961 wurde i m m e r wieder versucht, hochaktive pflanzliche in vitro Systeme zu entwickeln (Mans u n d Novelli, 1961 ; B o a r d m a n et al., 1966 ; H a d z i y e v u n d Zalik, 1970). Sie erreiehten jedoch in keinem Fall die S y n t h e s e a k t i v i t ~ t bakterieller bzw. tierischer Systeme. Die vorliegende Arbeit berichtet fiber die Pri~paration u n d Charakterisierung eines funktionsfahigen poly-U-abh~ngigen in vitro Systems aus Maiskeimlingen; sowie fiber die Isolierung einer m R N A - r e i c h e n Fraktion aus Maiskeimlingen u n d den Einflul~ dieser F r a k t i o n auf die in vitro Proteinsynthese.

Material und Methoden 1. P/lanzenmaterial. Ffir die Preparation der S-30 und S-100 Fraktion und der Ribosomen-Polysomenwurde Zea mays var. Perdux 1 verwendet. Da dieser Hybridmais unter mehreren Hybridmais-Sorten die beste Eignung zur Preparation eines in vitro Proteinsynthesesystems besaB, aber nur in begrenzter Menge zur Ver~figung stand, wurde er ausschliel~lich diesen Pr~parationen vorbehalten, rRNA, sRNA und vor allem mR~A wurden aus Zea mays var. CalderaFAO-220 pr~pariert. Die Karyopsen wurden 24 h in Wasser vorgequollen und anschliei~end im Dunkeln 45 h bei 27~ inkubiert. Nach dieser Zeit waren die Sprosse 5--10 mm gewachsen. Sie wurden geerntet und in Puffer yon 0~ sofort heruntergekiihlt. 2. S-30 Uberstand. Zur Pri~paration des S-30 Uberstandes wurden jeweils 10 g Sprosse der Maissorte Perdux verwendet. Nach zweimaligem Waschen bei 3~ in Puffer I (Puffer I: 100 mM Tris-HC1, pH 7,8, 50 mK KC1, 5 mM MgC12, 5 mM fi-Mercapto~thanol, 450m)~ Saccharose; modifiziert nach Mans und Novelli, 1964) wurden sie zwischen Papiertfichern getrocknet und in 2,5 Volumenteilen Puffer I 15 s im Bfihler-Homogenisator homogenisiert. Die Homogenisation und alle weiteren Aufarbeitungen effolgten bei 3~ Nach Filtration dutch 4 Schichten Mull wurde das Filtrat 5 rain bei 1000 • g zentrifugiert, 4/5 des ~berstandes vorsichtig abgehebert und zur Entfernung der Mitochondrien 30 rain bei 30000 • g erneut zentri~ugiert, a/4 des resultierenden ~berstandes ergab die S-30 Fraktion. Bei Bedaff wurde der S-30 ~berstand 40 rain bei 35~ vorinkubiert. Die l~eaktionsmischung ffir derartige Vorinkubationen enthielt: 8 ml S-30, 18 ~zMolATP, 37,5 ~Mol PEP (Phosphoenolpyruvat), 300 ~g PK (Pyruvatkinase), 45 ~Mol KC1 und 4,43 9Mol MgC12 in insgesamt 9 ml. Nach Boardman et al. (1966) und Mans und Novelli (1964) wurden die vorinkubierten und nichtvorinkubierten S-30 Uberst~tnde zur Entfernung der 12C-Aminos~turen3 h gegen 100 Volumenteile Puffer II

1 Fiir die ~berlassung des Materlals danken wir Herrn Dr. Aufhammer, Institut fiir Pflanzenbau, Universit~t Bonn.

Ein in vitro Proteinsynthesesystem

159

(Puffer I I : 100 mM Tris-HCl, pH 7,8, 5 0 r a m /~-Mercapto~ithanot, 5 mM MgCI2, 250 mM Saceharose) dialysiert und bis zur Verwendung bei --20~ aufbewahrt. 3. S-100 Uberstand. Zur Preparation des S-100 Uberstandes wurde die S-30 Fraktion 2 h bei 105000 • g zentrifugiert und z/z des ~berstandes zur Entfernung des Lipidh~iutchens durch 4fachen Mull filtriert. Das Filtrat des 105000 • g Uberst~udes wurde ganz entspreehend der Behandlung von S-30 3 h gegen Puffer I I dialysiert und bis zum Gebrauch bei --20~ aufbewahrt. Dieser dialysierte ~berstund wird als S-100 bezeichnet. 4. Priiparation der Ribosomen-Polysomen. Zur mSglichst vollstandigen Abtrennung der Ribosomen-Polysomen wurde S-30 mit 20%igem Triton X-100 bis zu einer Endkonzentration yon 1% versetzt, auf 7 ml 1 M Saceharose in Puffer I I I (Puffer I I I : 100 mM Tris-HCl, pH 7,8, 50 mM MgC12, 5 mM fi-Mercapto~thanol) pipettiert und 3 h bei 105000 • g zentrifugiert. Unter diesen Bedingungen erh~ilt man saubere Polysomen-Ribosomen-Sedimente. Der resultierende i)berstand wurde verworfen und das Sediment zweimal m i t Puffer I oberfl~ichlich gewasehen. Naeh Drainieren der Restflfissigkeit und Trocknen mit Kleenex wurde das Sediment angerieben und schlie$1ich in Puffer I suspendiert. 5. Priiparation yon sieNA, rRNA und mP~NA. Zur Preparation der l~NA-Fraktionen wurde der S-30 Uberstand aus 100 150 g Mais-Sprossen pr~pariert. Dieser Uberstand wurde in 22 ml Portionen auf 5 ml 2 M Saccharose in Puffer I I I geschichtet und 3 h bei 105000 • g zentrifugiert. Die Ribosomen-PolysomenSedimente wurden zur Praparation yon rl~NA und mRNA, die resultierenden ~Jberstgnde zur Praparation von sl~IqA verwendet. sl~NA. Zur Abtrelmung der sl~NA diente das Verfahren von Brunngraber (1962) in einer modifizierten Form. Die sRNA wurde start durch Frontelution mit 1 M NaC] dureh Gradientelution 0,4--0,75 M NaC1 yon der DEAE-Cellulose Saule gewonnen. rRNA und mt~NA. Die Isolierung dieser RNA-Fraktionen aus den oben beschriebenen Ribosomen-Polysomen-Sedimenten erfolgte nach Wiegers und Hilz (1972) und Layeoek und Hunt (1969). Als Ausgangsmaterial dienten Polysomen, die aus Mais-Sprossen mit Puffer IV (Puffer IV: 100 mM Tris-HCl, pH 7,8, 50 mM KC1, 5 mM MgC12, 0,1 mM Cycloheximid, 450 mM Saccharose; modifiziert nach Wiegers und Hilz, 1972) isoliert wurden. Die Polysomen wurden in Puffer V (Puffer V: 0,1 M Saceharose in Puffer II) suspendiert (1,0 mg/ml) 2, 5 min bei 1000 • g zentrifugiert und in 0,05% Proteinase K 60 rain bei 25~ enteiweiBt. AnschlieBend wurde ein Volumenteil 3 M LiC1 zugesetzt. Nach 8 h Altern der Li-RNA-F~llung bei 0~ wurde 30 rain bei 1000 • g zentrifugiert. Zur vol]stiindigen Entfernung yon Proteinase K wurde das Sediment im gleiehen Puffer gel5st und die RNA erneut mit Li+ gef~llt. Der Li-RNA-Niedersehlag ~ r d e schlieBlieh in 0,1 M NaC1 gelSst, auf sins Endkonzentration yon 3 mg/ml 2 eingestellt und daraus die rl~NA durch Zugabe yon festem NaCI (Endkonzentration 18% NaC1) als :Natrium-Salz gef~llt. Geringe Mengen der rRI~A und vor allem die m R N A verblieben in LSsung. Diese Rest-RigA wurde mit zwei Volumenteiten ~-thanol gefallt und nach Altern bei --20~ durch Zentrifugation abgetrennt. Die Sedimente der rRNA- und Restt~NA-Fiillung wurden in Puffer V gelSst, jeweils gegen das 3000fache Volumen Aqua dest. 5 h bei 3~ dialysiert und ansehlieSend gefriergetrocknet. Die RestRigA-Probe wurde als mRI~A-Pr~parat bezeichnet, mRNA- und rRNA-Praparate wurden zur Gel-Elektrophorese und zur in vitro Proteinsynthese verwendet. Aus 150 g Mais-Sprossen konnten 26,8 mg 2 des rRNA- und 0,18 mg 2 des mR~NA-Praparates isoliert werden. Die Extinktionsquotienten 260/280 n m d e r verschiedenen RNA-Praparate betrugen 1,96--2,05. 2 20 Extinktionseinheiten/2~0 nm entspreehen 1 mg Polysomen bzw. 1 mg I~NA.

160

W.-S. Sim und D. Kl~imbt

6. Der in vitro Proteinsynthese-Test. Das Analyse-Verfahren basiert auf den Erfahrungen yon Spencer undWildman (1964), Boardman etal. (1966) und Hadziyev und Zalik (1970). Die vollst~ndige Reaktionsmischung fiir das zellfreie Proteinsynthese-System hatte pro 0,6 ml Reaktionsmischung folgende Zusammensetzung: 0,1 M Tris-HCI Puffer, pH 7,8, 30 ~zMol KC1, 3 tzMol fl-Mercapto~thanol, 0,6 ~Mol ATP, 0,3 ~zMol GTP, 0,01 ~Mol CTP, 0,01 tzMol UTP, 1,25 ~Mol PEP, 10 ~zgPK und je 0,0125 tzMol der ProteimAminos~uren, die nicht ltC-markiert im Test verwendet wurden. Die zur Reaktionsmischung zugesetzten Mengen an S-30 bzw. Ribosomen und S-100 Uberstand variierten yon Versuch zu Versuch. Die Proteinsynthese wurde durch Zusatz yon [ltC]Aminos~uren (0,35 ~zCi [ltCiJPhenylalanin, CFB 70, Amersham, 477 mCi/mMol oder 1 tzCi ltC-Aminos~uremischung, CFB 104, Amersham, 52 mCi/mAtom) und Erwi~rmung der Reaktionsmischung gestartet. Fiir jede Probe wurde eine Kontrolle in der entsprechenden Weise hergestellt mit der Ab~nderung, daft die [14C]Aminos~uren am Ende der Inkubation zur Reaktionsmischung hinzugegeben wurden. Die Inkubation der Reaktionsmischungen betrug 60 rain bei 35~ um maximalen Einbau zu erh~lten. Die Reaktion wurde dutch Abkiihlung im Eisbad gestoppt. Naeh Zugabe yon 0,6 ml 0,1 M [12C]Aminos~uren der im Test verwendeten [ltC]Aminos~uren und yon 0,1 ml Rinder-Serum-Albumin (0,5 mg/ 0,1 ml Aqua dest.) als Fi~llungshilfe wurden RNA und Proteine mit 10%iger TCA (Endkonzentration 5%) gef~llt. Nach 15 rain Altern bei 0~ wurden die Niederschl~ge 10 rain bei 10000 • g zentrifugiert, in 5 ml einer LSsung yon 5% TCA und 0,05% [12C]Phenylalanin suspendiert und zur Hydrolyse der Aminoacyl-tRNAs 15 min auf 90~ erhitzt. Nach Abkfihlung auf 0~ wurden die F~llungen erneut abzentrifugiert, in 5 ml 5% TCA ~- 0,05% [12C]Aminos~uren suspendiert, auf Membranfiltern SM 11106 (0,45 tzm Porenweite) gesammelt und viermal mit 5 ml 5% TCA ~- 0,05% [12C]Aminos~uren gewaschen. :Die Filter wurden unter einer Inffarot-Lampe getrocknet und ihre Radioaktivit~t in jeweils 20 ml Scintillatortoluol + 0,4% 2,5-Diphenyloxasol im Packard-Liquid Scintillation Spectrometer gemessen. 7. Saccharosegradientenzentri/ugation zur Charal~terisierung der Polysomen. Zur Charakterisierung der Polysomen diente die Sedimentations~nalyse im isokinetischen Saccharosegradienten (Noll, 1967; McCarty et al., 1968). Die zu analysierenden Proben wurden in 1,5 ml Puffer I I I suspendiert und auf 25 ml SaccharoseGradienten pipettiert. Nach 3stiindiger Zentrifugation im SW 25 Rotor einer Spinco L 50 bei 24000 Upm wurden die Gradienten am LKB-UV-Monitor bei 254 nm in einer 3 mm DurchfluBkiivette gemessen und automatisch registriert. 8. Gelelelctrophorese zur Charalcterisierung der rRNA, sRNA und mRNA. Aliquote Teile der rRNA-, sRiNA- und mRNA-Pr~parate wurden an Polyacrylamid-Gelen nach Peacock und Dingman (1968) aufgetrennt. Die RNA-Proben wurden auf 2 % Polyacrylamid/0,5% Agarose-Gele in Puffer VI (Puffer VI: 40 mM Tris, 20 mM HaAcetat, 1 mM EDTA-:Na, mit Essigs~ure auf pH 7,2 eingestellt) aufgetragen. Puffer VI diente auch als Elektrophorese-Puffer. Die Laufzeit betrug 105 rain bei 3~ und konstantem Strom yon 5 mA/Gel. AnschlieBend wurde das Ext.260Profil der elektrophoretisch getrennten Nucleins~uren durch kontinuierliehe Messung des Gels in einem Gilford-Spectrophotometer aufgezeichnet.

Ergebnisse 1. Charakterisierung von S-30 a) Polysomen. Die Polysomen-Profile n~ch 0, 20 u n d 40 m i n Vori n k u b a t i o n y o n S-30 zeigten eine zeitproportionale A b n a h m e der Poly-

E i n in vitro Proteinsynthesesystem

161

A 0.5

0.3

0.1

0.5 E r o.3-

0.1"

os' 0.3

0.1

Ioden

Meniskus

Abb. 1. Polysomenprofile n~ch verschieden langer Vorinkubation yon S-30 und anschlieBender Fraktionierung im isokinetischen Saccharose-Gradienten. A. 0 min Vorinkubation (1,08 rag2); B. 20 rain Vorinkubation (0,19 mg~); C. 40 rain Vorinkubation (0,18 mg~) Ii

]?lanta (Berl.), Vol. 113

162

W.-S. Sim und D. Kliimbt

cl ul r

[A cell-free system of protein synthesis from maize seedlings].

An amino acid incorporating system has been prepared from maize seedlings, and it has been characterized with the aid of poly-U and a "mRNA enriched f...
818KB Sizes 2 Downloads 0 Views